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Methodenartikel

Störung der Blut-Hirn-Schranke der Maus durch kleine extrazelluläre Vesikel aus hypoxischen menschlichen Plazenta

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DOI:

10.3791/65867

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26. Januar 2024

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1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um zu evaluieren, ob kleine EVs (sEVs), die aus Plazenta-Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (ein Aspekt der Präeklampsie modellierend), die Blut-Hirn-Schranke bei nicht schwangeren erwachsenen weiblichen Mäusen stören.

Zusammenfassung

Zerebrovaskuläre Komplikationen, einschließlich Hirnödeme sowie ischämischer und hämorrhagischer Schlaganfall, sind die Hauptursache für die mütterliche Sterblichkeit im Zusammenhang mit Präeklampsie. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser zerebrovaskulären Komplikationen sind noch unklar. Sie werden jedoch mit Plazentafunktionsstörungen und einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) in Verbindung gebracht. Dennoch wird die Verbindung zwischen diesen beiden entfernten Organen noch ermittelt. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Plazenta Signalmoleküle, einschließlich extrazellulärer Vesikel, in den mütterlichen Kreislauf abgibt. Extrazelluläre Vesikel werden nach ihrer Größe kategorisiert, wobei kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm) sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritische Signalpartikel gelten. Bei der Präeklampsie kommt es zu einer erhöhten Anzahl zirkulierender sEVs im mütterlichen Kreislauf, deren Signalfunktion nicht gut verstanden ist. Plazenta-sEVs, die bei Präeklampsie oder aus einer normalen Schwangerschaftsplazenta freigesetzt werden, die einer Hypoxie ausgesetzt sind, induzieren eine endotheliale Dysfunktion des Gehirns und eine Störung der BHS. In diesem Protokoll untersuchen wir, ob sEVs, die aus plazentaren Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (die einen Aspekt der Präeklampsie modellieren), die BHS in vivo stören.

Einleitung

Etwa 70 % der mütterlichen Todesfälle aufgrund von Präeklampsie, einem hypertensiven Schwangerschaftssyndrom, das durch gestörte Plazentationsprozesse, mütterliche systemische endotheliale Dysfunktion und in schweren Fällen durch Multiorganversagen 1,2 gekennzeichnet ist, sind mit akuten zerebrovaskulären Komplikationen assoziiert 3,4. Die meisten Todesfälle von Müttern treten in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen auf5. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch trotz der klinischen und epidemiologischen Relevanz zerebrovaskulärer Komplikationen im Zusammenhang mit Präeklampsie noch unklar.

Auf der anderen Seite sind extrazelluläre Vesikel (EVs) (Durchmesser ~30-400 nm) essentielle Mediatoren der interzellulären Kommunikation zwischen Geweben und Organen, einschließlich der mütterlich-plazentaren Interaktion6. Zusätzlich zu Proteinen und Lipiden auf der äußeren Oberfläche transportieren EVs Fracht (Proteine, RNA und Lipide). EVs können in (1) Exosomen (Durchmesser ~50-150 nm, auch kleine EVs (sEVs) genannt), (2) mittlere/große EVs und (3) apoptotische Körper eingeteilt werden, die sich durch Größe, Biogenese, Inhalt und potenzielle Signalfunktion unterscheiden. Die Zusammensetzung von EVs wird durch die Zellen, aus denen sie stammen, und den Krankheitstyp7 bestimmt. Syncytiotrophoblasten-abgeleitete EVs exprimieren plazentare alkalische Phosphatase (PLAP)8,9, die Plazenta-abgeleitete zirkulierende kleine EVs (PDsEVs) in der Schwangerschaft nachweist. Außerdem hilft PLAP dabei, Veränderungen in der PDsEV-Fracht und deren Auswirkungen bei Präeklampsie im Vergleich zu normotensiven Schwangerschaften zu erkennen 10,11,12,13,14,15.

Die Plazenta wurde als notwendige Komponente in der Pathophysiologie der Präeklampsie16 oder der zerebralen Komplikationen im Zusammenhang mit dieser Erkrankung anerkannt 17,18,19. Es ist jedoch nicht bekannt, wie dieses entfernte Organ Veränderungen in der Gehirnzirkulation hervorrufen könnte. Da sEVs aufgrund ihrer Fähigkeit, bioaktive Komponenten von Spender- auf Empfängerzellen zu übertragen, eine zentrale Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation spielen 6,20,21, haben eine wachsende Anzahl von Studien plazentare sEVs mit der Entstehung von mütterlicher endothelialer Dysfunktion in Verbindung gebracht 21,22,23,24, einschließlich Gehirnendothelzellen 25,26bei Frauen mit Präeklampsie. Daher kann die Beeinträchtigung der Endothelfunktion des Gehirns zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) führen, einer kritischen Komponente bei zerebrovaskulären Komplikationen im Zusammenhang mit Präeklampsie 3,27.

Nichtsdestotrotz berichteten präklinische Befunde mit Hirngefäßen von Ratten, die dem Serum von Frauen mit Präeklampsie28 ausgesetzt waren, oder menschlichen Gehirnendothelzellen, die dem Plasma von Frauen mit Präeklampsie29 ausgesetzt waren, dass zirkulierende Faktoren eine Störung der BHS induzieren. Trotz mehrerer Kandidaten, die das Potenzial haben, die BHS zu schädigen, die während der Präeklampsie im mütterlichen Kreislauf vorhanden sind, wie z. B. erhöhte Spiegel von proinflammatorischen Zytokinen (d. h. Tumornekrosefaktor)18,28 oder vaskulären Regulatoren (d. h. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF))29,30,31 oder oxidativen Molekülen wie oxidierten Lipoproteinen (Oxo-LDL)32,33, unter anderem34stellt keine von ihnen eine direkte Verbindung zwischen der Plazenta und der BHS her. Kürzlich haben sEVs, die aus hypoxischen Plazenten isoliert wurden, gezeigt, dass sie die BHS bei nicht schwangeren weiblichen Mäusen störenkönnen 25. Da plazentare sEVs die meisten der aufgeführten zirkulierenden Faktoren mit der Fähigkeit tragen können, die BHS zu stören, gelten sEVs als geeignete Kandidaten, um die verletzte Plazenta zu verbinden, Träger schädlicher zirkulierender Faktoren zu sein und die BHS bei Präeklampsie zu stören.

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, zu untersuchen, ob sEVs, die aus Plazenta-Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, die BHS in nicht schwangeren weiblichen Mäusen stören können, um die Pathophysiologie von zerebralen Komplikationen während der Präeklampsie zu verstehen.

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Protokoll

Die Forschung wurde nach den in der Deklaration von Helsinki formulierten Prinzipien und mit Genehmigung der jeweiligen Ethik-Prüfungsausschüsse durchgeführt. Alle menschlichen Teilnehmer gaben vor der Probenentnahme ihre Einverständniserklärung, wie bereits berichtet25. Darüber hinaus hat die Kommission für Bioethik und Biosicherheit der Universität Bío-Bío dieses Projekt genehmigt (Fondecyt-Stipendium 1200250). Die Tierarbeit wurde in Übereinstimmung mit den Grundprinzipien der drei R's bei der Verwendung von Tieren in Versuchen35 und gemäß den Empfehlungen der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die vom US-amerikanischen National Institute of Health veröffentlicht wurden. Die Tiere wurden in einer geeigneten Umgebung im Vivarium der Universität Bío-Bío gehalten. Frische Plazenten (n = 4) wurden innerhalb von 1 h nach elektivem Kaiserschnitt von Müttern (im Alter von 28-31 Jahren) mit normaler Schwangerschaft (38 bis 41 Schwangerschaftswoche) gewonnen. Kaiserschnitte wurden im Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chile, durchgeführt, wie bereits berichtet25. Für die Anwendung des in vivo Modells wurden 4-6 Monate alte weibliche, nicht trächtige Mäuse (Stamm C57BLACK/6) verwendet. Sie wurden in drei experimentelle Gruppen eingeteilt: (1) Kontrolle (ohne Behandlung), (2) Behandlung mit sEVs aus Normoxie (sEVs-Nor) und (3) Behandlung mit sEVs aus hypoxisch kultivierter Plazenta (sEVs-Hyp), die zur Bewertung der Störung der BHS in vivoverwendet wurden 25. Alle injizierten Lösungen waren steril. Außerdem wurde die Herstellung von sEVs unter aseptischen Bedingungen und unter einer Biosicherheitshaube der Klasse II durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden.

1. Explantate der Plazentakultur

  1. Um Explantaten von normalen Schwangerschaftsplazenten zu extrahieren, überprüfen Sie die von Miller et al. 2005veröffentlichte Methode 36.
  2. Entfernen Sie die Gerinnsel vorsichtig mit einer sterilisierten Pinzette von der Basalplatte der menschlichen Plazenta. Extrahieren Sie kleine Explantate, um eine endgültige Gewebeextraktion von 10 g zu erhalten.
  3. Stellen Sie sicher, dass Plazenta-Explantaten aus den vier Quadranten des mütterlichen Teils der Plazenta entfernt werden. Stellen Sie sicher, dass devitalisiertes Gewebe und verkalkte Bereiche ausgeschlossen werden.
  4. Um Plazentagewebe zu manipulieren, tun Sie dies auf Eis, unter sterilen Bedingungen und in einer Biosicherheitswerkbank.
  5. Waschen Sie die Explantate (mindestens dreimal) mit reichlich (fünf Volumina der Explantate) kalter (4 °C) Phosphatpufferlösung (PBS 1x, pH 7,4), um so viel Blut wie möglich zu entfernen. Zentrifugieren (252 x g für 10 min) bei Raumtemperatur zwischen den Wäschen.
  6. Resuspendieren Sie 10 g gewaschene Explantate in 20 ml Kulturmedium, ergänzt mit 2 % fötalem Kälberserum, 100 IE/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (siehe Materialtabelle).
  7. Geben Sie die Suspension in eine 100-mm-Kulturschale. Lassen Sie die Explantate 2 h in einem Inkubator bei 37 °C mit 21 % Sauerstoff und 5 %CO2 stehen.
  8. Danach werden die Explantate mit 1x PBS bei 37 °C (dreimal) nachgewaschen. Zentrifugieren (252 x g für 10 min) bei Raumtemperatur zwischen den Wäschen.
  9. Ferner wird das Gewebe in 20 ml Kulturmedium, das zuvor von Nanopartikeln abgereichert war, resuspendiert.
    HINWEIS: Für die Abreicherung von Nanopartikeln führen Sie eine Ultrazentrifugation (120.000 x g für 18 Stunden bei Raumtemperatur) und eine Mikrofiltration (0,22-μm-Filter) durch.
  10. Die resuspendierten Explantaten werden in zwei Kulturschalen (100 mm) aufgeteilt. Jede Kulturschale muss 10 ml resuspendierte Explantaten enthalten.
  11. Danach wird eine der Schalen, die Plazentaexplantaten enthalten, unter Standardkulturbedingungen (37 °C mit 8 % Sauerstoff und 5 %CO2) gestellt, während die andere in eine hypoxische Kammer mit 1 %O2 gestellt wird.
    ANMERKUNG: (OPTIONAL) Die Analyse der Gewebeviabilität kann mit den gleichen Gewebeextraktionen und dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Assay (MTT-Assay) durchgeführt werden, wie an anderer Stelle37,38 beschrieben. Verwenden Sie die Gesamtproteinkonzentration, die in den Explantat-Homogenaten gemessen wird, um die MTT-Werte zu normalisieren.
  12. Nach 18 Stunden in Kultur wird das konditionierte Medium der Explantaten in ein neues 15-ml-Röhrchen geerntet.
    HINWEIS: In diesem Schritt können konditionierte Medien für einen längeren Zeitraum (Wochen) eingefroren werden (-80 °C).

2. Isolierung von Plazenta-abgeleiteten sEVs

  1. Isolierung von sEVs aus dem konditionierten Medium unter Verwendung des Differenzzentrifugations- und Mikrofiltrationsprotokolls gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten25,39.
  2. Führen Sie eine sequentielle Zentrifugation für das geerntete konditionierte Medium durch. Aufeinanderfolgende Schritte von Zentrifugationen sind (1) 300 x g für 10 min, (2) 2000 x g für 10 min, (3) 10.000 x g für 30 min und (4) 120.000 x g für 2 h. Führen Sie die Zentrifugationen bei Raumtemperatur durch.
  3. Bei all diesen Zentrifugationen wird mit einer 20-100-μl-Pipette der Überstand vorsichtig aufgefangen und das Pellet entsorgt.
  4. Anschließend wird der zuletzt gesammelte Überstand durch einen 0,22-μm-Filter geleitet (siehe Materialtabelle). Anschließend wird eine weitere Zentrifugation bei 120.000 x g für 18 h bei Raumtemperatur durchgeführt.
  5. Danach wird der Überstand verworfen, während das Pellet (das plazentare sEVs enthält) in 500 μl PBS (pH 7,4) resuspendiert und erneut durch einen 0,22-μm-Filter geleitet. Zum Schluss wird eine letzte Zentrifugation bei 120.000 x g für 3 h bei Raumtemperatur durchgeführt.
  6. Als nächstes wird das Pellet (das plazentare sEVs enthält) in 500 μl PBS (pH 7,4, zuvor ohne sEVs) resuspendiert und durch einen 0,22-μm-Filter geleitet.
  7. Kennzeichnen Sie die Proben als Bestand an sEVs-Normoxie (sEVs-Nor) oder sEVs-Hypoxie (sEVs-Hyp).
    HINWEIS: Bereiten Sie 50-100 μl Aliquots der isolierten sEVs für weitere Experimente vor. Kleine Elektrofahrzeuge können über einen längeren Zeitraum (Monate) bei -80 °C gelagert werden.
  8. Charakterisierung der plazentaren sEVs nach Größe, Anzahl und Proteinmarker der sEVs, wie bereits berichtet25. Der ideale mittlere Partikeldurchmesser von sEVs beträgt 50-150 nm.
    HINWEIS: Die Charakterisierung von sEVs umfasst den positiven Nachweis von CD63, Tsg101, Alix und HSP70 (d. h. zur Charakterisierung von sEVs, die mit Exosomen angereichert sind). Verwenden Sie PLAP auch als Marker für den plazentaren Ursprung25.
  9. Messen Sie die Gesamtmenge an Protein in der sEVs-Lösung mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die plazentare Explantatkultur und die Isolierung extrazellulärer Vesikel.

3. Mäuse-Injektion

  1. Betäuben Sie das Tier in einer Anästhesie-Induktionskammer mit 5% Isofluran-Verteilung (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie durch eine Zehenkneife.
  2. Nach ~40 s wird die Maus mit einer Gesichtsmaske in das Anästhesiesystem eingeführt und ein Anästhesieniveau von 2% Isofluran aufrechterhalten.
  3. Anschließend wird das Tier bei einer Raumtemperatur von 28 °C auf eine Heizplattform (siehe Materialtabelle) gestellt. Halten Sie die Augen mit künstlichen Tränen befeuchtet.
  4. Vor der Injektion werden plazentarare sEVs (200 μg Gesamtprotein) mit Phosphatpuffer (pH, 7,4) verdünnt, bis ein Endvolumen von 70 μl erreicht ist.
  5. Desinfizieren Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol und Wattestäbchen. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Insulinspritze mit einer 30-G-Nadel verwenden, um die sEVs-Lösung zu injizieren.
    HINWEIS: Die Spritze kann 5 Minuten lang auf der Heizplattform positioniert werden, um eine physiologische Temperatur zu erreichen.
  6. Injizieren Sie dann die Lösung in die Vena jugularis externa. Dieser Schritt erfordert ein spezielles Training.
    HINWEIS: Das Verfahren muss vorsichtig durchgeführt werden, indem die Nadel langsam zurückgezogen und vorsichtig abgesaugt wird, um Anzeichen von Blutreflux zu erkennen.
  7. Üben Sie nach der Injektion ~15 s lang mit einem trockenen Wattestäbchen leichten Druck auf die injizierte Stelle aus. Danach bringen Sie die Tiere in ihre jeweiligen Käfige zurück.
  8. Stellen Sie sicher, dass Sie Bewusstsein und Verhalten 15 Minuten lang bewerten. Ein Indikator für das Erreichen des Bewusstseins ist die Wiederherstellung der gesamten motorischen Aktivität des Tieres.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Temperatur in den Käfigen der Tiere warm gehalten wird.

4. Schnelles murines Koma und Verhaltensskala (RMCBS)

  1. Verwenden Sie das RMCBS, um die neurologischen Parameter und die Parameter des Wohlbefindens der Tierezu bewerten 40.
    HINWEIS: RMCBS ermöglicht eine schnelle Auswertung (~ 3 min) mit minimalem Tierstress durch Bedienereingriffe. RMCBS hat zehn Parameter (jeder Wert ist 0-2).
  2. Bewerten Sie das Wohlbefinden der Maus mit der RMCBS-Skala bei 0 h (vor der Injektion von sEVs) und 3 h, 6 h, 12 h und 24 h nach der Injektion.
    HINWEIS: Führen Sie eine Analyse von Claudin-5 (6 Stunden nach der Injektion von sEVs) und der blauen Extravasation von Evan (24 Stunden nach der Injektion von sEVs) durch, um die Störung der BHS zu bewerten (Abbildung 2).

5. Analyse von Evans blauer Extravasation

  1. Nach der Injektion von plazentaren sEVs (24 h) werden die Mäuse wie in Schritt 3.1 beschrieben anästhesiert.
  2. Bereiten Sie Evan's Blue-Lösung (2 %, 1x in Phosphatpufferlösung verdünnt) vor (siehe Materialtabelle).
  3. Injizieren Sie mit retroorbitalem Zugang25 Evans blaue Lösung in einer Konzentration von 2 ml/kg.
  4. Lassen Sie Evans blaue Lösung 20 Minuten lang unter Narkose zirkulieren.
  5. Als nächstes führen Sie eine intrakardiale Perfusion gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll41 mit Kochsalzlösung (~3 ml, 0,9 %, w/v) durch, um Evans blauen Farbstoff aus dem Kreislauf zu entfernen. Dieser Schritt ist obligatorisch.
    HINWEIS: Erhöhen Sie für dieses Verfahren die Anästhesie auf 5 % und überprüfen Sie eine tiefe Anästhesieebene (d. h. eine drastische Verringerung der Atemfrequenz).
  6. Freilegen des Herzens mittels medialer Thorakotomie41 (Abbildung 3).
  7. Danach wird das ganze Tier mit einer intrakardialen Infusion von Paraformaldehydlösung (4% in PBS, v/v) fixiert.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Steifigkeit des Schwanzes, um die richtige Fixierung zu überwachen.
  8. Sobald die Fixierung abgeschlossen ist, wird das Gehirn vorsichtig entnommen, gewogen und fotografiert41. Machen Sie Fotos mit dem gesamten Gehirn in der Nähe eines Lineals42.
  9. Als nächstes legst du das Gehirn in einen Gehirn-Maus-Slicer (siehe Materialtabelle).
  10. Das Gehirn wird in neun Abschnitte unterteilt, kranich-kaudal, einschließlich des Kleinhirns (100 μm pro Abschnitt).
  11. Nach der Präparation werden die Hirnschnitte in einem Stereo-Zoom-Mikroskop visualisiert und aufgenommen (siehe Materialtabelle).
  12. Verwenden Sie die aufgenommenen Bilder, um Evans blaue Extravasation mit der ImageJ-Software zu quantifizieren (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Um das Vorhandensein von Evans blauem Farbstoff zu analysieren, stellen Sie Evans blaue Werte mit einer Positivkontrolle des Gehirnschnitts ein (von einem tierischen Kontrolltier, dem Farbstoff injiziert wurde, aber ohne intrakardiale Perfusion). Evans Blauwerte, die aus der Positivkontrolle erreicht werden, liegen im Intensitätshistogramm des blauen Kanals im Allgemeinen zwischen 75 und 110 (Abbildung 4).
  13. Stellen Sie sicher, dass Gehirnbilder von der jeweiligen Versuchsgruppe blind analysiert werden, um eine Verzerrung des Beobachters zu vermeiden. Alternativ können Sie Evans blaue Extravasation durch Homogenisierung des Gehirns mit anschließender Spektroskopiequantifizieren 43.
    HINWEIS: In separaten Experimenten mit frisch isolierten Gehirnen von sEVs-injizierten Mäusen (6 h) werden die Proteinspiegel von Claudin 5 (CLND-5) analysiert (siehe Materialtabelle), einer kritischen Tight Junction, die an der Dichtheit der BHS44 beteiligt ist (Abbildung 5).

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Ergebnisse

Dieses Protokoll bewertet die Fähigkeit von sEVs, die aus Plazenten gewonnen werden, die in Hypoxie kultiviert wurden, die BHS bei nicht schwangeren Mäusen zu stören. Diese Methode ermöglicht es, die mögliche Verbindung zwischen der Plazenta und dem Gehirn unter normalen und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Insbesondere kann diese Methode einen Proxy für die Analyse der Beteiligung von plazentaren sEVs am Auftreten von zerebralen Komplikationen bei Präeklampsie darstellen.

Im Ge...

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Diskussion

Diese Studie enthüllt neue Erkenntnisse über mögliche Schäden, die sich aus Plazenta-Explantaten isolieren, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, auf die Störung der Blut-Hirn-Schranke von Nagetieren ergeben. Der pathologische Mechanismus beinhaltet eine Reduktion von CLND-5 in der hinteren Hirnregion25.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Plasma-sEVs von Personen mit Präeklampsie eine endotheliale Dysfunktion in verschiedenen Organen unter Verwend...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

Die Autoren danken den Forscherinnen und Forschern von GRIVAS Health für ihren wertvollen Input. Auch Hebammen und klinisches Personal des Geburtshilfe- und Gynäkologiedienstes gehören zum Hospital de Chillan, Chile. Gegründet von Fondecyt Regular 1200250.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Erwachsene Mäuse Gehirn Slecer Matrice 3D gedrucktOpen Access DateiErwachsene MäuseMäuse Gehirn Slicer. Gedruckt in PLA-Filament.
Anti-β-Aktin-PrimärantikörperSigma-AldrichClon AC-74Antikörper zur Loading-Kontrolle (Western-Blot)
Anti-Claudin5-PrimärantikörperSanta Cruz Biotechnologysc-374221Primärer Antikörper gegen das Tight-Junction-Protein CLDN5 von Mäusen BBB (Western-Blot)
BCA-Protein-KitThermo Scientific23225Kit zur Messung der Proteinkonzentration
Nährmedien #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500Nährmedien für Plazenta-Explantate
D180 CO2-InkubatorRWD Life scienceD180Standard-Inkubator zur Estabilisierung von Explantaten und Kultur-sEVs-Nor
Evans blauer Farbstoff & > 75% 10 gSigma-AldrichE2129.10GFarbstoff zur Analyse der Störung der Blut-Hirn-Schranke IN VIVO
Fötales Rinderserum 500 mLThermo FisherScientific 16000044Additiver Wachstumsfaktor für Nährmedien 200
Himac Ultrazentrifuge CP100NXHimac Eppendorf Gruppe5720410101 Ultrazentrifuge für kondizierte Medien > 1.20.000 x g
ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isofluran x 100 mLUSP Baxter212-094Flüchtiges inhalatives Anästhesiemittel für Mäuse
Kit CellTiter 96 Nicht radioaktivPromega0000105232In vitro Assay für Plazenta-Explantate
IgG-Sekundärantikörper ThermoFisher ScientificMO 63103Sekundärantikörper für CLDN5 (Western Blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Nanotracking-Analyse von Partikeln aus Plazenta-Explantaten Kondizierte Medien
Paraformaldehide E 97% Lösung 500 mLThermo Fisher ScientificA11313.22Fixierlösung für Hirngewebeschnitte und intrakardiale Perfusion (einmal verdünnt)
PBS 1 X pH 7,4 500 mLThermo Fisher Scientific10010023Waschlösung für Plazenta-Explantate
Penicilin-Streptomicin 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antiobiotika für Plazenta-Explantate Nährmedien
ProOX C21 Zytozentrischer O2 und CO2 UnterkammerreglerBioSpherixSCR_021131CO2Regler zur Induktion von Hypoxie in versiegelter Kammer für sEVs-Hyp
Natrium Thiopental 1 gChemie7061humanitäres Euthanasiemittel
Somnosuite Low-Flow-AnästhesiesystemKent ScientificsSS-01Isofluran-Verdampfer für kleine Nagetiere
Chirurgische ErwärmungsplattformKent ScientificsA41166Erwärmungsplattform für die Erhaltungsanästhesie bei Mäusen
Spritzenvorsatzfilter, Polytetrafluorethylen (PTFE), hydrophob, 0,22 &; Mikro; m, steril, 25 mmSouthern Labware10026Filtration von kondizierten Medien aus Plazenta-Explantaten 
Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifugen auf dem Tisch  HITACHI himac CT15E/CT15REHitachi medical systems6020Serielle Zentrifugationen von kondizierten Medien < 1,20, 000 x g
Trinokulares Stereomikroskop transmidiertes und reflektierendes Licht 10x-160x Center Medical2597Stereomikroskop zur Registrierung von Hirnschnitten
Erwachsene

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