Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Astrozyten und Mikroglia sind vielseitige Gliazellen, die eine wichtige Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS) spielen und Aufgaben wie die Regulierung der neuronalen Funktion, den Beitrag zur Entwicklung des ZNS, die Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke und die Beteiligung an anderen kritischen Prozessen übernehmen 1,2,3,4 . Neben ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen diese Gliazellen auch eine zentrale Rolle bei Verletzungs- und Reparaturmechanismen. Mikroglia sind bekannt für ihre phagozytären, entzündlichen und migrierenden Fähigkeiten nach Beleidigungen oder Verletzungen ^5,6,7. Die Reaktionen von Astrozyten auf Krankheiten sind ebenso vielfältig und umfassen Beiträge zu Entzündungen, zur Bildung von Glianarben und zur Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke ^8,9. Obwohl unser Verständnis der schädlichen und reparierenden Rolle von Mikroglia und Astrozyten im ZNS gewachsen ist, erfordert die inhärente Heterogenität sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer Funktion robuste Werkzeuge, um sie in verschiedenen Kontexten zu untersuchen.

Um weitere Einblicke in die Rolle von Mikroglia und Astrozyten in Gesundheit und Krankheit zu gewinnen, ist ein kombinierter Ansatz von In-vivo - und In-vitro-Untersuchungen erforderlich. In-vivo-Techniken nutzen die komplizierte Kommunikation zwischen Gliazellen und Neuronen innerhalb des ZNS, während sich In-vitro-Methoden als wertvoll erweisen, wenn es darum geht, Einzelzellfunktionen oder -reaktionen unter bestimmten Stimuli zu beurteilen. Jede Methode bietet einzigartige Vorteile; In-vitro-Studien sind unerlässlich, um die spezifischen Rollen dieser Zelltypen ohne direkten oder indirekten Input von benachbarten Zellen zu verstehen. Darüber hinaus bieten In-vitro-Assays mit unsterblichen Zelllinien bestimmte Vorteile, darunter die Fähigkeit, sich unbegrenzt zu vermehren, Kosteneffizienz und einfache Wartung. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Primärzellen im Vergleich zu Zelllinien normale physiologische Reaktionen besser nachahmen. Diese physiologische Relevanz ist bei funktionellen Assays und transkriptomischen Analysen von entscheidender Bedeutung.

Eine der Herausforderungen bei der Gewinnung von Primärzellen, insbesondere aus dem Rückenmark adulter Mäuse, liegt in der Menge und Lebensfähigkeit der Proben. Das Rückenmark von Erwachsenen ist kleiner als das Gehirn und enthält eine beträchtliche Menge an Myelin und stellt einzigartige Schwierigkeiten dar. Es gibt zwar mehrere veröffentlichte Protokolle, die die Isolierung reiner, lebensfähiger Gliazellen aus neugeborenen Tieren oder dem erwachsenen Mäusegehirn beschreiben 10,11,12,13, aber diese Methoden sind möglicherweise nicht für die Untersuchung von Erkrankungen und Verletzungen geeignet, die spezifisch für das Rückenmark sind. In diesem Protokoll bieten wir ein umfassendes Verfahren zur effizienten Isolierung reiner, lebensfähiger Mikroglia und Astrozyten aus dem Rückenmark der adulten Maus an, was nachgelagerte Anwendungen in Zellkulturen und transkriptomischen Analysen erleichtert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um diese Zellen aus erwachsenen Mäusen im Alter von 10 Wochen bis 5 Monaten zu isolieren, was seine Nützlichkeit in verschiedenen Kontexten unter Beweis stellte, einschließlich Studien mit konditionalen Knockout-Mäusen, Arzneimittelreaktionen, Entwicklungsforschung und altersbezogenen Modellen.

Alle Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden nach Genehmigung des Animal Care and Use Committee an der George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Für die Studie wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse (WT) im Alter von 10 Wochen bis 5 Monaten verwendet, die von einem kommerziellen Lieferanten bezogen wurden (siehe Materialtabelle) und an der George Washington University untergebracht waren. Eine Übersicht über den Protokollworkflow ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung des Rückenmarks

1. Betäuben Sie die Tiere mit Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-Tribromethanol und 2,5 % 2-Methyl-2-Butanol in sterilem Wasser) (siehe Materialtabelle). Bestätigen Sie das Fehlen einer Reaktion auf Zehen- und Schwanzkneifen bei den Mäusen.
2. Führen Sie eine Herzperfusion mit kalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco durch, um mononukleäre Zellen des peripheren Blutes zu entfernen.
   1. Legen Sie das Tier auf ein flaches Tablett und machen Sie einen seitlichen Einschnitt, um die Pleurahöhle freizulegen. Führen Sie eine 23-G-Perfusionsnadel, die an eine Peristaltikpumpe angeschlossen ist (siehe Materialtabelle), in die linke Herzkammer ein und aktivieren Sie die Pumpe. Sobald kaltes DPBS durch das Herz fließt, machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof.
      HINWEIS: In diesem Schritt wird eine schnellere Perfusionsrate bevorzugt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Das Blut sollte in weniger als 1 Minute ausgeschwemmt werden. Die Reinigung der Leber deutet auf eine erfolgreiche Durchblutung hin.
3. Enthaupten Sie das Tier mit einer großen Schere und entfernen Sie die Wirbelsäule¹⁴. Tauchen Sie es in kalte 1x DPBS mit Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% Glukose in einer Petrischale auf Eis zum Spülen des Gewebes.
4. Stellen Sie ab sofort sicher, dass alle Schritte in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden. Verwenden Sie die hydraulische Extrusion¹⁴ , um das gesamte Rückenmark zu isolieren. Verwenden Sie eine 18-G-Nadel und eine 10-ml-Spritze, die mit kaltem 1x DPBS mit Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% Glukose gefüllt ist. Übertragen Sie das Rückenmark in eine Petrischale, die auf Eisbeutel gestellt wird, die ausreichend kaltes 1x DPBS mit Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% Glukose enthält, um das gesamte Gewebe einzutauchen.
5. Entfernen Sie die Hirnhäute vorsichtig unter dem Mikroskop in einer Laminar-Flow-Haube. Übertragen Sie das Rückenmark in eine leere Petrischale auf Eisbeuteln und schneiden Sie mit einem chirurgischen Skalpell Nr. 10 das gesamte Rückenmark in 2-3 mm große Abschnitte.

2. Enzymatische Zelldissoziation

1. Fügen Sie Enzymmischung 1 und Enzymmischung 2 aus dem im Handel erhältlichen Gehirndissoziationskit für Erwachsene gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzu (siehe Materialtabelle). Schwenken Sie die Enzyme in der Schale mehrmals, um eine gleichmäßige Beschichtung des Rückenmarks zu gewährleisten, und inkubieren Sie dann bei 37 °C für 30 Minuten. Alle 5 Minuten die Schale vorsichtig schwenken, um ein Verklumpen des Gewebes zu verhindern und eine gleichmäßige Verteilung der Reagenzien zu ermöglichen.
2. Nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator und fügen Sie 350 μl 0,46 mg/ml DNAse I in Minimal Essential Medium (MEM) hinzu (siehe Materialtabelle). Durch leichtes Schwenken mischen.
3. Fügen Sie 1 ml kaltes DMEM/0,5 % fötales Kälberserum (FBS) hinzu und mischen Sie es vorsichtig durcheinander. Den gesamten Inhalt sofort in ein 5-ml-Röhrchen umfüllen.

3. Mechanische Zelldissoziation

1. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Gewebe dreimal vorsichtig zu verreiben, und stellen Sie sicher, dass jedes Mal Gewebestücke gezogen werden, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Dann mit einer verschlossenen 9-Zoll-Glas-Pasteurpipette fünf weitere Male vorsichtig verreiben, um sicherzustellen, dass während des Prozesses keine Blasen entstehen.
2. Platzieren Sie das 5-ml-Röhrchen aufrecht und lassen Sie das Gewebe 30 s lang am Boden absetzen. Sobald sich das Gewebe abgesetzt hat, ziehen Sie den Überstand mit einer P1000-Pipette auf und führen Sie ihn durch einen 30-μm-Filter in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
3. In dasselbe 5-ml-Röhrchen mit dem restlichen Gewebe geben Sie 1 ml kaltes DMEM/0,5 % FBS. Mit einer Pasteurpipette dreimal vorsichtig verreiben.
4. Lassen Sie das Gewebe 30 s lang am Boden absetzen, dann führen Sie den Überstand durch einen 30-μm-Filter und sammeln Sie ihn in demselben 15-ml-Röhrchen wie zuvor. Wiederholen Sie Schritt 3.3 und Schritt 3.4 noch einmal.
5. Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Entfernen und entsorgen Sie den entstandenen Überstand vorsichtig mit einem Vakuumsauger.

4. Myelinentfernung

1. Entfernen Sie das Myelin mit der Lösung zur Entfernung von Ablagerungen (DRS), die im Gehirndissoziationskit für Erwachsene enthalten ist, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Nach der Entfernung von Ablagerungen 5 ml kaltes DMEM/0,5 % FBS in das Zellpellet geben und das Röhrchen dreimal vorsichtig umdrehen. Die Zellsuspension wird bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
   HINWEIS: Wenn die Zellen für In-vitro-Studien verwendet werden und in Kultur verbleiben, sollte stattdessen vorgewärmtes DMEM/0,5% FBS verwendet werden.
2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DPBS/0,5 % FBS (kalt für RNA-Studien und warm für In-vitro-Assays ). Zählen Sie die Zellen und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau.
   HINWEIS: Zellsuspensionen von mehreren Tieren können kombiniert werden, um die Zellkonzentration zu erhöhen.
3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von DPBS/0,5 % FBS bis zu einem Gesamtvolumen von 5 ml. Die Suspension wird bei 300 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette verworfen.

5. Isolierung von Mikroglia und Astrozyten

1. Markieren Sie die Zellen mit Anti-CD11b- oder Anti-ACSA-2-Mikrokügelchen gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).
2. Sortieren Sie die Zellen durch Positivselektion anhand der MS-Spalten gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Nach dem Sortieren zentrifugieren Sie die sortierten Zellen bei 300 x g für 10 min und verwerfen den Überstand.

6. Plattieren von Zellen für In-vitro-Assays

HINWEIS: Wenn die Zellen nicht plattiert werden und sofort für die RNA-Analyse verwendet werden, fahren Sie mit Schritt 8 fort.

1. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml warmem DMEM/0,5% FBS. Zählen Sie die Zellen und beurteilen Sie ihre Lebensfähigkeit mit einem Hämazytometer (siehe Materialtabelle).
2. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 75.000 Zellen pro 50 μl ein. Geben Sie 50 μl der Zellsuspension in jedes mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckglas¹¹ in einer 24-Well-Platte.
3. Bei 37 °C 2 h inkubieren, damit die Zellen am Deckglas haften können.
4. Geben Sie vorsichtig 450 μl warmes DMEM/5% FBS/Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken, siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung.
5. Ersetzen Sie nach 3 Tagen die Hälfte des Mediums durch 250 μl warmes DMEM/5% FBS/Pen-Streptokokken. Ersetzen Sie das Medium zur Wartung alle 4-5 Tage vollständig durch 500 μl warmes DMEM/5% FBS/Pen-Streptokokken.

7. Immunhistochemie

HINWEIS: Es ist am besten, immunhistochemische Analysen nach mindestens 3 Tagen durchzuführen, wenn das Medium mindestens einmal ausgetauscht wurde. Dadurch wird sichergestellt, dass Schmutz entfernt wurde und die Zellen vollständig am Deckglas haften.

1. Entfernen Sie das Medium und markieren Sie die Zellen mit Anti-Maus-mAb O4 (1:100) (siehe Materialtabelle) in warmem DMEM/5 % FBS/10 % normalem Ziegenserum (NGS) für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) oder bei 37 °C.
   HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 7.3 fort, wenn die Zellen nicht mit O4 beschriftet werden.
2. Spülen Sie die Deckgläser vorsichtig ab, indem Sie sie dreimal in warmes DMEM/5% FBS tauchen. Ziegen-Anti-Maus-594 IgM (1:300) (siehe Materialtabelle) in warmem DMEM/5% FBS/10% NGS zugeben und bei RT für 15 min im Dunkeln inkubieren. Dreimal vorsichtig mit warmem DMEM/5% FBS abspülen.
3. Die Zellen werden mit kalter 5%iger Essigsäure/Methanol für 15 min bei 4 °C fixiert. Dreimal mit 1x PBS waschen und dann mit dem entsprechenden Antikörper markieren: Anti-Kaninchen-GFAP (1:500), Anti-Maus-GFAP (1:500) oder Anti-Kaninchen-Iba1 (1:500) in 1 % Triton-X100/10 % NGS in 1x DPBS (siehe Materialtabelle). 1 Stunde bei RT inkubieren.
   HINWEIS: Bewahren Sie Deckgläser im Dunkeln auf, wenn sie bereits mit O4 gefärbt wurden.
4. Dreimal vorsichtig mit PBS abspülen. Markierung mit dem entsprechenden Sekundärantikörper: Anti-Maus 594 IgG (1:500), Anti-Kaninchen 488 IgG (1: 500) (siehe Materialtabelle). 30 Minuten bei RT im Dunkeln inkubieren.
5. Dreimal vorsichtig mit PBS abspülen. Mit DAPI (1:1000) 1 Minute bei RT gegenfärben. Dreimal mit PBS spülen, Eindeckmittel hinzufügen (siehe Materialtabelle) und Deckgläser auf Objektträger montieren.

8. RNA-Extraktion

HINWEIS: Im Idealfall sollten mindestens 100.000 Zellen vorhanden sein, um genügend RNA für die Analyse zu extrahieren. Bei Bedarf können Zellen aus 2-3 Rückenmarks kombiniert werden.

1. Extrahieren Sie RNA mit einem handelsüblichen RNA-Isolationskit gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Zellen für jeden Waschschritt mit dem im Kit enthaltenen RW1-Waschpuffer weitere 2 Minuten im Waschpuffer.
2. Entfernen Sie die verbleibende genomische DNA mit DNase I gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). 15 Minuten lang mit DNase bei RT inkubieren, dann mit RW1-Puffer waschen.
3. Um die RNA-Ausbeute zu erhöhen, werden die Proben vor der Elution 10 Minuten lang in RNAse-freiem Wasser bei RT inkubiert. Beurteilen Sie die RNA-Integrität und -Menge mit einem Bioanalysator¹⁵ (siehe Materialtabelle).

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ermöglichen die Isolierung reiner und lebensfähiger Mikroglia und Astrozyten aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtern verschiedene nachgelagerte Anwendungen, einschließlich funktioneller oder histologischer In-vitro-Assays und RNA-Analysen.

Eine erfolgreiche Isolierung für In-vitro-Studien führt zu einer kontinuierlichen Zellproliferation über mehrere Tage. Adulte Zellen weisen im Vergleich zu Zellen, die von neugeborenen Tieren isoliert wurden, eine langsamere Proliferationsrate auf, und in den ersten Tagen können einige Trümmer vorhanden sein. Nach 4 Tagen in vitro (DIV) sollten die Zellen weitgehend frei von Ablagerungen sein, wobei die meisten Zellen am Kolbenboden haften. Astrozyten beginnen, längere Fortsätze zu bilden, während Mikroglia eine ovale Form mit kürzeren Spindeln annehmen (Abbildung 2). Bis 7 DIV sollten Astrozyten eine zusammenhängende konfluente Schicht bilden, und Mikroglia sollten weniger und kürzere Fortsätze aufweisen (Abbildung 3).

Die Reinheit kann durch doppelte Markierung von ACSA2-sortierten Zellen mit GFAP und O4 zur Beurteilung der Oligodendrozytenkontamination in Astrozytenkulturen und CD11b-sortierten Zellen mit Iba1 und GFAP zur Bewertung der Astrozytenkontamination in Mikrogliakulturen bestätigt werden (Tabelle 1).

Ein erfolgreiches Protokoll liefert auch qualitativ hochwertige RNA mit minimalem Abbau und ausreichender Menge (Abbildung 4A). Elektropherogramme von RNA, die aus isolierten Zellen extrahiert wurden, sollten markante 18S- und 28S-Peaks aufweisen. Eine Überdissoziation von Zellen oder eine längere Zeit zwischen Perfusion und Zellsortierung kann zu einem RNA-Abbau führen (Abbildung 4B). Eine unzureichende enzymatische und/oder mechanische Dissoziation oder eine unzureichende Myelinentfernung kann zu einer verminderten Zellausbeute und RNA führen (Abbildung 4C). Isolierte Astrozyten können sequenziert werden, um Entzündungsmarker zu identifizieren. Der Vergleich gesunder Astrozyten mit entzündungsaktivierten Astrozyten (z. B. von einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Tier) zeigt relative Hemmungen von Entzündungswegen bei gesunden und entzündlichen Astrozyten (Abbildung 4D).

Abbildung 1: Überblick über die Rückenmarkspräparation, die Gewebedissoziation und die Zellsortierung. Die Abbildung gibt einen Überblick über den Prozess der Rückenmarkspräparation, einschließlich der Gewebedissoziation und der Zellsortierung. Nach der Rückenmarksdissektion kommt es zu einer enzymatischen und mechanischen Dissoziation des Gewebes. Myelin wird entfernt und die Zellen werden mit Anti-ACSA2- oder Anti-CD11b-Antikörpern markiert, um Astrozyten und Mikroglia anzugreifen. Die sortierten Zellen können dann für Zellkulturen und RNA-Analysen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Phasenkontrastaufnahmen von Astrozyten und Mikroglia nach 4 Tagen in vitro (4DIV). (A) Zeigt ein repräsentatives Beispiel von ACSA2+-sortierten Zellen mit verlängerten Fortsätzen. (B) CD11b+-Zellen weisen ovale Zellkörper und kurze Fortsätze auf. Maßstabsbalken = 50 μm. Diese Abbildung wurde von Ahn, J. J. et al.16 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Fluoreszenzbilder von Astrozyten und Mikroglia nach 8 Tagen in vitro (8DIV). (A) ACSA2+-Zellen, die mit GFAP (grün) und O4 (rot) markiert sind, zeigen eine minimale O4-Färbung und bilden eine zusammenhängende konfluierende Schicht von Astrozyten. (B) CD11b+-Zellen, die mit Iba1 (grün) und GFAP (rot) markiert sind, zeigen ein minimales Vorhandensein von GFAP. Maßstabsbalken = 50 μm. Diese Abbildung wurde von Ahn, J. J. et al.16 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Elektropherogramme von RNA-Proben. (A) Nach einer erfolgreichen Zellisolierung wird eine hohe Ausbeute und qualitativ hochwertige RNA erwartet. (B) Geringe Ausbeute, minderwertige RNA oder (C) geringe Ausbeute, hohe Qualität RNA kann in Fällen von Zelltod, unzureichender Dissoziation oder unzureichender Trümmerentfernung erwartet werden. (D) Die RNA-Sequenzierungsanalyse ausgewählter Entzündungswege in gesunden Astrozyten im Vergleich zu entzündlichen Astrozyten zeigt eine relative Hemmung der Entzündung in sortierten gesunden Astrozyten im Vergleich zu entzündlichen Astrozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zellausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit nach Sortierung für ACSA-2- und CD11b-Zellen. Diese Tabelle ist eine Adaption von Ahn, J. J. et al.16.

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