Optimierung des ligaturinduzierten Parodontitis-Mausmodells für präklinische Forschung

Zusammenfassung

Das ligaturinduzierte Parodontitis-Mausmodell ist ein effektives und zunehmend beliebtes Werkzeug zur Untersuchung von Parodontalerkrankungen. Es werden detaillierte Leitlinien zur Implementierung einer vereinfachten Version des Modells präsentiert, die sich auf die Zerstörung des interproximalen alveolären Knochens konzentriert, einschließlich Laborstudiendesign, 3D-gedruckter Werkzeugproduktion und Knochenquantifizierung mittels μCT-Analyse.

Zusammenfassung

Das experimentelle Modell der ligaturinduzierten Parodontitis bei Mäusen hat eine grundlegende Rolle beim Verständnis der Parodontalerkrankung gespielt; Dennoch wurde sie nicht vollständig für translationale und therapeutische Anwendungen genutzt. Ähnlich wie bei menschlichen Krankheiten entwickelt sich die durch Ligaturen induzierte Parodontitis bei Mäusen durch eine Reihe unterschiedlicher mikrobieller, entzündlicher und osteoimmunologischer Ereignisse. Die durch Ligaturen induzierte Zerstörung des alveolären Knochens schreitet in relativ kurzer Zeit fort und ist leicht quantifizierbar, was sie zu einem kosteneffizienten Krankheitsmodell für präklinische Studien macht.

Um die technische Herausforderung des klassischen Ligaturmodells zu meistern, wurde das vereinfachte, ligaturinduzierte Parodontitis-Mausmodell eingeführt. Anstatt eine Erkrankung im gesamten Umfang zweier benachbarter Zähne auszulösen, konzentriert sich das vereinfachte Krankheitsmodell auf entzündliche Knochenzerstörung nur im interproximalen Bereich der beiden hinteren Zähne, was auch der Bereich ist, den die häufige Parodontalerkrankung beim Menschen auslöst. Da dreidimensionale (3D)-gedruckte Werkzeuge zur Ligaturplatzierung verwendet werden, ist der Ansatz schnell und effektiv, was zu einer Prozedurzeit von 5–10 Minuten pro Maus führt. Während osteoklasogene Signalübertragungen nach 3 Tagen Ligatureinsetzen nachgewiesen werden, entwickelt sich 9 Tage nach der Ligatur regelmäßig eine Knochenabschädigung.

Hier wird das vereinfachte Ligaturmodellprotokoll durch die hervorgehobenen wichtigen Elemente, die spezifisch für das Studiendesign sind (z. B. Leistungsberechnung, Verfahrensstandardisierung, Kalibrierung), Entwicklung der 3D-gedruckten Werkzeuge (z. B. das "Maus-Zahnbett" und "Ligaturhalter") sowie die Quantifizierung des Alveolarknochens mittels μCT-Analyse. Die gingivale Genexpression von Rank, Rankl und Opg, einer Master-Regulationstriade der Osteoklastogenese, wird als indirekter Beleg für die therapeutische Wirksamkeit verwendet. Die in diesem Artikel vorgestellten Methoden werden die Umsetzung des vereinfachten, ligaturinduzierten Parodontitis-Modells durch die Forscher leiten, um innovative parodontale Therapien im präklinischen Kontext zu testen.

Einleitung

Parodontale Erkrankung ist ein komplexer entzündlicher Prozess, der zur Zerstörung von Zahnstützstrukturen wie dem Zahnfleisch, dem Parodontalband, dem Zement und dem Alveolarknochen führt. Damit sich parodontaler Knochenverlust entwickeln kann, müssen zusätzlich zur Rekrutierung von Entzündungszellen und dem Übergang von einer angeborenen zu einer angeboren dominierten zu einer erworbenen dominierten Immunantwort¹ stattfinden. Das endgültige Ungleichgewicht zwischen Osteoblasten und Osteoklasten führt zu einem Verlust des Alveolarknochens durch deren Zerstörung². Der charakteristische phänotypische Befund, der die Diagnose der Parodontalerkrankung von reversibler gingivaler Entzündung (Gingivitis) unterscheidet, ist der Verlust des Alveolarknochens. Daher ist die Menge an zahnstützendem Alveolarknochen ein zentrales therapeutisches Ergebnis im präklinischen Umfeld.

Kein einzelnes Tiermodell kann alle biologischen Aspekte replizieren, die für die Entwicklung verschiedener Therapeutika erforderlich sind ^3,4,5. Das ligatur-induzierte Parodontitis-Mausmodell entwickelt eine quantifizierbare Knochenzerstörung in relativ kurzer Zeit (3–9 Tage)^5, was dieses Modell kosteneffizient macht, um neuartige therapeutische Interventionen zur Prävention und Modulation von Parodontitis zu testen. Trotz ihres Erfolgs bei der Entwicklung der Phase-II-III-Studien am Menschen 6,7,8,9,10 wird die ligaturinduzierte Parodontitis bei Mäusen nicht häufig als präklinisches Modell verwendet. Um die technischen Herausforderungen des klassischen Modells, bei dem die Ligatur den Zahn umgibt, zu meistern, wurde das vereinfachte, ligaturinduzierte Parodontitis-Mausmodell^11,12 eingeführt. Die einfache Modifikation des klassischen Modells konzentriert sich auf eine fokussierte Knochenabbaustelle, zwischen und nicht um die Zähne. Die Vorteile dieser Modifikation sind vielfältig, darunter eine kürzere Zeit, die für 1) die Personalausbildung, 2) die technische Einfachheit des experimentellen Verfahrens und 3) die Reproduzierbarkeit der Knochenquantifizierung benötigt wird. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass mehrere mikrobiologische und immunologische Ereignisse, die sich unter diesem vereinfachten Modell entwickeln und sich manifestieren, mit dem aktuellen Verständnis der häufigen menschlichen Parodontalerkrankung 2,11,12,13 übereinstimmen. Schließlich unterstützt die zuvor von US ^2,14 berichtete wirksame medikamenteninduzierte Prävention von Knochenverlust die Verwendung des vereinfachten, ligatur-induzierten Parodontitis-Modells als in-vivo-Werkzeug zur Bewertung zentraler Aspekte neuartiger parodontaler Therapien.

Ein innovativer Aspekt des vereinfachten Ligatur-induzierten Parodontitis-Modells ist die Entwicklung von 3D-gedruckten Werkzeugen, um den Krankheitseinführungsprozess^{leichter zu erleichtern 11,12}. Obwohl es für manche intuitiv ist, berichteten Forscher von einer Unfähigkeit, die 3D-gedruckten Werkzeuge¹⁵ zusammenzustellen, was den Beginn der Tierstudien weiter behindern oder verzögern könnte. Die vorliegende Studie baut auf den Informationen unserer vorherigen Protokollstudie¹¹auf und liefert detaillierte Informationen, um die erfolgreiche Umsetzung des vereinfachten, ligaturinduzierten Parodontitis-Modells im Labor zu ermöglichen. Die in diesem aktuellen Protokoll enthaltenen Details sind Teil einer komplexen Reihe von Faktoren, die zur fehlenden Reproduzierbarkeit wissenschaftlicher Ergebnisse beitragen können 15,16,17. Die konsistente Modellverwendung und die zuverlässige Knochenresorption, die in den zahlreichen Studien 2,11,12,14,18 und von kollaborativen Forschungsgruppen 13,19,20,21 in den letzten 10 Jahren identifiziert wurden, unterstreichen die Bedeutung der Verbreitung detaillierter Informationen zur Förderung der Reproduzierbarkeit in der wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Protokoll

Dieses Protokoll entsprach den Richtlinien Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)^22,23. Alle in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom IACUC der University of North Carolina at Chapel Hill genehmigt.

1. Versuchsdesign

1. Stichprobengrößenberechnung
   HINWEIS: Aufgrund der translationalen Natur des Forschungsprogramms basiert die hier vorgestellte Leistungsberechnung auf Alveolenknochenmessungen von 8 bis 12 Wochen alten Wildtyp-C57Bl6-Mäusen.
   1. Analyse von Knochen basierend auf den linearen Messungen zwischen Zement-Emaille-Verbindung und dem alveolaren Knochenkamm (CEJ-ABC).
      1. Gesunde Mäuse haben ein mittleres Anheftungsniveau (oder CEJ-ABC-Maß) von 0,2 mm, während Mäuse mit Parodontitis zum 9-Tage-Zeitpunkt nach der Ligation doppelt so viel haben (CEJ-ABC-Entfernung von 0,4 ^mm). Der Verlust des Alveolarknochens nimmt von 9 auf 18 Tage nach^{der Ligaturlegung 11} nicht signifikant zu.
      2. Führen Sie eine Leistungsanalyse basierend auf dieser Effektgröße durch, um die Anzahl der Mäuse zu bestimmen, die erforderlich sind, um diese Unterschiede zwischen Gesundheit und Krankheit aufzuzeigen (hier insgesamt 8–10 Mäuse [Abbildung 1A]).
         HINWEIS: Die Leistung wurde berechnet, um eine Potenz zwischen 0,8 und 0,95, α = 0,05, unter Verwendung einer Zwei-Stichproben-Mittelleistung zu erreichen. Gruppenmittelwerte und Standardabweichungen sind in Abbildung 1B dargestellt.
   2. Um eine therapeutische Wirkung auf Knochenverlust zu bestimmen, führen Sie eine andere Leistungsberechnung durch. Anstatt gesunde Mäuse mit kranken Mäusen zu vergleichen, da sowohl experimentelle als auch Kontrollgruppen in diesem Protokoll Parodontitis entwickeln, sollten zwischen 19 und 31 Mäuse/Gruppe reserviert werden, um die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses beim Test der Knochenverlustmodulation mit dem vereinfachten ligaturinduzierten Parodontitis-Mausmodell sicherzustellen (siehe repräsentative Ergebnisse und Abbildung 1C).
      HINWEIS: Die Leistung wurde mit demselben oben beschriebenen Test berechnet. Gruppenmittelwerte und Standardabweichungen sind in Abbildung 1D dargestellt.
2. Verfahrensstandardisierung und Personalkalibrierung
   1. Schulen und kalibrieren Sie alle an der Krankheitsinduzierung und Quantifizierung beteiligten Personen vor Studienbeginn (Interkalibrierung und Intrakalibrierung; r² ≥ 0,90).
      HINWEIS: Es wird geschätzt, dass das Training zur Ligaturplatzierung und zur Quantifizierung des Knochenverlusts einen Zeitraum von 2–3 Monaten erfordert (Zeitplan in Tabelle 1 dargestellt). Weitere erforderliche Schritte sind als Zeitplan in Tabelle 1 dargestellt.
   2. Für das Ligaturplatzieren sollten zwei geschulte Forscher im Operationsraum zusammenarbeiten. Der Hauptforscher (intra- und interkalibriert) bleibt der Operator, der die Ligaturen anlegt.
   3. Lassen Sie den zweiten Ermittler als Verfahrensassistent arbeiten und die unten aufgeführten Schritte ausführen:
      1. Registriere das Mausgewicht.
      2. Legen Sie die Maus in die Betäubungsbox.
      3. Tragen Sie Augensalbe auf die Maus auf, bevor Sie sie dem Bediener geben, damit sie in das "Mauszahnbett" gelegt wird.
      4. Stellen Sie sicher, dass ≥3 "Ligaturhalter" entsprechend mit den Ligaturen beladen und einsatzbereit sind.
         HINWEIS: Zur Effizienzsteigerung ist es ideal, ≥3 "Ligaturhalter" entsprechend geladen zu haben, damit der Bediener sie nutzen kann. Es wird Zweckmäßigkeit empfohlen (d. h. eine Verfahrenszeit von 5–10 Minuten pro Maus), um die Anzahl der täglich durchgeführten Experimente zu erhöhen und potenzielle Chargeneffekte zu verringern.
      5. Führe Mausüberwachung durch (vor und nach dem Eingriff).
         HINWEIS: Die durch Ligatur-induzierte Parodontitis ist ein nicht-invasives, nicht-chirurgisches Verfahren, das dem Zahnseide eines menschlichen Zahns ähnelt. Es wird erwartet, dass die Ligatur bei den Mäusen sehr leichte Beschwerden verursacht (hauptsächlich aufgrund der Ansammlung von Bakterien zwischen zwei Zähnen), sollte aber keine Verwendung von Schmerzmitteln erfordern. Nach der Platzierung von Ligaturen durch eine geschulte Person werden keine Komplikationen erwartet. Alle Tiere werden alle 2-3 Tage nach dem Ligaturlegen überwacht. Humane Endpunkte (z. B. Versäumnis beim Pflegen oder Füttern, Unfähigkeit aufzustehen oder zu gehen, angestrengte Atmung, nekrotische oder infizierte Wunden) sollten im genehmigten Tierprotokoll aufgeführt werden, aber sollten bei Komplikationen das veterinärmedizinische Personal zu geeigneten Maßnahmen konsultiert werden.

2. Herstellung von gedruckten Werkzeugen zur Induzierung von Ligaturparodontitis bei Mäusen

HINWEIS: Zur Optimierung der Ligaturplatzierung wurden 3D-gedruckte Werkzeuge namens Mouse Dental Bed und Ligature Holder entwickelt, die aus mehreren einzelnen 3D-gedruckten Teilen bestehen, die separat gedruckt und manuell zusammengesetzt werden. Die Blaupausenspezifikationen für diese Geräte wurden zuvor¹¹ veröffentlicht und können von erfahrenen Ermittlern verwendet werden, um einzelne STL-Dateien zu erstellen. Die neuen Geräte in der vorliegenden Studie wurden in Zusammenarbeit mit dem BeAM Design Center der University of North Carolina at Chapel Hill entwickelt. Materialien können über die jeweilige Kerneinrichtung bezogen oder 3D-gedruckt mit den STL-Dateien in Supplemental File 1 erfolgen.

1. Mauszahnbett
   1. Drucken Sie das Maus-Zahnbett (Abbildung 2A) und den Ligaturhalter (Abbildung 2B) mit Standarddruckqualität auf einem 3D-Drucker mit 3,0 mm Polylaktsäure (PLA)-Filament. Drucken Sie das Zahnbett in der vorgesehenen Ausrichtung und die anderen Teile mit gleichmäßigen, ebenen Oberflächen, die nach unten zum Druckbett ausgerichtet sind. Aktiviere die Option für Unterstützungsmaterial , indem du die Einstellung Unterstützungsplatzierung aktivierst. Stellen Sie sicher, dass das Trägermaterial zuerst die Bauplatte berührt, indem Sie die Option "Aufbauplatte berühren" auswählen.
      HINWEIS: Verwenden Sie die fünf STL-Dateien in Ergänzungsakte 1 , um alle erforderlichen Elemente auszudrucken, einschließlich des abgetrennten Rohrs, der Ligatur (mit Kerbe), des Mauszahnbetts (mit Kerben), des Deckels und des Ligaturhalters. Siehe die Materialtabelle für die Maße jedes Gegenstands (zuvor vorgestellte Bauplanspezifikationen¹⁰).
   2. Nach Abschluss des Drucks schneiden Sie alle bedruckten Stützmaterialteile der Modelle mit Drahtschneidern, Nadelzange oder einem anderen Instrument ab.
      HINWEIS: Tragen Sie während dieses Eingriffs eine Schutzbrille.
2. Maus-Zahnbett-Montage
   1. Um das Mauszahnbett vorzubereiten, legen Sie alle Teile wie gezeigt (Abbildung 3A) aus und bereiten Sie den verwendeten Kleber vor (Abbildung 3B).
   2. Fügen Sie ein paar Tropfen Kleber hinzu (Abbildung 3C) und befestigen Sie die Schrauben wie gezeigt (Abbildung 3D). Bereiten Sie sich erneut darauf vor, den Kleber (Abbildung 3E) auf die Stellen zu übertragen, in denen er aufgetragen werden soll. Schieben Sie den Schlitz des gedruckten Rohrs (Abbildung 3F) so ein, dass das widerhakenförmige Ende vom Mauszahnbett weg zeigt (hier wird der Schlauch zur Isofluranabgabe angebracht).
   3. Sichern Sie kopfstabilisierende Teile mit Kleber in Position (Abbildung 3F).
   4. Wischen Sie überschüssigen Kleber ab und halten Sie leichten Druck auf alle eingesetzten Teile für eine feste Haftung (Abbildung 3F).
3. Anpassungen des Ligaturhalters
   1. Um beim Verriegeln/Entriegeln des Mechanismus Unbehagen zu verringern, achten Sie darauf, dass alle eckigen/scharfen Kanten am äußeren Teil des Ligaturhalter-Schlosses (Abbildung 4A) leicht abgeschrägt und in einem 45°-Winkel mit einem 15C-Skalpell-Klingen-Griff und Nr. 3 mit 15C-Klinge abgeschrägt sind.
   2. Um eine feste Passform des Verriegelungsmechanismus am Ligaturhalter zu gewährleisten, richten Sie alle inneren abgerundeten Ecken des Ligaturhalter-Schlosses (Abbildung 4B-F) mit einer 15C-Skalpellklinge ab.
      HINWEIS: Dadurch kann das Schloss vollständig gegen den Ligaturhalter gelehnt werden und es sind nur geringfügige Anpassungen erforderlich.
      1. Verwenden Sie ein 3D-Druck-Trimmwerkzeug oder eine 15C-Skalpellklinge, um den "Blitz" an den oberen und unteren Kanten zu entfernen, selbst nachdem der Großteil der Stütze entfernt wurde, und schrägen Sie die Kanten leicht um 45° (ähnlich wie beim Ligature Holder Lock in Schritt 1), um ein fest sitzendes Schloss zu gewährleisten.
         HINWEIS: Entfernen Sie nicht zu viel Material, sondern nur genug, damit das Schloss ohne Widerstand angeschoben wird.
   3. Bei zu dünner Länge schneiden Sie die Länge jeder Spitze ab, bis ein dickerer Querschnitt [mindestens 0,5 mm dick] erreicht ist, wobei genügend Abstand zwischen den Spitzen bleibt, um ein Eindringen auf den Gaumen beim Platzieren von Ligaturen zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen nach dem Schneiden mindestens 3 mm lang sind (Abbildung 5A, dargestellt durch "CUT").
   4. An den Spitzen des Ligaturhalters entferne jegliche Blitz von der "Halterung", auf der das Werkzeug gedruckt wurde, um sicherzustellen, dass die Seiten der Spitzen flach sind (Abbildung 5B, Pfeil).
   5. Nehmen Sie eine "Scheibe" der Seite jeder Spitze in einem Winkel von 45° heraus, um das Belasten der Ligatur zu erleichtern und die Kanten weicher zu machen, um traumatische Verletzungen am Weichgewebe zu vermeiden (Abbildung 5C, durch Pfeile angezeigt).
   6. Stellen Sie sicher, dass jede Spitze des Ligaturhalters eine "V"-förmige Kerbe enthält, in der die Nahtseidenligaturen ruhen können. Wenn dies in Schritt 2.3.6 entfernt wurde, weil die ursprünglich gedruckte Spitze zu dünn war, verfeinern Sie sie auf dem Druck oder reproduzieren Sie sie.
      1. Wenn diese "V"-förmige Kerbe sichtbar ist, legen Sie den Ligaturhalter auf eine ebene Oberfläche mit beiden Spitzen parallel zur Tischplatte, legen Sie eine 15C-Skalpellklinge vorsichtig in die Basis der Kerbe und schaukeln Sie die Klinge vorsichtig von Seite zu Seite, sodass die Klingenkante an der Basis des "V" bleibt und die Seite der Klinge die oberen Wände des "V" berührt. Mit der Klinge an der Basis der Kerbe neigen Sie die Klinge sehr vorsichtig zur äußeren Oberfläche der Spitze hin und wiederholen Sie diese Bewegung, um die Basis der "V"-förmigen Kerbe an der Außenkante zu verfeinern, was es dem Nahtfaden erleichtert, sich an ihren Platz zu führen.
         HINWEIS: Diese Schaukelbewegung erzeugt gerade genug Bewegung im Filament, um es aus dem Weg zu bewegen und die Kerbe zu verfeinern, ohne zu viel Material zu entfernen.
      2. Wenn diese "V"-förmige Kerbe nicht sichtbar ist, legen Sie den Ligaturhalter auf eine ebene Fläche mit beiden Spitzen senkrecht zur Tischplatte. Während Sie beide Spitzen des Ligaturhalters gerade nach unten schauen, setzen Sie eine 15C-Skalpellklinge in die Mitte der Spitzen und machen Sie in einer gezielten Bewegung einen flachen Schnitt, um den Anfang der "V"-förmigen Kerbe zu bilden.
         HINWEIS: Es ist oft einfacher, diese Bewegung an jeder Spitze einzeln auszuführen, als zu versuchen, die Klinge gleichzeitig an beiden Spitzen an der richtigen Stelle zu positionieren.
      3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.7.2 bei Bedarf und achten Sie darauf, dass die Schneide der Skalpellklinge immer wieder an dieselbe Stelle in der Mitte der Spitze zurückfährt.
         HINWEIS: Wenn die Klinge nicht an dieselbe Stelle zurückführt, werden mehrere Schnitte gemacht, was dazu führt, dass sich die Filamentschichten in diesen Bereichen trennen und möglicherweise die Leistung des Werkzeugs mindern.
         HINWEIS: Die Tiefe der "V"-förmigen Kerbe muss regelmäßig mit einer gebundenen Naht-Seiden-Ligatur getestet werden, um festzustellen, ob die Ligatur hält oder immer wieder abrutscht (dies kann darauf hindeuten, dass weitere Verfeinerungen notwendig sind). Der Halter muss so bedruckt sein, dass die Kerbe nach unten auf der Bauplatte zeigt und das Ligaturhalterschloss so ausgerichtet ist, dass die breitere Öffnung nach unten die Bauplatte berührt. Auch hier kann Unterstützungsmaterial verwendet werden, wenn die Unterstützungsplatzierung nur auf Touching Buildplate eingestellt ist.
4. Zusammengebauter Ligaturhalter
   HINWEIS: Nachdem die Änderungen vorgenommen wurden, bauen Sie den Ligaturhalter zusammen und überprüfen Sie Folgendes:
   1. Wenn eine Ligatur fixiert ist, stellen Sie sicher, dass das Schloss den Faden am Ligaturhalter (nicht in Abbildung 6A zu sehen, wie der Pfeil zeigt, aber in Abbildung 6B zu sehen) entweder oben oder unten am Schloss festklemmt (beides, wenn möglich, aber das ist schwer zu erreichen).
      HINWEIS: Diese Reibung sorgt dafür, dass die Ligatur nicht aus der Position rutscht.
   2. Beim Einfädeln der Ligatur in die Rillen des Ligaturhalters, falls sie immer wieder von den Spitzen abrutscht, vertiefen Sie entweder die Rillen oder verlängern Sie sie weiter außen an die Spitze, um eine "Spur" zu schaffen, in der der Faden sitzt.
   3. Überprüfen Sie, ob die beiden Knoten zentriert sind (Abbildung 6C) und waagerecht (gerade Linie in Abbildung 6D), wenn man sie von vorne auf den Ligaturhalter betrachtet; wenn nicht, ist eine Rille tiefer als die andere.
   4. Überprüfen Sie, ob die Ligatur genau innerhalb der Kerben sitzt und nicht zu tief sitzt; ansonsten besteht ein erhöhtes Risiko, dass die Spitze des Ligaturhalters mit dem Weichgewebe in Kontakt kommt und bei der Ligatureinsetzung ein Trauma verursacht.
   5. Überprüfen Sie mit einem Zahnprüfer (Abbildung 6E), dass die Ligatur bei sanfter Kraft zwischen den Knoten wieder an ihren Platz zurückspringt, ohne zu rutschen (dies simuliert die Kraft, die sie beim Ligaturlegen erfährt).

3. Ligaturplatzierung

HINWEIS: Es ist möglich, dass die Ligaturen zwischen Mauszähnen mit oder ohne Zugabe menschlicher Parodontalkrankheitserreger^{eingesetzt werden 11}. Eine zeitabhängige Analyse der mikrobiellen Zusammensetzung der Ligatur (ohne Supplementierung mit menschlichen Bakterienarten) zeigte eine Verschiebung der Mikrobiom-Gemeinschaft (Dysbiose) während der Parodontitisentwicklung¹². Aus diesem Grund wird ein Ligaturersatz nicht empfohlen, da dies die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses beeinträchtigen kann. Die Einbeziehung von Bakterienarten in Kombination mit der Ligatur hängt von der in einer bestimmten Studie behandelten Frage ab. Aufgrund des erwarteten Ligaturverlusts^{von 10}–15 % werden die Ligaturen beidseitig in einer einzigen Maus platziert. Dieser Ansatz minimiert den Verlust von Mäusen während des Experiments.

1. Nachdem die Maus mit eingeatmetem Isofluran betäubt wurde, legt man die betäubte Maus mit dem Rücken an das Bett und die Nase in der Nähe des Nasenkegels in das Mauszahnbett.
   HINWEIS: Mäuse sollten mit 4 % (Vol/vol) Isofluran betäubt werden. Isofluran-Verdampfer und Sauerstoff werden von einem 0,2-μm-Luftfilter gefiltert. Sobald die Maus vollständig betäubt und im Mauszahnbett liegt, sollte sie mit einem Durchfluss von 1,5–2,5 % durch den Nasenkegel gehalten werden. Mäuse werden durch unwillkürliche Körperbewegungen und Atemfrequenz (~55–65 Atemzüge pro Minute) überwacht. Es ist kein Analgetikum erforderlich, da es sich um ein nicht-invasives, nicht-chirurgisches Verfahren handelt, das dem Zahnseide eines menschlichen Zahns ähnelt. Das Platzieren der Ligaturen wird den Mäusen voraussichtlich sehr leichte Beschwerden bereiten (hauptsächlich aufgrund der Ansammlung von Bakterien zwischen zwei Zähnen), sollte aber keine Anwendung von Schmerzmitteln erfordern. Nach der Platzierung von Ligaturen durch eine geschulte Person werden keine Komplikationen erwartet.
2. Benutze die Gummibänder, um den Kopf der Maus zu stabilisieren und ihr Maul zu öffnen.
   HINWEIS: Das Band um die Unterkieferzähne zieht ebenfalls die Zunge zurück, und die Spannung ist äußerst aktiv, um den Kiefer zu öffnen, ohne daran zu ziehen. Die Visualisierung der Backenzähne wird erleichtert, wenn die Lichtquelle in einen Winkel gerichtet wird, um zu verhindern, dass Schatten das Sichtfeld verdecken. Das Mauszahnbett wurde speziell für das vereinfachte, ligaturinduzierte Parodontitis-Mausmodell entwickelt. Der Abstand zwischen der Nase der Maus und dem Zapfen ist erforderlich, damit die Maus während des experimentellen Verfahrens kleine Körperbewegungen zeigen kann. Diese Bewegung der Maus ermöglicht eine angemessene Überwachung der Handbewegung des Bedieners während der Verwendung des Ligaturhalters und steuert die Kraftmenge während der Ligaturplatzierung. Das Platzieren der Ligaturen sollte 5-10 Minuten pro Maus dauern. Verfahren sollten in einer gut belüfteten Haube durchgeführt werden, um Tierversuche durchzuführen
3. Um eine Ligatur auf die rechte Seite zu legen, halten Sie den Ligaturhalter in der rechten Hand und den Explorer in der linken.
   HINWEIS: Wenn die Knoten an der Ligatur nicht zwischen den Spitzen zentriert sind, sondern näher an einer Spitze liegen, ist die Ligatur möglicherweise besser für die Platzierung auf einer bestimmten Seite geeignet. Wenn die Knoten beispielsweise näher an der rechten Spitze des Ligaturhalters platziert werden, kann diese Ligatur leichter auf der rechten Seite angebracht werden.
4. Setzen Sie vorsichtig die Spitze des Explorers unterhalb des interproximalen Kontakts der ersten und zweiten Molaren auf der Gaumenseite.
   1. Lassen Sie die Spitze des Explorers zuerst die Zähne berühren und dann nach unten gleiten und gegen das Zahnfleisch ruhen, um das Weichgewebe nicht zu schädigen; Legen Sie den Explorer-Griff in eine horizontale Winkelung ab, sobald Sie richtig positioniert sind.
   2. Beachten Sie, welches Ende des Explorers auf der rechten Seite und welches auf der linken Seite verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Explorers in der proximalen Kontaktfläche in Aufwärtsrichtung einhakt, während die Biegung des Schafts quer über die gegenseitliche Seite gelegt werden kann, um den Kopf während der Platzierung gegen reaktionäre Kräfte zu stabilisieren.
5. Mit dem Ligaturhalter in horizontaler Winkelung zieht man die Wange zurück, indem man den Ligaturhalter zunächst über dem interproximalen Kontakt zwischen dem zweiten und dritten Molar positioniert, den Rand des Ligaturhalters gegen die Wange drückt, um ihn zu bewegen, und den Ligaturhalter dann an der interproximalen Berührung des ersten und zweiten Molars in Position bringt.
   HINWEIS: Dieser Schritt hilft sicherzustellen, dass keine Mundschleimhaut zwischen der Ligatur und den Zähnen eingeschlossen wird, was die Platzierung beeinträchtigen könnte.
6. Sobald die Ligatur über dem interproximalen Kontakt zwischen dem ersten und zweiten Molar positioniert ist, drehen Sie den Griff des Ligaturhalters um bis zu 45° und drücken Sie die Ligatur durch die Verbindung durch eine Kombination aus sanftem Schaukeln und Gleiten.
7. Das überschüssige Faden durchtrennen:
   1. Verwenden Sie eine feine Nadelzange, um den überschüssigen Faden, der am Knoten auf der rechten Seite befestigt ist, zu befestigen, ziehen Sie den Faden über die Zähne nach links und schieben Sie mit einer leicht geöffneten Schere den Faden hinunter, bis sie ~1,5 mm vom Knoten entfernt ist, bevor Sie schneiden.
      HINWEIS: Dies hilft, die Wahrscheinlichkeit unbeabsichtigter Schleimhautverletzungen beim Reduzieren des überschüssigen Materials zu verringern.
   2. Wiederhole das oben Genannte mit umgekehrten Richtungen für den anderen Knoten.
8. Spiegeln Sie die oben genannten Schritte aus 3.3. zu 3.7.2. beim Platzieren einer Ligatur auf der gegenüberliegenden Seite des Mundes.
   HINWEIS: Eine Ligatursammlung beim Opfer wird empfohlen, da die dysbiotische Verschiebung durch verschiedene experimentelle Bedingungen verändert werden kann¹². Zur Erleichterung der Sammlung werden die Mäuse in das Murine Dental Bed gelegt und einer der Knoten der Ligatur wird entfernt, gefolgt von einer sanften interproximalen Entfernung mit einer Pinzette. Die Verwendung des Mauszahnbetts während der Ligaturentnahme ermöglicht eine angemessene Stabilität der Maus und erleichtert den Zugang zur Ligaturstelle.

4. Quantifizierung der Knochenzerstörung

1. μCT-Analyse
   1. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf Datei | Bild importieren...
   2. Klicken Sie im Popup-Menü auf Durchsuchen , gehen Sie zum Ordner mit den Dicom-Dateien für einen Scan und wählen Sie die erste Datei aus.
   3. Klicken Sie auf Untersuchen, um weitere Dateien im Ordner zu finden und auszuwählen, die Teil derselben gescannten Probe sind. Klick OK.
   4. Nachdem das Bild geladen ist, klicke auf Visualize und Isosurface.
   5. Ändern Sie den Bildschwellenwert auf 5.000 und den Oberflächenqualitätsfaktor (%) auf 55.
   6. Haken die Kästchen mit der Markierung Bildglättung aktivieren und Clip-Oberfläche mit aktuellem ROI ankreuzen und klicken Sie auf Aktualisieren.
   7. Passen Sie die Level-Eigenschaften an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf Fenster/Level unten klicken (Abbildung 7A) und auf Fenster-/Level-Eigenschaften bearbeiten. Wählen Sie einen Knochendichtewert , der für alle Proben standardisiert ist. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie 2.000 , ändern Sie dies jedoch basierend auf der Knochendichte der Proben und halten Sie sie für alle Messungen konstant.
   8. Um Ebenen zu manipulieren:
      1. Verwende Tastenkombinationen I/J/K Versteck/Anzeigen für die drei verschiedenen Ebenen.
      2. Rechtsklicke und bewege den Cursor, um hereinzu- und rauszuzoomen.
      3. Drücke Shift und dann linksklicke, um zu schwenken.
      4. Klicken Sie auf Slice , um die Ebenen zu verschieben und zu drehen.
      5. Klicken Sie auf die Mitte der Ebene, um die Ebene vorwärts oder rückwärts zu bewegen, oder platzieren Sie den Cursor in die Mitte der gewünschten Ebene und verwenden Sie die Pfeiltasten nach oben, um die Ebene Stück für Stück zu bewegen.
      6. Klicken Sie auf die Kante der Ebene, um um eine Linie parallel zu dieser Kante im Zentrum der Ebene zu drehen.
      7. Klicken Sie auf die Ecke einer Ebene, um sich um die Ebene zu drehen.
   9. Orientiere die z-Achse (blaue Scheibe oben auf dem Bildschirm – der Z-Schnitt) so, dass die Oberflächen/Formen aller drei Zähne gleichzeitig sichtbar werden (oder so nah wie möglich) (Abbildung 7B).
   10. Scrollen Sie durch dieselbe Ebene (blaues Fenster oben auf dem Bildschirm-z-Schnitt), sodass die Wurzeln des 1^. und 2^. Molars sichtbar sind (Abbildung 7C). Versuchen Sie, einen Punkt zu wählen, der weit genug unten an den Wurzeln liegt, sodass die gesamte umgebende Anatomie sichtbar ist, aber auch an dem die Kanäle gut definiert und in einer geraden Linie erscheinen.
       HINWEIS: Die Ebene muss möglicherweise gedreht werden, um die Kanäle vertikal auszurichten.
   11. Richten Sie die x-Achse (vertikale grüne Linie im Z-Schnitt-Panel) so aus, dass sie mit den Mundwurzeln des 1^. und 2^{. Molar} ausgerichtet ist (versuchen Sie, wenn möglich durch den zentralen Teil jeder Wurzel/Kanals auszurichten; ansonsten durch die Mundwurzel des 1^. Molaren und die distobuccale Wurzel des 2^. Molars) (Abbildung 7D).
   12. Verwenden Sie die Orientierung des X-Schnitts als Referenz für die Ausrichtung des y-Schnitts (vertikale blaue Linie im X-Schnitt-Panel).
       1. Richten Sie die y-Scheibe so aus, dass sie vertikal parallel durch die Wurzel des ersten Molar im X-Schnitt-Panel verläuft (Abbildung 7E). Drehen Sie die Ebene, um die Wurzel vertikal zu orientieren. Beachten Sie, dass die blaue Linie durch die Mitte der Wurzel verläuft.
          HINWEIS: In Bereichen mit Knochenverlust (wie bei diesem Modell zu erwarten) kann der Alveolarrücken einen Defekt aufweisen; daher muss die Mittellinie der Wurzel geschätzt werden, da der umgebende Knochen möglicherweise nicht vorhanden ist, um idealerweise die Mitte der Höhle zu definieren.
   13. Im y-Slice-Panel misst man den Abstand vom Zementenamel-Übergang (CEJ) zum Alveolarknochenkamm (ABC), indem man den Cursor an der tiefsten Stelle der Rille am CEJ platziert und 1 drückt und dann den Cursor am nächstgelegenen Punkt des ABC platziert und 2 drückt, wie gezeigt (Abbildung 7F). Der^{erste Punkt wird} durch einen blauen Pfeil und der zweite Punkt durch einen grünen Pfeil markiert.
       1. Wenn die Pfeile erst angezeigt werden, wenn beide Punkte ausgewählt sind, wähle sie aus, indem du mit der Maus den Pfeil über die gewünschten Bereiche führst und die Zahlentasten auf der Tastatur drückst, da nur Mausklicken nicht funktioniert.
       2. Wenn die CEJ schwer zu bestimmen ist, verwenden Sie die Pfeiltasten nach oben und unten, um durch benachbarte Schnitte zu scrollen und ihre Position zu bestätigen.
       3. Mehrere Punkte des ABC messen, wenn der "nächstgelegene Punkt" schwer zu bestimmen ist, um zu bestätigen, dass es kaum bis keine Variation in der Messung gibt.
          HINWEIS: Um zu bestätigen, dass die korrekte Messung durchgeführt wurde, muss man die x- und z-Schnitte über der gewünschten Wurzel sehen und die Messung in der 3D-Ansicht visuell bestätigen können, indem man die Ebenen ausblendet (Abbildung 7F).
2. Gingivale Ausdrucksquantifizierung von Rankl/Opg und Rankl/Rank
   1. Nehmen Sie Zahnfleischgewebe wie zuvor beschrieben^{zusammen 9}.
      HINWEIS: Die besten RNA-Extraktionsergebnisse werden mit frischen Gewebeproben erzielt und die RNA-Reinigung muss so schnell wie möglich erfolgen.
   2. Extraktion von Zahnfleischgewebe-RNA durch Perlenschlagen mit dem referenzierten Kit und keramischen Perlen. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Kit und lagern Sie die Probe bei -80 °C bis zur Analyse durch qRT-PCR.

Ergebnisse

aRepräsentative Datenanalyse linearer alveolärer Knochenmessungen von WT-weiblichen und männlichen Mäusen zum Ausgangspunkt (Gesundheit) und 9 Tage nach der Ligatur ist in Abbildung 1A dargestellt. Die Leistungsberechnung zeigt, dass insgesamt 10 Mäuse (4–5 Mäuse pro Gruppe) benötigt werden, um Unterschiede zwischen diesen Gruppen zu erkennen, wenn das primäre Ergebnis lineare Knochenwerte sind, gemessen durch μCT (Abbildung 1B)...

Diskussion

Die vorliegende Studie bietet aufschlussreiche Informationen und detaillierte, schrittweise Leitlinien zum zuvor vorgestellten vereinfachten, ligaturinduzierten Parodontitis-Mausmodellprotokoll¹⁰. Die im vorliegenden Artikel enthaltenen Details können die Reproduzierbarkeit erheblich beeinflussen und werden durch die Erfahrungen der Gruppe mit diesem spezifischen, ligaturinduzierten Parodontitis-Mausmodell 11,12,13,18,19,21 gestü...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Klinge	Integra	4-315C	15C-Klinge
Keramikperlen	VWR	10158-608	0,5 mL x 1,4 mm Keramikperlen
Leim-/Harzmaterial	Die Gorilla-Kleberfirma	8401519
Ligaturhalter (mit Kerbe)	UNC am Chapel Hill BeAM Design Center Anlagenkern	Nicht anwendbar	118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Ligaturhalter-Schloss	UNC am Chapel Hill BeAM Design Center Anlagenkern	Nicht anwendbar	17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Lulzbot mini v1.0 3D-Drucker	Lulzbot (Fargo Additive Manufacturing Equipment 3D, LLC)	Nicht anwendbar	Aleph Objects, Lulzbot Mini v1.0 Modell
MicroView-Software	Parallax-Innovationen	2.5.0-3139	Software für Knochenmessungen
Mauszahnbett (mit Kerben)	UNC am Chapel Hill BeAM Design Center Anlagenkern	Nicht anwendbar	103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Maus-Zahnbettauflage	UNC am Chapel Hill BeAM Design Center Anlagenkern	Nicht anwendbar	99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Polylaktsäure (PLA) Filament	Wortwörtlich	55259	3,0 mm PLA
Rapidpure RNA-Gewebekit	MP Biomedizin	112721050
Skalpellklingengriff	Bard-Parker	371030	15C-Skalpellklingen-Griff
Nahtseide	Roboz Chirurgisches Instrument	SUT-15-1
Taqman qPCR-Primer	Thermo Fisher	Rang (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), OpG (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765	InvivoGen, San Diego, USA	#inh-vx765-1	Caspase-1-Inhibitor zur Wirtsmodulation verwendet