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Methodenartikel

Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

2.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/65930

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23. Februar 2024

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1Systems Medicine, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV., 2Genomics & Immunoregulation, LIMES Institute, University of Bonn, 3PRECISE Platform for Single Cell Genomics and Epigenomics, DZNE and University of Bonn, 4Immunogenomics & Neurodegeneration, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Zusammenfassung

Die Transkriptomik ermöglicht es, umfassende Einblicke in zelluläre Programme und deren Reaktionen auf Störungen zu erhalten. Obwohl die Kosten für die Herstellung und Sequenzierung von Bibliotheken in den letzten zehn Jahren erheblich gesunken sind, ist die Anwendung dieser Technologien in dem für das Drogenscreening erforderlichen Umfang nach wie vor unerschwinglich teuer, was das immense Potenzial dieser Methoden behindert. Unsere Studie stellt ein kostengünstiges System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening vor, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik kombiniert. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informative biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Wirkstoffe und neuer Moleküle. Abhängig von der gewählten Behandlung und der Inkubationszeit führt dieses Protokoll innerhalb von ca. 2 Tagen zur Sequenzierung von Bibliotheken. Durch mehrere Haltepunkte innerhalb dieses Protokolls kann sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Sequenzierung zeitunabhängig durchgeführt werden. Die gleichzeitige Verarbeitung einer hohen Anzahl von Proben ist möglich; Die Messung von bis zu 384 Proben wurde ohne Verlust der Datenqualität getestet. Es gibt auch keine bekannten Beschränkungen für die Anzahl der Erkrankungen und/oder Medikamente, trotz der Berücksichtigung der Variabilität der optimalen Inkubationszeiten von Arzneimitteln.

Einleitung

Die Entwicklung neuer Arzneimittel ist ein komplexer und zeitaufwändiger Prozess, der die Identifizierung potenzieller Arzneimittel und ihrer Ziele, die Optimierung und Synthese von Arzneimittelkandidaten sowie die Prüfung ihrer Wirksamkeit und Sicherheit in präklinischen und klinischen Studien umfasst1. Traditionelle Methoden für das Wirkstoff-Screening, d. h. die systematische Bewertung von Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten für therapeutische Zwecke, beinhalten die Verwendung von Tiermodellen oder zellbasierten Assays, um die Auswirkungen auf bestimmte Ziele oder Signalwege zu testen. Diese Methoden waren zwar erfolgreich bei der Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, lieferten aber oft keine ausreichenden Einblicke in die komplexen molekularen Mechanismen, die der Wirksamkeit von Medikamenten sowie der Toxizität und den Mechanismen potenzieller Nebenwirkungen zugrunde liegen.

Die Bewertung genomweiter Transkriptionszustände stellt einen leistungsstarken Ansatz dar, um die derzeitigen Einschränkungen des Wirkstoffscreenings zu überwinden, da sie eine umfassende Bewertung der Genexpression als Reaktion auf Arzneimittelbehandlungen ermöglicht2. Durch die Messung von RNA-Transkripten in einer genomweiten Weise, die zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird, zielt die Transkriptomik darauf ab, einen ganzheitlichen Überblick über die transkriptionellen Veränderungen zu erhalten, die als Reaktion auf Medikamente auftreten, einschließlich Änderungen der Genexpressionsmuster, alternatives Spleißen und nicht-kodierender RNA-Expression3. Diese Informationen können verwendet werden, um Arzneimittelziele zu bestimmen, die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln vorherzusagen und die Dosierung und Behandlung von Medikamenten zu optimieren.

Einer der Hauptvorteile der Kombination von Transkriptomik und unvoreingenommenem Wirkstoff-Screening ist das Potenzial, neue Wirkstoffziele zu identifizieren, die bisher nicht in Betracht gezogen wurden. Herkömmliche Wirkstoff-Screening-Ansätze konzentrieren sich oft auf etablierte Zielmoleküle oder -wege, was die Identifizierung neuer Zielmoleküle behindert und möglicherweise zu Medikamenten mit unvorhergesehenen Nebenwirkungen und eingeschränkter Wirksamkeit führt. Die Transkriptomik kann diese Einschränkungen überwinden, indem sie Einblicke in die molekularen Veränderungen liefert, die als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung auftreten, und potenzielle Ziele oder Signalwege aufdeckt, die bisher möglicherweise nicht in Betracht gezogen wurden2.

Neben der Identifizierung neuer Wirkstoffziele kann die Transkriptomik auch zur Vorhersage der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten verwendet werden. Durch die Analyse der Genexpressionsmuster, die mit Arzneimittelreaktionen verbunden sind, können Biomarker entwickelt werden, mit denen das Ansprechen eines Patienten auf ein bestimmtes Medikament oder Behandlungsschema vorhergesagt werden kann. Dies kann auch dazu beitragen, die Medikamentendosierung zu optimieren und das Risiko unerwünschter Nebenwirkungen zu verringern4.

Trotz ihrer potenziellen Vorteile bleiben die Kosten der Transkriptomik ein erhebliches Hindernis für ihre breite Anwendung im Wirkstoffscreening. Die Transkriptomanalyse erfordert spezielle Geräte, technisches Fachwissen und Datenanalysen, was es für kleinere Forschungsteams oder Organisationen mit begrenzten Mitteln schwierig machen kann, Transkriptomik im Arzneimittelscreening einzusetzen. Die Kosten für die Transkriptomik sind jedoch stetig gesunken, was sie für die Forschungsgemeinschaften zugänglicher macht. Darüber hinaus haben Fortschritte in der Technologie und in den Datenanalysemethoden die Transkriptomik effizienter und kostengünstiger gemacht, wodurch ihre Zugänglichkeit weiter verbessertwurde 2.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein hochdimensionales und exploratives System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik-Analyse kombiniert 5,6. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kosten pro Probe auf 1/6 der derzeitigen Kosten kommerzieller Lösungen für die mRNA-Sequenzierung in voller Länge zu senken. Das Protokoll erfordert nur Standard-Laborgeräte, die einzige Ausnahme ist die Verwendung von Short-Read-Sequenzierungstechnologien, die ausgelagert werden können, wenn Sequenziergeräte nicht im eigenen Haus verfügbar sind. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informationsreiche biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Medikamente und neuer Moleküle.

Ziel des Experiments ist es, die Wirkstoffaktivität auf PBMCs in verschiedenen biologischen Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf jede biologische Fragestellung angewendet werden, bei der mehrere Medikamente mit einer transkriptomischen Auslesung getestet werden sollten, um einen transkriptomweiten Überblick über die zelluläre Wirkung der Behandlung zu erhalten.

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der lokalen Ethikkommissionen der Universität Bonn.

1. Vorbereitung von Puffern, Lösungen und Geräten

  1. Bereiten Sie die Lösungen vor und sammeln Sie die Materialien, die in der Materialtabelle beschrieben sind.
  2. Das Wasserbad auf 37 °C erhitzen und das komplette Wachstumsmedium erwärmen (RPMI-1640 + 10 % fötales Kälberserum (FCS) + 1 % Penicillin/Streptomycin).
  3. Verwenden Sie für die Zellernte eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    HINWEIS: Sorgen Sie für eine saubere Umgebung, während Sie mit Zellen arbeiten, um die Sterilität zu gewährleisten.

2. Handhabung der Zellen

HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Kryokonservierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) aus menschlichem Blut finden Sie in7.

  1. Auftauen und Zählen von Zellen
    1. Nehmen Sie die Kryoröhrchen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie im Wasserbad bei 37 °C für 2 - 3 min unter vorsichtigem Umdrehen auf.
    2. Die aufgetauten Zellen werden in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt.
    3. Spülen Sie das Kryoröhrchen mit 1 ml warmem, vollständigem Wachstumsmedium und geben Sie diese Lösung tropfenweise zu den Zellen im Röhrchen (1. Verdünnungsschritt).
    4. Wiederholen Sie die Verdünnung 1:1, bis ein Volumen von 32 ml erreicht ist (insgesamt 5 Verdünnungen mit jeweils 1, 2, 4, 8 und 16 ml warmem, vollständigem Wachstumsmedium). Geben Sie das Medium tropfenweise hinzu, um die Zellstörung zu reduzieren, während Sie das konische Röhrchen leicht bewegen.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 min lang (300 x g, 20 °C) und entfernen Sie den Überstand, indem Sie das konische Röhrchen in einer fließenden Bewegung vorsichtig kippen.
    6. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml warmem, vollständigem Wachstumsmedium und fahren Sie mit der Zellzählung fort.
    7. Mischen Sie zum Zählen 10 μl Zellsuspension mit Trypanblau (1:2 bis 1:10 Verdünnung je nach Dichte der Zellsuspension), um lebende von toten Zellen während des Zählens zu unterscheiden. Abgestorbene oder beschädigte Zellen erscheinen aufgrund der Aufnahme des Farbstoffs blau, während lebenswichtige Zellen nicht gefärbt sind.
      HINWEIS: Trypanblau ist leicht zytotoxisch, gefärbte Zellen sollten nicht länger als 5 Minuten gelagert werden.
    8. Zählen Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einer Zählkammer unter Verwendung von 10 μl gefärbter Zelllösung.
      1. Wenn Sie die Neubauer-verbesserte Zellkammer verwenden, zählen Sie alle Zellen innerhalb der vier großen Quadrate, die sich an den Ecken befinden, und verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Konzentration der Zellsuspension zu berechnen.
        figure-protocol-1
    9. Verdünnen Sie die Zellen mit warmem, vollständigem Wachstumsmedium auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml. Zentrifugieren Sie nur, wenn das erforderliche Volumen kleiner als 3 ml ist, und resuspendieren Sie das Zellpellet auf das richtige Volumen.
  2. Zellaussaat und -behandlung
    1. 100 μl Zellsuspension pro Well in eine 96-Well-Zellkulturplatte (1 x 105 Zellen/Well) geben.
      HINWEIS: Die Zellzahl für die Aussaat wurde für PBMC-Kulturen optimiert. Während niedrige Zellkonzentrationen keine ausreichende Menge an RNA für die Sequenzierung liefern, erhöht eine übermäßige Anzahl von Zellen das Risiko einer suboptimalen Zelllyse und der Hemmung der reversen Transkriptionsreaktion.
    2. Bereiten Sie Arzneimittelverdünnungen in einer Konzentration vor, die doppelt so hoch ist wie die für die Behandlung verwendete Konzentration (2x). Wählen Sie das Lösungsmittel entsprechend der Löslichkeit der Verbindung, vorzugsweise vollständiges Nährmedium.
      HINWEIS: PBS oder Dimethylsulfoxid (DMSO) kann verwendet werden, wenn sonst keine ausreichende Löslichkeit erreicht werden kann. Die maximale Konzentration von DMSO im resultierenden Inkubationsvolumen sollte 0,5 % nicht überschreiten, um eine durch das Lösungsmittel induzierte Zytotoxizität zu vermeiden.
    3. 100 μl der 2-fachen Wirkstoffverdünnung (Endkonzentration in der Vertiefung 1X) zugeben und bei 37 °C für die definierte Zeit inkubieren.
      HINWEIS: Ergänzende Untersuchungen sollten durchgeführt werden, um die optimale Inkubationszeit des Arzneimittels zu ermitteln und mögliche Mechanismen der Zytotoxizität auszuschließen.
  3. Zellernte und -lyse
    1. Die Zellkulturplatte wird 10 min (300 x g, 20 °C) zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe, indem Sie die Platte in einem Winkel (30°-45°) halten, während Sie die Spitze auf die untere Ecke der Vertiefung richten, um so wenig Zellen wie möglich zu entfernen.
    2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl eiskaltes PBS in jede Vertiefung geben und die Platte 5 Minuten lang zentrifugieren (300 x g, 4 °C). Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe, wobei Sie die Platte in einem spitzen Winkel halten, um so viel PBS wie möglich zu entfernen.
    3. Bereiten Sie den Lysepuffer, wie in Tabelle 1 beschrieben, für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen (rxn) vor, wobei 10 % Überschuss hinzugefügt werden.
    4. Geben Sie 15 μl Lysepuffer in jede Vertiefung und versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Dichtungsfolie, um die Proben vor Kontamination zu schützen. Die Platte vor dem Zentrifugieren 1 min (1000 x g, 4 °C) vortexen und 5 min auf Eis inkubieren.
    5. Sammeln Sie 6 μl lysierte Zelllösung in einer PCR-Platte und frieren Sie das Zelllysat kurz bei -80 °C ein, um eine optimale Zelllyse zu gewährleisten. Achten Sie darauf, mehrere Einfrierzyklen der Platten zu vermeiden.
      HINWEIS: STOPPPUNKT: Wenn die cDNA-Produktion nicht nachträglich durchgeführt wird, kann das Zelllysat bis zu mehreren Monaten bei -80 °C gelagert werden, ohne dass die RNA-Qualität wesentlich abnimmt.

3. Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung

  1. Reverse-Transkriptase-Reaktion (RT)
    HINWEIS: Wenn Sie mit RNA arbeiten, legen Sie alle Proben auf Eis und stellen Sie sicher, dass Sie nukleasefreie Geräte (sterile Einweg-Plastikwaren) und Wasser verwenden.
    1. Bereiten Sie die RT-Reaktionsmischung wie in Tabelle 2 beschrieben für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen unter Zugabe von 10 % Überschreitung vor. Die Mischung kurz vortexen und kurz herunterschleudern. Bewahren Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis auf.
    2. Tauen Sie das Zelllysat bei Raumtemperatur (RT) auf und schleudern Sie es kurz herunter, um das gesamte Zelllysat am Boden der Platte zu sammeln.
    3. Führen Sie die mRNA-Denaturierung auf einem Thermocycler gemäß Tabelle 3 durch.
    4. Nehmen Sie die Platte aus dem Thermocycler und drehen Sie sie kurz nach unten, um potenzielles Kondensat aufzufangen. Geben Sie 6 μl RT-Reaktionsmischung in jede Vertiefung, um ein Endvolumen von 12 μl zu erhalten. Versiegeln Sie die Platte, um die Platte zu schützen und Verdunstung, Wirbel und Schleudern zu vermeiden.
    5. Legen Sie die Platte auf den Thermocycler und starten Sie das RT-Reaktionsprogramm gemäß Tabelle 3.
  2. Vorverstärkung
    1. Tauen Sie den High-Fidelity-DNA-Polymerase- und In-situ-PCR-Primer (ISPCR) bei Raumtemperatur auf.
    2. Bereiten Sie die Voramplifikationsmischung gemäß Tabelle 4 für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen vor und fügen Sie 10 % Überschuss hinzu. Den Mix kurz vortexen und runterschleudern.
      HINWEIS: Die Enzymmischung ist bei Raumtemperatur stundenlang stabil.
    3. Schleudern Sie die PCR-Platte, geben Sie 15 μl der Voramplifikationsmischung in jede Vertiefung und versiegeln Sie die Platte.
    4. Setzen Sie es auf den Thermocycler und starten Sie die Vorverstärkungsreaktion gemäß Tabelle 5.
      1. Passen Sie die Anzahl der Zyklen aufgrund des RNA-Gehalts an. Beginnen Sie mit einer niedrigeren Zahl und erhöhen Sie sie, wenn die cDNA-Ausbeute nicht ausreicht.
        HINWEIS: Unserer Erfahrung nach sollte für jeden Zelltyp die optimale Anzahl von Zyklen festgelegt werden, die Versuchsbedingungen und die Behandlung haben keinen Einfluss auf die optimale Anzahl von Zyklen. Wir empfehlen daher, die optimale Anzahl von Zyklen experimentell zu bestimmen, wenn dieses Protokoll für einen neuen Zelltyp erstellt wird. Im Allgemeinen benötigen Primärzellen im Vergleich zu Zelllinien eine höhere Anzahl von Zyklen. HALTEPUNKT: Das Vorverstärkungsprodukt kann bei - 20 °C gelagert werden.
  3. cDNA-Aufreinigung und Qualitätskontrolle (QC)
    HINWEIS: Die Probenreinigung kann für jede Platte nacheinander durchgeführt werden, da die Proben in diesem Stadium ziemlich stabil sind. Eine Erhöhung der Anzahl der Proben führt zu einer längeren Dauer des Protokolls, schränkt jedoch die Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden können, nicht ein.
    1. Bevor Sie beginnen, bringen Sie die magnetischen Reinigungsperlen auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie 1 Minute lang auf hoher Geschwindigkeit, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren.
    2. Geben Sie 0,8x v/v (20 μl) magnetische Reinigungsperlen in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
    3. Legen Sie die PCR-Platte für 5 Minuten auf ein magnetisches Gestell, bis die Kügelchen vollständig getrennt sind. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
    4. Halten Sie die Platte auf dem Magnetgestell und fügen Sie vorsichtig 100 μl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu, um die Perlen zu waschen und 30 s lang zu inkubieren. Verwenden Sie eine Pipette mit kleinem Volumen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang für einen weiteren Waschschritt. Achten Sie darauf, so viel Ethanol wie möglich zu entfernen.
    5. Trocknen Sie die Perlen auf dem Magnetgestell bei Raumtemperatur bis zu 5 Minuten an der Luft, bis das Ethanol vollständig verdampft ist und die Perlen nicht mehr glänzen.
    6. Nehmen Sie die Platte aus dem magnetischen Gestell, suspendieren Sie die Kügelchen in 20 μl nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
    7. Legen Sie die Platte wieder auf das Magnetgestell, bis sich die Perlen getrennt haben.
    8. Rückgewinnung des Eluats in einer neuen PCR-Platte für die cDNA-Qualitätskontrolle und Markierung.
    9. Führen Sie einen TapeStation- oder FragmentAnalyser-Assay durch, um die Größenverteilung und Konzentration der cDNA-Bibliothek zu bewerten (empfohlen: TapeStation D5000-Assay). Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. Es ist mit einer typischen Ausbeute von 20 ng zu rechnen.
  4. Tagmentation mit Kit
    HINWEIS: Andere Tagmentierungsprotokolle können verwendet werden, wenn sie bereits etabliert sind.
    1. Verdünnen Sie die cDNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 150 - 300 pg/μl.
    2. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 6 vor, um einen sofortigen Start der Markierungsreaktion nach Zugabe der cDNA zur Enzymmischung zu gewährleisten.
    3. Bereiten Sie die Tagmentierungsmischung gemäß Tabelle 7 für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen vor und fügen Sie 10 % Überschuss hinzu.
    4. Geben Sie 3 μl der Tagmentierungsmischung pro Reaktion auf eine neue PCR-Platte und fügen Sie jeder Reaktion 1 μl cDNA hinzu.
    5. Starten Sie die Markierungsreaktion unmittelbar nach Zugabe der cDNA.
    6. Inaktivieren Sie die Reaktion durch Zugabe von 1 μl neutralisierendem Tagment-Puffer (NT; alternativ können auch 0,2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet werden).
  5. Anreicherungs-PCR
    1. Bereiten Sie die Anreicherungs-PCR-Mischung Tabelle 7 für die Anzahl der Reaktionen vor und fügen Sie 10 % Überschuss hinzu. (Empfohlen: Nextera UDI-Set, um Index-Hopping auf gemusterten Durchflusszellen (z. B. Illumina NovaSeq 6000)) zu verhindern).
    2. Zu jeder Reaktion werden 9 μl der Anreicherungs-PCR-Mischung gegeben, um ein Gesamtvolumen von 14 μl zu erhalten.
    3. Führen Sie das Anreicherungs-PCR-Programm gemäß Tabelle 8 aus.
      HINWEIS: Für die Anreicherungs-PCR sind 16 Zyklen Standard. Wenn die cDNA-Qualität schlecht ist, können zusätzliche Zyklen hinzugefügt werden.
  6. Bereinigung und Qualitätskontrolle
    1. Bevor Sie beginnen, bringen Sie die magnetischen Reinigungsperlen auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie 1 Minute lang auf hoher Geschwindigkeit, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren.
    2. 1,0x v/v (14 μl) magnetische Reinigungskügelchen zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Gestell und warten Sie 5 Minuten, bis die Perlen vollständig getrennt sind. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
    4. Halten Sie die Platte auf dem Magnetgestell und fügen Sie vorsichtig 100 μl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu, um die Perlen zu waschen und 30 s lang zu inkubieren. Verwenden Sie eine Pipette mit kleinem Volumen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang für einen weiteren Waschschritt. Achten Sie darauf, so viel Ethanol wie möglich zu entfernen.
    5. Trocknen Sie die Perlen bei Raumtemperatur für 3 Minuten an der Luft oder bis sie nicht mehr glänzen.
    6. Nehmen Sie die Platte aus dem magnetischen Gestell, suspendieren Sie die Kügelchen in 20 μl nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
    7. Legen Sie die Platte erneut auf das magnetische Gestell, bis sich die Kügelchen trennen, und gewinnen Sie das Eluat in einer neuen PCR-Platte für die Bibliotheks-QC zurück.
    8. Führen Sie einen TapeStation- oder Fragment-Analyzer-Assay durch, um die Größenverteilung und Konzentration der cDNA-Bibliothek zu bewerten (empfohlen: TapeStation D1000 hochempfindlicher Assay). Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. Im Durchschnitt ist mit einer Ausbeute von 10 ng zu rechnen.
      HINWEIS: HALTEPUNKT: Das PCR-Produkt kann bei - 20 °C gelagert werden.

4. Sequenzierung und Datenvorverarbeitung

  1. Sequenzierung
    HINWEIS: Die folgende Richtlinie gilt für alle Illumina-Geräte für die Short-Read-Sequenzierung. Wenn die Instrumentierung nicht verfügbar ist, kann die Sequenzierung von einer externen Sequenziereinrichtung durchgeführt werden. Es könnten auch andere Sequenzierungsansätze verwendet werden. Der Einfachheit halber haben wir uns entschieden, nur über die am weitesten verbreitete Sequenzierungstechnologie zu berichten.
    HINWEIS: Die folgenden Schritte im Zusammenhang mit der Softwarenutzung beschreiben das Verfahren auf einem Illumina NovaSeq6000 Sequenzer.
    1. Fassen Sie eindeutig indizierte Bibliotheken in einem äquimolaren Verhältnis gemäß den in Schritt 3.6.8 erhaltenen Ergebnissen zusammen.
    2. Messen Sie die Konzentration des endgültigen Pools mit einem hochempfindlichen Assay, um die Molarität der Probe wie folgt zu berechnen:
      figure-protocol-2
    3. Belasten Sie die Durchflusszelle gemäß den Spezifikationen des Geräts und der experimentellen Optimierung. Beispiele für Belastungskonzentrationen gängiger Instrumente sind in Tabelle 9 aufgeführt.
    4. Wählen Sie durch Berühren des Bildschirms Sequenz aus, um das Ausführungs-Setup zu starten.
    5. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm und laden Sie die Durchflusszelle, die Sequenz-für-Synthese-Kassette, die Clustering-Kassette und die Pufferkassette und stellen Sie sicher, dass die Abfallbehälter leer sind.
    6. Sobald alle Reagenzien vom Gerät erkannt wurden, klicken Sie auf Run Setup. Definieren Sie hier den Ausführungsnamen und den Ausgabeordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen.
    7. Definieren Sie die Sequenzierungsdetails als paarweise mit beiden Lesevorgängen von 51 bp. Außerdem werden zwei Index-Reads mit jeweils 8 bp sequenziert.
    8. Drücken Sie auf Überprüfen, und nachdem Sie überprüft haben, ob alle Sequenzierungsdetails korrekt sind, klicken Sie auf Start Run.
      HINWEIS: Die empfohlene Sequenzierungstiefe beträgt 5 x 106 Reads/Sample, mit einem Minimum von 1 x 106 Reads/Sample.
  2. Datenvorverarbeitung
    1. Transformieren Sie rohe Sequenzierungsdaten in das FASTQ-Format und demultiplexen Sie sie entsprechend den Beispielindizes mit dem Tool Bcl2Fastq2. Führen Sie das Demultiplexing mit den Standardeinstellungen durch. Detaillierte Anweisungen zu Bcl2Fastq2 finden Sie im Referenzhandbuch.
      HINWEIS: Die FASTQ-Konvertierung und das Demultiplexing werden in der Regel von der Sequenzierungseinrichtung durchgeführt, wenn die Sequenzierung nicht intern durchgeführt wird. Sequenziereinrichtungen stellen in der Regel demultiplexiertes FASTQ zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung.
    2. Es stehen mehrere Optionen für den Datenabgleich und die Quantifizierung der Häufigkeit von Sequenzierungs-Reads zur Verfügung (empfohlen: nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Die Pipeline bietet mehrere Optionen, verwenden Sie die Standardeinstellung mit STAR8 als ausgerichtet und Salmon9 , um die Transkripthäufigkeit zu quantifizieren.
    3. HINWEIS: Für die weitere bioinformatische Analyse stehen mehrere Methoden zur Verfügung. Es liegt nicht im Geltungsbereich dieses Protokolls, alle abzudecken (empfohlen: DEseq2-Pipeline10). Ein Standardskript, das auf dem von uns entwickelten DEseq2-Workflow basiert, ist auf GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) zu finden.

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Ergebnisse

Nach dem berichteten Protokoll wurden humane PBMCs ausgesät, mit verschiedenen immunmodulatorischen Medikamenten behandelt und nach unterschiedlichen Inkubationszeiten für die Transkriptomanalyse unter Verwendung des Sequenzierungsprotokolls geerntet (Abbildung 1).

Ideale Wirkstoffkonzentrationen und Inkubationszeiten für Testsubstanzen sollen im Vorfeld dieses Protokolls mit Hilfe komplementärer experimenteller Strategien und basierend auf der spezifischen wissen...

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Diskussion

Die Arzneimittelforschung und -entwicklung kann stark von der ganzheitlichen Sicht auf zelluläre Prozesse profitieren, die die Bulk-Transkriptomik bieten kann. Dieser Ansatz wird jedoch oft durch die hohen Kosten des Experiments mit dem Standard-Bulk-RNA-seq-Protokoll eingeschränkt, was seine Anwendung im akademischen Umfeld sowie sein Potenzial für industrielle Skalierbarkeit verbietet.

Die kritischsten Schritte des Protokolls sind das Auftauen der Zellen und die ersten Schritte der Bibliothe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.

Danksagungen

J.L.S. wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie (EXC2151-390873048) sowie im Rahmen von SCHU 950/8-1 gefördert; GRK 2168, TP11; SFB 1454 Metaflammation, IGK GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, das BMBF-geförderte Exzellenzprojekt Ernährung-Körper-Gehirn (DietBB); und das EU-Projekt SYSCID unter der Fördernummer 733100. M.B. wird von der DFG gefördert (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. wird gefördert durch die DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Projektnummer 513977171) und die Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder (EXC2151-390873048). Bilder, die mit BioRender.com erstellt wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
50 mL konisches Röhrchenfisher scientific10203001
selbstklebende PCR-PlattendichtungenThermo Fisher ScientificAB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 Proben)
AMPure XP beadsBeckman CoulterA 63881
Betain Sigma-Aldrich61962
96-Well-Platten für ZellkulturenThermo Fisher Scientific260860
Zellkultur-Vakuumpumpe (VACUSAFE)Integra Bioscience158300
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) mischen je 10 mMFermentasR0192
DMSOSigma-Aldrich276855
DTT (100 mM)Invitrogen18064-014
EDTASigma-Aldrich798681für adhärente Zellen
EthanolSigma-Aldrich51976
Fötales RinderserumThermo Fisher Scientific26140079
Filterspitzen (10 & Mikro; L)Gilson 
Filterspitzen (100 & Mikro; L)Gilson 
Filterspitzen (20 & Mikro; L)Gilson 
Filterspitzen (200 & Mikro; L)Gilson 
GuanidinhydrochloridSigma-AldrichG3272
ISPCR Grundierung (10 & Mikro; M)Biomers.net GmbHSP100065′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)KAPA BiosystemsKK2601
Magnesiumchlorid (MgCl2) Sigma-AldrichM8266
Magnetischer Ständer 96AmbionAM10027
Neutralize Tagment (NT) Puffer IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 Proben), alternativ 0,2 % SDS
Nextera-kompatibler IndexierungsprimerIllumina
Nukleasefreies WasserInvitrogen10977049
PBSThermo Fisher ScientificAM9624
PCR 96-Well-PlattenThermo Fisher ScientificAB0600
PCR-PlattenversiegelungThermo Fisher ScientificHSF0031
Penicillin / Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063
Qubit 4 FluorometerInvitrogen15723679
rekombinanter RNase-Inhibitor (40 U/ul)TAKARA2313A
RPMI-1640 ZellkulturmediumGibco61870036Wenn nicht mit PBMCs gearbeitet wird, passen Sie es an den Zelltyp an.
SMART dT30VN PrimerSigma-Aldrich5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standard Laborausstattungdiversediversez.B. Zentrifuge, Eismaschine, Eiskübel, destilliertes Wasser, Wasserbad
SuperScript II Reverse Transkriptase (SSRT II)Thermo Fisher Scientific18064-014
SuperScript II Reverse Transkriptase (SSRT II) Puffer (5x)Thermo Fisher Scientific18064-014
Tagment DNA-Puffer (TD)IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA-Bibliotheksvorbereitungskit (96 Proben)
TapeStation-System 4200AgilentG2991BA
Thermocycler (S1000)Bio-Rad1852148
TSO-LNA (100 μM)Eurogentec5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 MischpultSigma-AldrichZ258415
F171203F171403F171303F171503

Referenzen

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
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