Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Abstract

Die Transkriptomik ermöglicht es, umfassende Einblicke in zelluläre Programme und deren Reaktionen auf Störungen zu erhalten. Obwohl die Kosten für die Herstellung und Sequenzierung von Bibliotheken in den letzten zehn Jahren erheblich gesunken sind, ist die Anwendung dieser Technologien in dem für das Drogenscreening erforderlichen Umfang nach wie vor unerschwinglich teuer, was das immense Potenzial dieser Methoden behindert. Unsere Studie stellt ein kostengünstiges System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening vor, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik kombiniert. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informative biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Wirkstoffe und neuer Moleküle. Abhängig von der gewählten Behandlung und der Inkubationszeit führt dieses Protokoll innerhalb von ca. 2 Tagen zur Sequenzierung von Bibliotheken. Durch mehrere Haltepunkte innerhalb dieses Protokolls kann sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Sequenzierung zeitunabhängig durchgeführt werden. Die gleichzeitige Verarbeitung einer hohen Anzahl von Proben ist möglich; Die Messung von bis zu 384 Proben wurde ohne Verlust der Datenqualität getestet. Es gibt auch keine bekannten Beschränkungen für die Anzahl der Erkrankungen und/oder Medikamente, trotz der Berücksichtigung der Variabilität der optimalen Inkubationszeiten von Arzneimitteln.

Introduction

Die Entwicklung neuer Arzneimittel ist ein komplexer und zeitaufwändiger Prozess, der die Identifizierung potenzieller Arzneimittel und ihrer Ziele, die Optimierung und Synthese von Arzneimittelkandidaten sowie die Prüfung ihrer Wirksamkeit und Sicherheit in präklinischen und klinischen Studien umfasst¹. Traditionelle Methoden für das Wirkstoff-Screening, d. h. die systematische Bewertung von Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten für therapeutische Zwecke, beinhalten die Verwendung von Tiermodellen oder zellbasierten Assays, um die Auswirkungen auf bestimmte Ziele oder Signalwege zu testen. Diese Methoden waren zwar erfolgreich bei der Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, lieferten aber oft keine ausreichenden Einblicke in die komplexen molekularen Mechanismen, die der Wirksamkeit von Medikamenten sowie der Toxizität und den Mechanismen potenzieller Nebenwirkungen zugrunde liegen.

Die Bewertung genomweiter Transkriptionszustände stellt einen leistungsstarken Ansatz dar, um die derzeitigen Einschränkungen des Wirkstoffscreenings zu überwinden, da sie eine umfassende Bewertung der Genexpression als Reaktion auf Arzneimittelbehandlungen ermöglicht². Durch die Messung von RNA-Transkripten in einer genomweiten Weise, die zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird, zielt die Transkriptomik darauf ab, einen ganzheitlichen Überblick über die transkriptionellen Veränderungen zu erhalten, die als Reaktion auf Medikamente auftreten, einschließlich Änderungen der Genexpressionsmuster, alternatives Spleißen und nicht-kodierender RNA-Expression³. Diese Informationen können verwendet werden, um Arzneimittelziele zu bestimmen, die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln vorherzusagen und die Dosierung und Behandlung von Medikamenten zu optimieren.

Einer der Hauptvorteile der Kombination von Transkriptomik und unvoreingenommenem Wirkstoff-Screening ist das Potenzial, neue Wirkstoffziele zu identifizieren, die bisher nicht in Betracht gezogen wurden. Herkömmliche Wirkstoff-Screening-Ansätze konzentrieren sich oft auf etablierte Zielmoleküle oder -wege, was die Identifizierung neuer Zielmoleküle behindert und möglicherweise zu Medikamenten mit unvorhergesehenen Nebenwirkungen und eingeschränkter Wirksamkeit führt. Die Transkriptomik kann diese Einschränkungen überwinden, indem sie Einblicke in die molekularen Veränderungen liefert, die als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung auftreten, und potenzielle Ziele oder Signalwege aufdeckt, die bisher möglicherweise nicht in Betracht gezogen wurden².

Neben der Identifizierung neuer Wirkstoffziele kann die Transkriptomik auch zur Vorhersage der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten verwendet werden. Durch die Analyse der Genexpressionsmuster, die mit Arzneimittelreaktionen verbunden sind, können Biomarker entwickelt werden, mit denen das Ansprechen eines Patienten auf ein bestimmtes Medikament oder Behandlungsschema vorhergesagt werden kann. Dies kann auch dazu beitragen, die Medikamentendosierung zu optimieren und das Risiko unerwünschter Nebenwirkungen zu verringern⁴.

Trotz ihrer potenziellen Vorteile bleiben die Kosten der Transkriptomik ein erhebliches Hindernis für ihre breite Anwendung im Wirkstoffscreening. Die Transkriptomanalyse erfordert spezielle Geräte, technisches Fachwissen und Datenanalysen, was es für kleinere Forschungsteams oder Organisationen mit begrenzten Mitteln schwierig machen kann, Transkriptomik im Arzneimittelscreening einzusetzen. Die Kosten für die Transkriptomik sind jedoch stetig gesunken, was sie für die Forschungsgemeinschaften zugänglicher macht. Darüber hinaus haben Fortschritte in der Technologie und in den Datenanalysemethoden die Transkriptomik effizienter und kostengünstiger gemacht, wodurch ihre Zugänglichkeit weiter verbessert^{wurde 2}.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein hochdimensionales und exploratives System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik-Analyse kombiniert ^5,6. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kosten pro Probe auf 1/^{6 der derzeitigen} Kosten kommerzieller Lösungen für die mRNA-Sequenzierung in voller Länge zu senken. Das Protokoll erfordert nur Standard-Laborgeräte, die einzige Ausnahme ist die Verwendung von Short-Read-Sequenzierungstechnologien, die ausgelagert werden können, wenn Sequenziergeräte nicht im eigenen Haus verfügbar sind. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informationsreiche biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Medikamente und neuer Moleküle.

Ziel des Experiments ist es, die Wirkstoffaktivität auf PBMCs in verschiedenen biologischen Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf jede biologische Fragestellung angewendet werden, bei der mehrere Medikamente mit einer transkriptomischen Auslesung getestet werden sollten, um einen transkriptomweiten Überblick über die zelluläre Wirkung der Behandlung zu erhalten.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der lokalen Ethikkommissionen der Universität Bonn.

1. Vorbereitung von Puffern, Lösungen und Geräten

1. Bereiten Sie die Lösungen vor und sammeln Sie die Materialien, die in der Materialtabelle beschrieben sind.
2. Das Wasserbad auf 37 °C erhitzen und das komplette Wachstumsmedium erwärmen (RPMI-1640 + 10 % fötales Kälberserum (FCS) + 1 % Penicillin/Streptomycin).
3. Verwenden Sie für die Zellernte eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   HINWEIS: Sorgen Sie für eine saubere Umgebung, während Sie mit Zellen arbeiten, um die Sterilität zu gewährleisten.

2. Handhabung der Zellen

HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Kryokonservierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) aus menschlichem Blut finden Sie in⁷.

1. Auftauen und Zählen von Zellen
   1. Nehmen Sie die Kryoröhrchen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie im Wasserbad bei 37 °C für 2 - 3 min unter vorsichtigem Umdrehen auf.
   2. Die aufgetauten Zellen werden in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt.
   3. Spülen Sie das Kryoröhrchen mit 1 ml warmem, vollständigem Wachstumsmedium und geben Sie diese Lösung tropfenweise zu den Zellen im Röhrchen (1^. Verdünnungsschritt).
   4. Wiederholen Sie die Verdünnung 1:1, bis ein Volumen von 32 ml erreicht ist (insgesamt 5 Verdünnungen mit jeweils 1, 2, 4, 8 und 16 ml warmem, vollständigem Wachstumsmedium). Geben Sie das Medium tropfenweise hinzu, um die Zellstörung zu reduzieren, während Sie das konische Röhrchen leicht bewegen.
   5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 min lang (300 x g, 20 °C) und entfernen Sie den Überstand, indem Sie das konische Röhrchen in einer fließenden Bewegung vorsichtig kippen.
   6. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml warmem, vollständigem Wachstumsmedium und fahren Sie mit der Zellzählung fort.
   7. Mischen Sie zum Zählen 10 μl Zellsuspension mit Trypanblau (1:2 bis 1:10 Verdünnung je nach Dichte der Zellsuspension), um lebende von toten Zellen während des Zählens zu unterscheiden. Abgestorbene oder beschädigte Zellen erscheinen aufgrund der Aufnahme des Farbstoffs blau, während lebenswichtige Zellen nicht gefärbt sind.
      HINWEIS: Trypanblau ist leicht zytotoxisch, gefärbte Zellen sollten nicht länger als 5 Minuten gelagert werden.
   8. Zählen Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einer Zählkammer unter Verwendung von 10 μl gefärbter Zelllösung.
      1. Wenn Sie die Neubauer-verbesserte Zellkammer verwenden, zählen Sie alle Zellen innerhalb der vier großen Quadrate, die sich an den Ecken befinden, und verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Konzentration der Zellsuspension zu berechnen.
         
   9. Verdünnen Sie die Zellen mit warmem, vollständigem Wachstumsmedium auf eine Endkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml. Zentrifugieren Sie nur, wenn das erforderliche Volumen kleiner als 3 ml ist, und resuspendieren Sie das Zellpellet auf das richtige Volumen.
2. Zellaussaat und -behandlung
   1. 100 μl Zellsuspension pro Well in eine 96-Well-Zellkulturplatte (1 x 10⁵ Zellen/Well) geben.
      HINWEIS: Die Zellzahl für die Aussaat wurde für PBMC-Kulturen optimiert. Während niedrige Zellkonzentrationen keine ausreichende Menge an RNA für die Sequenzierung liefern, erhöht eine übermäßige Anzahl von Zellen das Risiko einer suboptimalen Zelllyse und der Hemmung der reversen Transkriptionsreaktion.
   2. Bereiten Sie Arzneimittelverdünnungen in einer Konzentration vor, die doppelt so hoch ist wie die für die Behandlung verwendete Konzentration (2x). Wählen Sie das Lösungsmittel entsprechend der Löslichkeit der Verbindung, vorzugsweise vollständiges Nährmedium.
      HINWEIS: PBS oder Dimethylsulfoxid (DMSO) kann verwendet werden, wenn sonst keine ausreichende Löslichkeit erreicht werden kann. Die maximale Konzentration von DMSO im resultierenden Inkubationsvolumen sollte 0,5 % nicht überschreiten, um eine durch das Lösungsmittel induzierte Zytotoxizität zu vermeiden.
   3. 100 μl der 2-fachen Wirkstoffverdünnung (Endkonzentration in der Vertiefung 1X) zugeben und bei 37 °C für die definierte Zeit inkubieren.
      HINWEIS: Ergänzende Untersuchungen sollten durchgeführt werden, um die optimale Inkubationszeit des Arzneimittels zu ermitteln und mögliche Mechanismen der Zytotoxizität auszuschließen.
3. Zellernte und -lyse
   1. Die Zellkulturplatte wird 10 min (300 x g, 20 °C) zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe, indem Sie die Platte in einem Winkel (30°-45°) halten, während Sie die Spitze auf die untere Ecke der Vertiefung richten, um so wenig Zellen wie möglich zu entfernen.
   2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl eiskaltes PBS in jede Vertiefung geben und die Platte 5 Minuten lang zentrifugieren (300 x g, 4 °C). Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe, wobei Sie die Platte in einem spitzen Winkel halten, um so viel PBS wie möglich zu entfernen.
   3. Bereiten Sie den Lysepuffer, wie in Tabelle 1 beschrieben, für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen (rxn) vor, wobei 10 % Überschuss hinzugefügt werden.
   4. Geben Sie 15 μl Lysepuffer in jede Vertiefung und versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Dichtungsfolie, um die Proben vor Kontamination zu schützen. Die Platte vor dem Zentrifugieren 1 min (1000 x g, 4 °C) vortexen und 5 min auf Eis inkubieren.
   5. Sammeln Sie 6 μl lysierte Zelllösung in einer PCR-Platte und frieren Sie das Zelllysat kurz bei -80 °C ein, um eine optimale Zelllyse zu gewährleisten. Achten Sie darauf, mehrere Einfrierzyklen der Platten zu vermeiden.
      HINWEIS: STOPPPUNKT: Wenn die cDNA-Produktion nicht nachträglich durchgeführt wird, kann das Zelllysat bis zu mehreren Monaten bei -80 °C gelagert werden, ohne dass die RNA-Qualität wesentlich abnimmt.

3. Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung

1. Reverse-Transkriptase-Reaktion (RT)
   HINWEIS: Wenn Sie mit RNA arbeiten, legen Sie alle Proben auf Eis und stellen Sie sicher, dass Sie nukleasefreie Geräte (sterile Einweg-Plastikwaren) und Wasser verwenden.
   1. Bereiten Sie die RT-Reaktionsmischung wie in Tabelle 2 beschrieben für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen unter Zugabe von 10 % Überschreitung vor. Die Mischung kurz vortexen und kurz herunterschleudern. Bewahren Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis auf.
   2. Tauen Sie das Zelllysat bei Raumtemperatur (RT) auf und schleudern Sie es kurz herunter, um das gesamte Zelllysat am Boden der Platte zu sammeln.
   3. Führen Sie die mRNA-Denaturierung auf einem Thermocycler gemäß Tabelle 3 durch.
   4. Nehmen Sie die Platte aus dem Thermocycler und drehen Sie sie kurz nach unten, um potenzielles Kondensat aufzufangen. Geben Sie 6 μl RT-Reaktionsmischung in jede Vertiefung, um ein Endvolumen von 12 μl zu erhalten. Versiegeln Sie die Platte, um die Platte zu schützen und Verdunstung, Wirbel und Schleudern zu vermeiden.
   5. Legen Sie die Platte auf den Thermocycler und starten Sie das RT-Reaktionsprogramm gemäß Tabelle 3.
2. Vorverstärkung
   1. Tauen Sie den High-Fidelity-DNA-Polymerase- und In-situ-PCR-Primer (ISPCR) bei Raumtemperatur auf.
   2. Bereiten Sie die Voramplifikationsmischung gemäß Tabelle 4 für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen vor und fügen Sie 10 % Überschuss hinzu. Den Mix kurz vortexen und runterschleudern.
      HINWEIS: Die Enzymmischung ist bei Raumtemperatur stundenlang stabil.
   3. Schleudern Sie die PCR-Platte, geben Sie 15 μl der Voramplifikationsmischung in jede Vertiefung und versiegeln Sie die Platte.
   4. Setzen Sie es auf den Thermocycler und starten Sie die Vorverstärkungsreaktion gemäß Tabelle 5.
      1. Passen Sie die Anzahl der Zyklen aufgrund des RNA-Gehalts an. Beginnen Sie mit einer niedrigeren Zahl und erhöhen Sie sie, wenn die cDNA-Ausbeute nicht ausreicht.
         HINWEIS: Unserer Erfahrung nach sollte für jeden Zelltyp die optimale Anzahl von Zyklen festgelegt werden, die Versuchsbedingungen und die Behandlung haben keinen Einfluss auf die optimale Anzahl von Zyklen. Wir empfehlen daher, die optimale Anzahl von Zyklen experimentell zu bestimmen, wenn dieses Protokoll für einen neuen Zelltyp erstellt wird. Im Allgemeinen benötigen Primärzellen im Vergleich zu Zelllinien eine höhere Anzahl von Zyklen. HALTEPUNKT: Das Vorverstärkungsprodukt kann bei - 20 °C gelagert werden.
3. cDNA-Aufreinigung und Qualitätskontrolle (QC)
   HINWEIS: Die Probenreinigung kann für jede Platte nacheinander durchgeführt werden, da die Proben in diesem Stadium ziemlich stabil sind. Eine Erhöhung der Anzahl der Proben führt zu einer längeren Dauer des Protokolls, schränkt jedoch die Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden können, nicht ein.
   1. Bevor Sie beginnen, bringen Sie die magnetischen Reinigungsperlen auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie 1 Minute lang auf hoher Geschwindigkeit, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren.
   2. Geben Sie 0,8x v/v (20 μl) magnetische Reinigungsperlen in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
   3. Legen Sie die PCR-Platte für 5 Minuten auf ein magnetisches Gestell, bis die Kügelchen vollständig getrennt sind. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
   4. Halten Sie die Platte auf dem Magnetgestell und fügen Sie vorsichtig 100 μl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu, um die Perlen zu waschen und 30 s lang zu inkubieren. Verwenden Sie eine Pipette mit kleinem Volumen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang für einen weiteren Waschschritt. Achten Sie darauf, so viel Ethanol wie möglich zu entfernen.
   5. Trocknen Sie die Perlen auf dem Magnetgestell bei Raumtemperatur bis zu 5 Minuten an der Luft, bis das Ethanol vollständig verdampft ist und die Perlen nicht mehr glänzen.
   6. Nehmen Sie die Platte aus dem magnetischen Gestell, suspendieren Sie die Kügelchen in 20 μl nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
   7. Legen Sie die Platte wieder auf das Magnetgestell, bis sich die Perlen getrennt haben.
   8. Rückgewinnung des Eluats in einer neuen PCR-Platte für die cDNA-Qualitätskontrolle und Markierung.
   9. Führen Sie einen TapeStation- oder FragmentAnalyser-Assay durch, um die Größenverteilung und Konzentration der cDNA-Bibliothek zu bewerten (empfohlen: TapeStation D5000-Assay). Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. Es ist mit einer typischen Ausbeute von 20 ng zu rechnen.
4. Tagmentation mit Kit
   HINWEIS: Andere Tagmentierungsprotokolle können verwendet werden, wenn sie bereits etabliert sind.
   1. Verdünnen Sie die cDNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 150 - 300 pg/μl.
   2. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 6 vor, um einen sofortigen Start der Markierungsreaktion nach Zugabe der cDNA zur Enzymmischung zu gewährleisten.
   3. Bereiten Sie die Tagmentierungsmischung gemäß Tabelle 7 für die Anzahl der erforderlichen Reaktionen vor und fügen Sie 10 % Überschuss hinzu.
   4. Geben Sie 3 μl der Tagmentierungsmischung pro Reaktion auf eine neue PCR-Platte und fügen Sie jeder Reaktion 1 μl cDNA hinzu.
   5. Starten Sie die Markierungsreaktion unmittelbar nach Zugabe der cDNA.
   6. Inaktivieren Sie die Reaktion durch Zugabe von 1 μl neutralisierendem Tagment-Puffer (NT; alternativ können auch 0,2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet werden).
5. Anreicherungs-PCR
   1. Bereiten Sie die Anreicherungs-PCR-Mischung Tabelle 7 für die Anzahl der Reaktionen vor und fügen Sie 10 % Überschuss hinzu. (Empfohlen: Nextera UDI-Set, um Index-Hopping auf gemusterten Durchflusszellen (z. B. Illumina NovaSeq 6000)) zu verhindern).
   2. Zu jeder Reaktion werden 9 μl der Anreicherungs-PCR-Mischung gegeben, um ein Gesamtvolumen von 14 μl zu erhalten.
   3. Führen Sie das Anreicherungs-PCR-Programm gemäß Tabelle 8 aus.
      HINWEIS: Für die Anreicherungs-PCR sind 16 Zyklen Standard. Wenn die cDNA-Qualität schlecht ist, können zusätzliche Zyklen hinzugefügt werden.
6. Bereinigung und Qualitätskontrolle
   1. Bevor Sie beginnen, bringen Sie die magnetischen Reinigungsperlen auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie 1 Minute lang auf hoher Geschwindigkeit, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren.
   2. 1,0x v/v (14 μl) magnetische Reinigungskügelchen zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Gestell und warten Sie 5 Minuten, bis die Perlen vollständig getrennt sind. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
   4. Halten Sie die Platte auf dem Magnetgestell und fügen Sie vorsichtig 100 μl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu, um die Perlen zu waschen und 30 s lang zu inkubieren. Verwenden Sie eine Pipette mit kleinem Volumen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang für einen weiteren Waschschritt. Achten Sie darauf, so viel Ethanol wie möglich zu entfernen.
   5. Trocknen Sie die Perlen bei Raumtemperatur für 3 Minuten an der Luft oder bis sie nicht mehr glänzen.
   6. Nehmen Sie die Platte aus dem magnetischen Gestell, suspendieren Sie die Kügelchen in 20 μl nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
   7. Legen Sie die Platte erneut auf das magnetische Gestell, bis sich die Kügelchen trennen, und gewinnen Sie das Eluat in einer neuen PCR-Platte für die Bibliotheks-QC zurück.
   8. Führen Sie einen TapeStation- oder Fragment-Analyzer-Assay durch, um die Größenverteilung und Konzentration der cDNA-Bibliothek zu bewerten (empfohlen: TapeStation D1000 hochempfindlicher Assay). Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. Im Durchschnitt ist mit einer Ausbeute von 10 ng zu rechnen.
      HINWEIS: HALTEPUNKT: Das PCR-Produkt kann bei - 20 °C gelagert werden.

4. Sequenzierung und Datenvorverarbeitung

1. Sequenzierung
   HINWEIS: Die folgende Richtlinie gilt für alle Illumina-Geräte für die Short-Read-Sequenzierung. Wenn die Instrumentierung nicht verfügbar ist, kann die Sequenzierung von einer externen Sequenziereinrichtung durchgeführt werden. Es könnten auch andere Sequenzierungsansätze verwendet werden. Der Einfachheit halber haben wir uns entschieden, nur über die am weitesten verbreitete Sequenzierungstechnologie zu berichten.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte im Zusammenhang mit der Softwarenutzung beschreiben das Verfahren auf einem Illumina NovaSeq6000 Sequenzer.
   1. Fassen Sie eindeutig indizierte Bibliotheken in einem äquimolaren Verhältnis gemäß den in Schritt 3.6.8 erhaltenen Ergebnissen zusammen.
   2. Messen Sie die Konzentration des endgültigen Pools mit einem hochempfindlichen Assay, um die Molarität der Probe wie folgt zu berechnen:
      
   3. Belasten Sie die Durchflusszelle gemäß den Spezifikationen des Geräts und der experimentellen Optimierung. Beispiele für Belastungskonzentrationen gängiger Instrumente sind in Tabelle 9 aufgeführt.
   4. Wählen Sie durch Berühren des Bildschirms Sequenz aus, um das Ausführungs-Setup zu starten.
   5. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm und laden Sie die Durchflusszelle, die Sequenz-für-Synthese-Kassette, die Clustering-Kassette und die Pufferkassette und stellen Sie sicher, dass die Abfallbehälter leer sind.
   6. Sobald alle Reagenzien vom Gerät erkannt wurden, klicken Sie auf Run Setup. Definieren Sie hier den Ausführungsnamen und den Ausgabeordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen.
   7. Definieren Sie die Sequenzierungsdetails als paarweise mit beiden Lesevorgängen von 51 bp. Außerdem werden zwei Index-Reads mit jeweils 8 bp sequenziert.
   8. Drücken Sie auf Überprüfen, und nachdem Sie überprüft haben, ob alle Sequenzierungsdetails korrekt sind, klicken Sie auf Start Run.
      HINWEIS: Die empfohlene Sequenzierungstiefe beträgt 5 x 10⁶ Reads/Sample, mit einem Minimum von 1 x 10⁶ Reads/Sample.
2. Datenvorverarbeitung
   1. Transformieren Sie rohe Sequenzierungsdaten in das FASTQ-Format und demultiplexen Sie sie entsprechend den Beispielindizes mit dem Tool Bcl2Fastq2. Führen Sie das Demultiplexing mit den Standardeinstellungen durch. Detaillierte Anweisungen zu Bcl2Fastq2 finden Sie im Referenzhandbuch.
      HINWEIS: Die FASTQ-Konvertierung und das Demultiplexing werden in der Regel von der Sequenzierungseinrichtung durchgeführt, wenn die Sequenzierung nicht intern durchgeführt wird. Sequenziereinrichtungen stellen in der Regel demultiplexiertes FASTQ zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung.
   2. Es stehen mehrere Optionen für den Datenabgleich und die Quantifizierung der Häufigkeit von Sequenzierungs-Reads zur Verfügung (empfohlen: nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Die Pipeline bietet mehrere Optionen, verwenden Sie die Standardeinstellung mit STAR⁸ als ausgerichtet und Salmon⁹ , um die Transkripthäufigkeit zu quantifizieren.
   3. HINWEIS: Für die weitere bioinformatische Analyse stehen mehrere Methoden zur Verfügung. Es liegt nicht im Geltungsbereich dieses Protokolls, alle abzudecken (empfohlen: DEseq2-Pipeline¹⁰). Ein Standardskript, das auf dem von uns entwickelten DEseq2-Workflow basiert, ist auf GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) zu finden.

Results

Nach dem berichteten Protokoll wurden humane PBMCs ausgesät, mit verschiedenen immunmodulatorischen Medikamenten behandelt und nach unterschiedlichen Inkubationszeiten für die Transkriptomanalyse unter Verwendung des Sequenzierungsprotokolls geerntet (Abbildung 1).

Ideale Wirkstoffkonzentrationen und Inkubationszeiten für Testsubstanzen sollen im Vorfeld dieses Protokolls mit Hilfe komplementärer experimenteller Strategien und basierend auf der spezifischen wissenschaftlichen Fragestellung identifiziert werden. In den meisten Fällen sollte eine 2-4-stündige und 24-stündige Inkubation eine Darstellung des frühen und späten transkriptionellen Ansprechens auf die Behandlung liefern.

Die wichtigsten Ergebnisse zur Bewertung der korrekten Ausführung des Protokolls sind die cDNA- und Bibliotheks-QCs (Abbildung 2 und Abbildung 3). Das cDNA-Profil sollte eine breite Verteilung mit einer durchschnittlichen Größe von > 1000 bp aufweisen (Abbildung 2), eine niedrigere durchschnittliche Größe oder Anhäufung von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht (Abbildung 4) könnte auf einen niedrigen RNA-Eintrag oder RNA-Abbau hinweisen.

Die Vorbereitung einer guten Sequenzierungsbibliothek ist ebenfalls ein wichtiger Schritt im Protokoll; Post-Tagmentation-Bibliotheken sollten eine eher enge Verteilung von etwa 250 bp aufweisen (Abbildung 3); Längere Fragmente schneiden bei der Sequenzierung schlecht ab (Abbildung 5).

Nach der Sequenzierung werden die FASTQ-Rohdateien mit dem entsprechenden Referenzgenom (z. B. Mensch oder Maus) abgeglichen und die Transkripthäufigkeit für jede Probe quantifiziert (siehe nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Es wird nun eine explorative Datenanalyse durchgeführt, um die Gesamtqualität der Daten zu überprüfen. Abgestimmte Daten sollten eine hohe Anzahl von proteinkodierenden Genen erfassen, da mit diesem Protokoll nur polyadenylierte RNA erfasst wird (Abbildung 6A). In menschlichen Proben erwarten wir, zwischen 15000 und 20000 Transkripte zu erfassen (dieser Wert basiert auf der GENCODE 27-Referenzannotation des menschlichen Genoms¹¹). Eine weitere explorative Datenanalyse kann die Hauptkomponentenanalyse (PCA) umfassen. Hier kann die zugrundeliegende Struktur der Daten in einem zweidimensionalen Plot visualisiert werden. In Abbildung 6B zeigen wir ein beispielhaftes PCA-Diagramm; Die Punkte sind hier nach Behandlung gefärbt und zeigen drei verschiedene Cluster von experimentellen Bedingungen, die zu ähnlichen transkriptomischen Profilen führen. Hier ist auch zu sehen, dass biologische Replikate (Punkte mit der gleichen Farbe) transkriptionell ähnlich sind, was eine gute Robustheit des Protokolls zeigt. Die in dieser Abbildung gezeigten Ergebnisse wurden mit einer Pipeline generiert, die auf GitHub basierend auf dem DESeq2-Workflow (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) verfügbar ist.

Abbildung 1: Zeitschätzungen und Arbeitsablauf. (A) Zeitschätzungen dieses Protokolls für einen Lauf mit 96 Stichproben. (B) Diagramm der einzelnen Schritte innerhalb des Protokolls vom Auftauen der Zellen bis zur Datenvorverarbeitung. Das Diagramm sollte von oben nach unten gelesen werden, indem man den Pfeilen folgt. Kreisförmige Pfeile beschreiben eine Wiederholung des Schrittes. Rote Punkte stellen Haltepunkte dar, die im Protokoll näher beschrieben sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispielhafte Ergebnisse für cDNA-Bibliotheken. Ergebnisse einer miniaturisierten Elektrophorese zeigen die Größenverteilung einer beispielhaften cDNA-Bibliothek. Obere und untere Signale stellen Marker dar, die zum Ausrichten der Probe verwendet werden. Blaue Linien zeigen die durchschnittliche Fragmentgröße an (blaue Klammern). Das cDNA-Profil zeigt eine breite Verteilung mit einer durchschnittlichen Größe von > 1000 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispielhafte Ergebnisse für Sequenzierungsbibliotheken. Ergebnisse einer miniaturisierten Elektrophorese zeigen die Größenverteilung von erfolgreich präparierten Sequenzierbibliotheken mit einer engen Verteilung und einer durchschnittlichen Größe von etwa 250 bp. Obere und untere Signale stellen Marker dar, die zum Ausrichten der Probe verwendet werden. Blaue Linien zeigen die durchschnittliche Fragmentgröße an (blaue Klammern). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispielhafte suboptimale Ergebnisse für cDNA-Bibliotheken. Die Ergebnisse einer miniaturisierten Elektrophorese zeigen die Größenverteilung einer suboptimalen cDNA-Bibliothek mit einer durchschnittlichen Größe von < 200 bp. Obere und untere Signale stellen Marker dar, die zum Ausrichten der Probe verwendet werden. Blaue Linien zeigen die durchschnittliche Fragmentgröße an (blaue Klammern). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispielhafte suboptimale Ergebnisse für Sequenzierungsbibliotheken. Ergebnisse einer miniaturisierten Elektrophorese zeigen die Größenverteilung einer suboptimalen Sequenzierungsbibliothek mit längeren Fragmenten von 200 - 1000 bp. Obere und untere Signale stellen Marker dar, die zum Ausrichten der Probe verwendet werden. Blaue Linien zeigen die durchschnittliche Fragmentgröße an (blaue Klammern). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Explorative Datenanalyse. Repräsentative Ergebnisse der explorativen Datenanalyse, die die Wirkung ausgewählter immunmodulatorischer Medikamente auf PBMCs zeigen. (A) Balkendiagramm der Anzahl der detektierten Gene (Y-Achsen), getrennt nach Gentyp (X-Achsen). (B) PCA aller Gene im Datensatz, die durch die verschiedenen medikamentösen Behandlungen gefärbt sind. Punkte mit der gleichen Farbe sind biologische Replikate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reagenz	Konzentration	Volumen [μL] /rxn
Guanidin-Hydrochlorid	80 mM	7.50
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs)	je 10 mM	6.52
SMART dT30VN Grundierung	100 μM	0.33
Nuklease-freies Wasser		0.65
Gesamtvolumen		15.00

Tabelle 1: Lysepuffer.

Reagenz	Volumen [μL] /rxn
SSRT II Puffer (5x)	2.00
DVB-T (100 mM)	0.50
Betain (5 M)	2.00
MgCl2 (1 M)	0.14
SSRT II (200 U/μL)	0.25
RNAse-Inhibitor (40 U/μL)	0.25
TSO-LNA (100 μM)	0.20
Nuklease-freies Wasser	0.66
Gesamtvolumen	6.00

Tabelle 2: Reaktionsmischung der Reversen Transkriptase (RT).

mRNA-Denaturierung
Schritt	Temperatur	Dauer
mRNA-Denaturierung	95 °C	2 Minuten
	Auf dem Eis	2 Minuten
Reverse Transkription
Schritt	Temperatur	Dauer
Reverse Transkription	42 °C	90 min
Inaktivierung von Enzymen	70 °C	15 Minuten
	4 °C	halten

Tabelle 3: Thermocycler-Programm für mRNA-Denaturierung und reverse Transkriptase (RT).

Reagenz	Volumen [μL] /rxn
High-Fidelity-DNA-Polymerase	12.50
ISPCR-Primer (10 μM)	0.15
Nuklease-freies Wasser	2.35
Gesamtvolumen	15.00

Tabelle 4: Vorverstärkungsmix.

Schritte	Temperatur	Dauer
Anfängliche Denaturierung	98 °C	3 Minuten
Denaturierung	98 °C	20 Sek.	16 – 18 Zyklen
Glühen	67 °C	20 Sek.
Erweiterung	72 °C	6 Minuten
	4 °C	halten

Tabelle 5: Vorverstärker-Thermocycler-Programm.

Schritte	Temperatur	Dauer
Tagmentierung	55 °C	8 Minuten
	4 °C	halten

Tabelle 6: Tagmentation Thermocycler-Programm.

Tagmentation-Mix
Reagenz	Volumen [μL] /rxn
Amplicon Tagment Mix (ATM)	1.0
Markierungs-DNA-Puffer (TD)	2.0
Gesamtvolumen	3.0
Anreicherung PCR-Mischung
Reagenz	Volumen [μL] /rxn
High-Fidelity-DNA-Polymerase	7.0
Nextera-kompatibler Indexierungsprimer	2.0
Gesamtvolumen	9.0

Tabelle 7: Tagmentierungsmischung und Anreicherungs-PCR-Mischung.

Schritte	Temperatur	Dauer
Heißer Start	72 °C	5 Minuten
Anfängliche Denaturierung	98 °C	30 Sek.
Denaturierung	98 °C	10 Sek.	16 Zyklen
Glühen	60 °C	30 Sek.
Erweiterung	72 °C	1 Minute
Letzte Verlängerung	72 °C	5 Minuten
	4 °C	halten

Tabelle 8: Anreicherungs-PCR-Thermocycler-Programm.

Instrument	Belastungskonzentration
MiSeq v2	10 Uhr
WeiterSeq 500/550	1,4 pM
NovaSeq 6000	1250 pM

Tabelle 9: Beispiele für Beladungskonzentrationen gängiger Sequenzierinstrumente.

Discussion

Die Arzneimittelforschung und -entwicklung kann stark von der ganzheitlichen Sicht auf zelluläre Prozesse profitieren, die die Bulk-Transkriptomik bieten kann. Dieser Ansatz wird jedoch oft durch die hohen Kosten des Experiments mit dem Standard-Bulk-RNA-seq-Protokoll eingeschränkt, was seine Anwendung im akademischen Umfeld sowie sein Potenzial für industrielle Skalierbarkeit verbietet.

Die kritischsten Schritte des Protokolls sind das Auftauen der Zellen und die ersten Schritte der Bibliotheksvorbereitung. Die Gewährleistung einer hohen Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Auftauen ist entscheidend für erfolgreiche Behandlungen und transkriptomische Analysen. Die ersten Schritte der Zellernte und der Bibliotheksvorbereitung bis zur cDNA-Synthese sind entscheidend für die Erhaltung der Integrität der RNA. In dieser Phase ist es entscheidend, das Zelllysat immer auf Eis zu halten und die Proben so schnell wie möglich zu verarbeiten. Wenn ein übermäßiger RNA-Abbau beobachtet wird, sollten Laboroberflächen und -geräte mit speziellen Produkten gereinigt werden, um die RNase-Aktivität zu hemmen.

Das hier beschriebene Protokoll ist derzeit für die medikamentöse Behandlung von PBMCs von gesunden Spendern für maximal 24 h optimiert. Um das Experiment mit einem anderen Zelltyp oder für eine längere Inkubationszeit durchzuführen, müssen die Zellzahlen für die Aussaat- und Kultivierungsbedingungen möglicherweise entsprechend optimiert werden.

Mit diesem Protokoll bieten wir einen Workflow für die transkriptomische Analyse bei der Arzneimittelbehandlung mit PBMCs unter Verwendung von Standard-Laborgeräten und ohne die Notwendigkeit kommerzieller Kits. Mit diesem Ansatz und der Vermeidung des Schritts der RNA-Aufreinigung konnten wir die Kosten erheblich senken und die parallele Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen ermöglichen.

Da dieses Protokoll auf einem In-vitro-Assay basiert, besteht seine Haupteinschränkung darin, dass es keine metabolische Verarbeitung der Medikamente bewerten kann, die zu einer unterschiedlichen Bioaktivität führen könnte. Darüber hinaus ist die Anzahl der erfassten Transkripte und die Sequenzierungstiefe geringer als bei Standard-Transkriptomik-Methoden in voller Länge, was die Verwendung dieser Daten für Anwendungen verhindert, die einen höheren Informationsgehalt erfordern, wie z. B. differentielles Spleißen oder Quantifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL konisches Röhrchen	fisher scientific	10203001
selbstklebende PCR-Plattendichtungen	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 Proben)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betain	Sigma-Aldrich	61962
96-Well-Platten für Zellkulturen	Thermo Fisher Scientific	260860
Zellkultur-Vakuumpumpe (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) mischen je 10 mM	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	für adhärente Zellen
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filterspitzen (10 & Mikro; L)	Gilson
Filterspitzen (100 & Mikro; L)	Gilson
Filterspitzen (20 & Mikro; L)	Gilson
Filterspitzen (200 & Mikro; L)	Gilson
Guanidinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR Grundierung (10 & Mikro; M)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetischer Ständer 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Puffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 Proben), alternativ 0,2 % SDS
Nextera-kompatibler Indexierungsprimer	Illumina
Nukleasefreies Wasser	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-Well-Platten	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR-Plattenversiegelung	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 Fluorometer	Invitrogen	15723679
rekombinanter RNase-Inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 Zellkulturmedium	Gibco	61870036	Wenn nicht mit PBMCs gearbeitet wird, passen Sie es an den Zelltyp an.
SMART dT30VN Primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard Laborausstattung	diverse	diverse	z.B. Zentrifuge, Eismaschine, Eiskübel, destilliertes Wasser, Wasserbad
SuperScript II Reverse Transkriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transkriptase (SSRT II) Puffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA-Puffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA-Bibliotheksvorbereitungskit (96 Proben)
TapeStation-System 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 μM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mischpult	Sigma-Aldrich	Z258415