Eine vielseitige Verhaltensmethode zur Untersuchung der Auswirkungen von Schilddrüsenhormonen auf die Kleinhirnfunktion

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für einen kürzlich entwickelten vielseitigen Verhaltenstest vor, den Leiterbalkentest. Dieser Test hat den Vorteil, dass er eine subtile zerebelläre Ataxie erkennt, die durch einen Defekt der Schilddrüsenhormonwirkung im Zentralnervensystem verursacht wird, gegenüber den herkömmlichen Verhaltenstests zur Beurteilung der motorischen Leistung.

Abstract

Die Wirkung des Schilddrüsenhormons (TH) ist während der Entwicklung des Zentralnervensystems, einschließlich des Kleinhirns, unerlässlich. Im Falle eines TH-Mangels im frühen Leben, wie z. B. einer angeborenen Hypothyreose, zeigen die Patienten neurologische Störungen wie kognitive Retardierung und motorische Defizite. Es gibt verschiedene Studien an Mausmodellen mit gewebe- oder zellspezifischem TH-Mangel, um die Rolle von TH im Kleinhirn zu untersuchen. Im Vergleich zu generalisierten angeborenen Hypothyreose-Mäusen zeigen Kleinhirnzell-spezifische TH-defiziente Mäuse mildere und subtilere ataktische Merkmale, was die Beurteilung der motorischen Funktion bei herkömmlichen Tests wie dem Rotarod-Test erschwert.

Aufgrund des Bedarfs an einem alternativen Werkzeug zur Beurteilung der motorischen Funktion in TH-bezogenen Tiermodellen haben wir eine vielseitige Verhaltensmethode namens "Ladder Beam Test" entwickelt, bei der wir die verschiedenen Leitertests je nach Schweregrad der Ataxie bei Modellmäusen gestalten können. Wir verwendeten transgene Mäuse, die einen dominant-negativen TH-Rezeptor spezifisch in der Kleinhirn-Purkinje-Zelle exprimierten, ein einziges Ausgangsneuron in der Kleinhirnrinde, das die motorische Leistung moduliert. Der neu entwickelte Leiterstrahltest konnte bei den transgenen Mäusen im Vergleich zum Rotarod-Test auf einem höheren Niveau robuste Beeinträchtigungen der motorischen Leistung nachweisen. Eine Störung des motorischen Lernens wurde auch im Leiterbalkentest festgestellt, nicht jedoch im Rotarod-Test. Das Protokoll mit diesem neuartigen Verhaltensapparat kann auf andere Tiermodelle angewendet werden, die einen milden ataktischen Phänotyp aufweisen könnten, um subtile Veränderungen der Kleinhirnfunktion zu untersuchen.

Introduction

Das Schilddrüsenhormon (TH) ist für die Entwicklung des Gehirns unverzichtbar¹. Insbesondere seine Rolle im Kleinhirn ist entscheidend, da TH-Mangel im frühen Leben zu einer aberranten Kleinhirnentwicklung führt ^1,2. Zum Beispiel zeigen Patienten bei angeborener Hypothyreose eine Reihe von neurologischen Behinderungen, einschließlich kognitiver und motorischer Defizite³. Um die Rolle von TH bei der funktionellen Entwicklung des Kleinhirns aufzudecken, haben einige Studien den TH-Mangel auf kleinhirnzellspezifische Weise begrenzt⁴. Im Vergleich zu generalisierten angeborenen Hypothyreose-Mäusen, bei denen alle Gewebe und Zellen von TH-Mangel betroffen sind, weisen solche Kleinhirn-spezifischen Modelle jedoch eine so subtile Ataxie auf, dass die konventionellen Verhaltenstests wie Rotarod-, Footprint- und Schwebebalkentests die Unterschiede kaum erkennen. Um die TH-Effekte auf die Kleinhirnfunktion vollständig untersuchen zu können, wird daher ein neues Bewertungsinstrument benötigt, um eine subtile Veränderung in der motorischen Koordination von Modellmäusen zu erkennen.

Der Rotarod-Test ist das gebräuchlichste Instrument zur Beurteilung der motorischen Koordination, das ursprünglich von Dunham und Miya⁵ entwickelt und später von Jones und Roberts⁶ auf eine beschleunigende Version angewendet wurde. Die Latenz, um von der rotierenden Stange zu fallen, wird als Test für die motorische Koordination interpretiert, und ihre Einfachheit und Prägnanz machen sie unter Verhaltensforschern, die die motorische Funktion untersuchen, häufig verwendet⁷. Die einfache Handhabung dieses Tests ist jedoch ein zweischneidiges Schwert. Da sich der Stab automatisch dreht, können sich Mäuse an dem rotierenden Stab festhalten und dort bleiben, ohne sich zu bewegen. Darüber hinaus können Mäuse beabsichtigen, herunterzufallen, anstatt weiter auf der rotierenden Stange zu balancieren. In beiden Fällen sind die Validität und Zuverlässigkeit des Tests für die Beurteilung der "reinen motorischen Koordination" ^fragwürdig7. Mit anderen Worten, es zielt nicht genau auf die Kleinhirnfunktion ab und bezieht andere Faktoren wie die Muskelkraft beim Greifen mit ein.

Anstelle der herkömmlichen Werkzeuge zur Beurteilung der motorischen Koordination präsentieren wir hier einen neuartigen Verhaltenstest namens "Leiterbalkentest", der kürzlich in unserem Labor entwickelt wurde. Der horizontale Leiterlauftest wurde entwickelt, um die komplexen motorischen Fähigkeiten des Kleinhirns zu bewerten: Feed-Forward-Vorhersage und Integration von Bewegung⁸. Das Testgerät bestand aus vier Plexiglasstücken mit Löchern (Abbildung 1). Die vier Platten wurden durch Schrauben und Stäbe, die in die Löcher der Platten gesteckt wurden, parallel verbunden. Zwei äußere Platten wurden verwendet, um das Gerät zu stabilisieren, und zwei innere Platten wurden verwendet, um die verschiedenen Arten von Leitersprossen zu entwerfen (Abbildung 2C). Die Breite der Sprosse wurde je nach Tiergröße angepasst, um das Rückwärtsbewegen der Tiere zu minimieren (Abbildung 2B). Der Abstand vom Startpunkt bis zum Ziel betrug 110 cm. Das Gerät befand sich 60 cm über der Bank und ein Sicherheitskissen wurde unter das Gerät gelegt (Abbildung 2A). Die dunkle Kammer wurde in der Nähe des Ziels platziert, um die Tiere zu motivieren, sich auf das Ziel zuzubewegen (Abbildung 2A).

Wir untersuchten die TH-Effekte auf die funktionelle Entwicklung des Kleinhirns anhand von transgenen Mäusen, die den dominant-negativen TH-Rezeptor (TR) in kleinhirnförmigen Purkinje-Zellen (Mf-1/FVB-Mäusen) exprimierten. Sowohl in Rotarod- als auch in Ladder-Beam-Tests beobachteten wir einen zerebellären ataktischen Phänotyp bei Mf-1/FVB-Mäusen; Der Leiterbalkentest konnte jedoch signifikantere Unterschiede feststellen als der Rotarod-Test (Abbildung 3). Darüber hinaus kann die motorische Lernfähigkeit im Leiterbalkentest gründlicher beurteilt werden (Abbildung 3B,C). Als zellulärer Hintergrund eines solchen Verhaltensphänotyps wurde die Induktion der Langzeitdepression (LTD) gehemmt und stattdessen die Langzeitpotenzierung (LTP) nach einer LTD-induktiven Stimulation in Mf-1/FVB-Purkinje-Zellen induziert⁹. LTD ist essentiell für die motorische Koordination und das motorische Lernen im Kleinhirn¹⁰. Viele Studien haben über motorische Defizite und die Hemmung von LTD bei Knockout- oder mutierten Mäusen für Schlüsselregulatorgene in der Kleinhirnfunktion berichtet, jedoch haben keine Studien jemals über die Induktion von LTP nach einer LTD-induktiven Stimulation berichtet^11,12. Zusammengenommen könnte dieses Phänomen nur bei Mf-1/FVB-Mäusen oder TH-defizienten Mäusen auftreten (das gleiche Phänomen wurde bei adulten Hypothyreose-Mäusen beobachtet), was darauf hindeutet, dass TH die Kleinhirnfunktion anders reguliert als die anderen Schlüsselproteine. Wenn ja, ist es plausibel, dass Mäuse mit abnormaler TH-Wirkung keine zerebelläre Ataxie in der gleichen Weise aufweisen wie andere Modellmäuse. Dies unterstreicht erneut die Notwendigkeit einer spezifischen Methode zur Beurteilung der TH-Effekte auf die Kleinhirnfunktion. In dieser Arbeit wird ein neuartiges Protokoll zur Untersuchung von TH-Effekten auf die Kleinhirnfunktion mit Hilfe des neu entwickelten Leiterstrahltests vorgestellt.

Protocol

Das Tierversuchsprotokoll in der vorliegenden Studie wurde vom Animal Care and Experimentation Committee der Gunma University genehmigt. Alle Verfahren zur Pflege und Behandlung von Tieren wurden gemäß dem japanischen Gesetz über das Wohlergehen und Management von Tieren und den Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen durchgeführt, die vom Wissenschaftsrat Japans herausgegeben wurden. Die Montagezeichnung der Apparatur ist in Abbildung 1 zu finden.

1. Aufbau der Leiter

1. Prüfung der horizontalen Leiter (Abbildung 2C links)
   1. Stecken Sie Aluminiumstäbe (2 mm Durchmesser) in die Löcher an den Plexiglaswänden.
      HINWEIS: Der Intervallabstand variiert je nach Körpergröße und abhängig von der Belastung oder dem Geschlecht der getesteten Maus (siehe Tabelle 1).
   2. Passen Sie die Breite der Leitersprossen an, indem Sie den Abstand der Plexiglaswände verbreitern oder verkleinern.
      HINWEIS: Die Breite kann je nach Körpergröße variieren, abhängig von der Belastung oder dem Geschlecht der getesteten Maus (siehe Tabelle 1).
2. Zickzack-Leitertest (Abbildung 2C rechts)
   1. Stecken Sie Aluminiumstäbe (2 mm Durchmesser) in jedes dritte Loch in horizontaler und vertikaler Richtung an den Plexiglaswänden.
      HINWEIS: Der Intervallabstand variiert je nach Körpergröße je nach Stamm oder Geschlecht der getesteten Maus (siehe Tabelle 1).
   2. Passen Sie die Breite der Leitersprossen an, indem Sie den Abstand der Plexiglaswände verbreitern oder verkleinern.
      HINWEIS: Die Breite kann je nach Körpergröße, Belastung oder Geschlecht der getesteten Maus variieren (siehe Tabelle 1).
   3. Platzieren Sie die dunkle Kammer an der Zielstelle.
   4. Platzieren Sie das Kissen (kann aus einer mit Puffermaterial gefüllten Plastiktüte bestehen) zur Sicherheit 30 cm unter der Leiteraufstellung.

2. Gewöhnung (Tag 0)

HINWEIS: Es wird empfohlen, sich mindestens 1 Tag Zeit zu nehmen, um die Mäuse an den Leiteraufbau zu gewöhnen.

1. Platzieren Sie die Maus an der Kante der Leiter (Startpunkt).
2. Ermutigen Sie die Maus mit einem Luftstoß, sich auf der Leitersprosse vorwärts zu bewegen.
3. Wiederholen Sie dies, bis sich die Maus daran gewöhnt hat, auf den Leitersprossen zu laufen.

3. Messung der Motorleistung

1. Platzieren Sie die Maus an der Kante der Leiter (Startpunkt).
2. Notieren Sie die Zeit bis zum Überqueren der Leiter und die Anzahl der Fußausrutscher, wenn die Mäuse ihre Pfoten nicht platzieren können oder nach dem Platzieren auf den Aluminiumstäben ausrutschen (siehe Abbildung 2D). Wenn möglich, nehmen Sie das Video auf, um die Fehltritte anschließend zu überprüfen.
3. Wiederholen Sie nach einem Intervall von 15 Minuten die Messung (4-5 Versuche pro Tag).
4. Wiederholen Sie das Experiment für 3-4 Tage, um das motorische Lernen zu bewerten.

4. Würdigung

1. Berechnen Sie den Durchschnittswert von Zeit- und Fußrutschen pro Tag.
2. Vergleichen Sie den Durchschnittswert zwischen den Gruppen.

Results

Im Rotarod-Test zeigten Mf-1/FVB-Mäuse eine signifikante Abnahme der Latenz bis zum Sturz von der rotierenden Stange an 3 aufeinanderfolgenden Tagen im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen, was auf eine beeinträchtigte motorische Koordination hinweist (Abbildung 3A). In Bezug auf die Ergebnisse innerhalb der Gruppe verbesserten Mf-1/FVB-Mäuse ihre Leistung jedoch signifikant von Tag 1 bis Tag 3, was auf die Erhaltung des motorischen Lernens hindeutet (

Discussion

Unser Design stützte sich auf die frühere Studie von Metz und Whishaw, die über die Nützlichkeit des "Leitersprossen-Gehtests" ^{berichteten13,14}. Sie entwarfen den Leitersprossen-Gehtest, um das geschickte Gehen zu bewerten und sowohl die Platzierung der Vorder- als auch der Hintergliedmaßen, das Treten und die Koordination zwischen den Gliedmaßen zu messen, indem sie von den Tieren verlangten, auf einer horizontalen Leiter von ei...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luftpuff	DAISO
Aluminiumstäbe	CAINZ		2 mm Durchmesser, Anzahl der Stäbe kann je nach Leiterausführung variieren. Für den Bau der horizontalen Leiter können ca. 30 Stöcke erforderlich sein (Abstand von 4 cm).
Blutack	Bostik
Plexiglas	CAINZ		110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, je 2 Teile
Schrauben	CAINZ