Methodenartikel

Automatisierter Vibratomschnitt von Agarose-eingebettetem Lungengewebe für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung

DOI:

10.3791/65943

⸱

6. Oktober 2023

 ,  , 
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 2Department of Clinical Sciences, Lund University, 3Lund Stem Cell Centre, Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation, Skåne University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir haben eine Gewebeverarbeitungstechnik entwickelt, bei der ein Vibratom und in Agarose eingebettetes Lungengewebe verwendet werden, um Lungenschnitte zu erzeugen, wodurch hochauflösende Bilder der Lungenarchitektur aufgenommen werden können. Wir verwendeten Immunfluoreszenzfärbung, um die räumliche Proteinexpression anhand spezifischer Lungenstrukturmarker zu beobachten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aufgrund ihrer inhärenten strukturellen Fragilität gilt die Lunge als eines der am schwierigsten zu verarbeitenden Gewebe für mikroskopische Befundungen. Um die strukturelle Unterstützung für die Sektion zu erhöhen, werden Lungengewebestücke in der Regel in Paraffin oder OCT-Verbindung eingebettet und mit einem Mikrotom bzw. Kryostaten geschnitten. Eine neuere Technik, die als präzisionsgeschnittene Lungenschnitte bekannt ist, fügt frischem Lungengewebe durch Agarose-Infiltration strukturelle Unterstützung hinzu und bietet eine Plattform, um primäres Lungengewebe in Kultur zu erhalten. Aufgrund der Epitopmaskierung und der Gewebeverzerrung eignet sich jedoch keine dieser Techniken angemessen für die Entwicklung reproduzierbarer fortschrittlicher Lichtbildgebungsauswerte, die über mehrere Antikörper und Spezies hinweg kompatibel wären.

Zu diesem Zweck haben wir eine Tissue-Processing-Pipeline entwickelt, die die Agarose-Einbettung von fixiertem Lungengewebe in Verbindung mit automatisierten Vibratomschnitten nutzt. Dies ermöglichte die Erzeugung von Lungenschnitten mit einer Dicke von 200 μm bis 70 μm in der Lunge von Mäusen, Schweinen und Menschen, die keine Antigengewinnung erfordern und die am wenigsten "verarbeitete" Version des nativen isolierten Gewebes darstellen. Anhand dieser Schnitte zeigen wir eine Multiplex-Bildgebungsauslesung, die in der Lage ist, hochauflösende Bilder zu erzeugen, deren räumliche Proteinexpression verwendet werden kann, um die Mechanismen, die der Lungenverletzung und -regeneration zugrunde liegen, zu quantifizieren und besser zu verstehen.

Einleitung

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Ex-vivo-Lungengewebeschnitte werden in großem Umfang bei der Untersuchung von Lungenerkrankungen eingesetzt1. Derzeitige Goldstandards, insbesondere in klinischen und translationalen Großtierstudien, verwenden Hämatoxylin- und Eosinfärbung in Verbindung mit Hellfeldmikroskopie und beobachterbasiertem Scoring, um Lungenfunktionsstörungen zu beurteilen und zu bewerten 2,3. Obwohl es sich immer noch um eine wertvolle Technik handelt, weist sie Einschränkungen in Bezug auf die räumliche Auflösung und die Anzahl der Marker auf, die gleichzeitig abgebildet werden können. Darüber hinaus muss das Lungengewebe umfangreichen lösungsmittelbasierten Waschungen unterzogen werden, was zu einer Dehydrierung, Schrumpfung und Rehydratisierung des Gewebes vor der endgültigen Bildgebung führt4. Dieser Prozess ist nicht nur zeitaufwändig, sondern auch umweltschädlich, maskiert Proteinepitope und kann strukturelle Gewebeveränderungen hervorrufen 5,6,7,8. Für Lungengewebe war die Einbettung in Paraffin vor der Durchtrennung jedoch aufgrund der strukturellen Fragilität der Lunge eine Notwendigkeit. Im Gegensatz dazu können solide Organe wie das Gehirn mit einem vibrierenden Mikrotom (Vibratom) sowohl in fixiertem als auch in frischem Gewebe geschnitten werden 9,10,11,12.

Um Vibratomschnitte im Lungengewebe zu ermöglichen, wurde eine Methode namens Precision-Cut Lung Slices (PCLS) etabliert, bei der Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt über die Atemwege oder Blutgefäße in frisches Lungengewebe injiziert und dort verfestigt wird13,14. Die Agarose in den Atemwegen bietet eine ausreichende strukturelle Unterstützung, um dann eine Vibratom-Sektionzu ermöglichen 9,14. Bei Nagetieren ist dies einfach zu erreichen, da Agarose über die Luftröhre injiziert werden kann. In Schweine- und menschlichem Gewebe kann es jedoch schwierig sein, einen geeigneten Atemweg/ein geeignetes Gefäß innerhalb einer bestimmten Biopsie zu finden15,16. Selbst wenn sich ein solcher Atemweg/ein solches Gefäß befindet, ist in der Regel eine erhebliche Kraft erforderlich, um die Agarose zu injizieren, was die spätere Lungenmorphologie beeinflussen kann17.

Um die Herausforderungen bei der Einbettung/Sektion/Färbung von Paraffin und dem PCLS-Workflow zu meistern, haben wir eine neue Verarbeitungspipeline für fixiertes Lungengewebe eingerichtet. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht die Verwendung eines Vibratoms zum Schneiden, kann dünnere Schichten als bei PCLS erzeugen und liefert Schichten, die keine Antigengewinnung für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung erfordern. Diese Methode bietet eine Möglichkeit der "geringsten Verarbeitung", um Lungenschnitte zu erzeugen, die in der fortschrittlichen Lichtmikroskopie verwendet werden können. Darüber hinaus können bildgebende Messungen verwendet werden, um die räumlichen Beziehungen von Zellen und anatomischen Strukturen innerhalb des Lungengewebes zu demonstrieren, indem die volumetrische Architektur des Gewebes erfasstwird 18,19,20,21. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Erstellung dieser Lungenschnitte und demonstriert Multiplex-Färbungen, die auf jedes dieser Gewebe angewendet werden, und wie diese fortschrittlichen Bildgebungsdaten für die Quantifizierung verwendet werden können.

Protokoll

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Die Lungen von Mäusen wurden von Forschern gespendet, die andere Organsysteme verwendeten, um die 3R aufrechtzuerhalten. Alle Verfahren an Schweinen wurden in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt und vom Ethikausschuss für Tierversuche Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) genehmigt und gemäß den CODEX-Richtlinien des schwedischen Forschungsrats durchgeführt. Die Genehmigung für die Verwendung menschlicher Proben wurde von der schwedischen Nationalen Ethikkommission erteilt (Dnr 2020-07115 und Dnr 2020-01864). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung von Lösungen und Materialien

  1. Fixieren Sie das Lungengewebe 48 h lang in 4%igem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur. Anschließend wird das Lungengewebe in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt, das mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, die 0,01 % Natriumazid enthält.
  2. Bereiten Sie eine 3%ige (w/v) Agaroselösung vor, indem Sie 1,5 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 ml sterilem PBS auflösen. Bereite einen Plastikbecher, eine feine Pinzette und eine sterile Schere vor.
  3. Die Agarose in der Mikrowelle erhitzen, bis sie kocht, dann im Wasserbad auf 42 °C abkühlen. Halten Sie die Agarose in flüssiger Form, indem Sie sie bis zur Verwendung im Wasserbad aufbewahren.
    HINWEIS: Während Sie die Agarose erhitzen, beobachten Sie die Mikrowelle, bis sie zu kochen beginnt, damit sie nicht überläuft. Dies dauert in der Regel etwa 1,5 Minuten.

2. In Agarose eingebettetes Lungengewebe

  1. Heben Sie die Lungenbiopsie aus dem PBS-Azid und präparieren Sie die Lungenlappen vorsichtig mit einer feinen Pinzette und einer sterilen Schere. Schneide den Lungenlappen in kleinere Blöcke.
    HINWEIS: Während das Schneiden mit Pleura möglich ist, können die dicken Elastinbündel das Schneiden mit der Vibratomklinge behindern. Daher empfehlen wir, es zu entfernen, wenn es nicht notwendig ist.
  2. Schneiden Sie einen Plastikbecher durch die Mitte und geben Sie eine kleine Menge Agarose auf den Boden. Legen Sie den Deckel aus einem konischen 50-ml-Röhrchen (Rand entfernt) auf die Oberfläche der Agarose und lagern Sie den Becher 5 Minuten lang bei 4 °C, damit sich die Agarose für die spätere Verwendung verfestigen kann.
  3. Nehmen Sie den Plastikbecher aus dem 4 °C heißen Kühlschrank, geben Sie ca. 1 ml flüssige Agarose auf den Deckel und legen Sie dann den Lungengewebeblock vorsichtig auf den Deckel. Lassen Sie die Agarose 2-3 Minuten bei Raumtemperatur halb erstarren. Gießen Sie dann langsam die flüssige Agarose auf das Lungengewebe, bis es vollständig untergetaucht ist.
  4. Bei 4 °C ca. 15 min kühl stellen, bis die Agarose fest wird. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig mit einer scharfen Klinge die zusätzliche Agarose, die das Lungengewebe umgibt, und hinterlassen eine gleichmäßige Schicht von etwa 5 mm Dicke um das Gewebe herum (Abbildung 1).

3. Schneiden von Lungengewebeschnitten

  1. Um das Lungengewebe für die Durchtrennung vorzubereiten, wird jeder Gewebeblock mit Sekundenkleber auf der Probenscheibe des Vibratoms befestigt. Füllen Sie dann die Vibratom-Pufferschale mit PBS und legen Sie Eis in das umgebende Eisbad. Zum Schluss wird die Probenscheibe vorsichtig in die Pufferschale eingesetzt.
  2. Schneiden Sie das Lungengewebe mit dem Vibratom mit folgenden Einstellungen: Dicke: 200 μm, Frequenz: 100 Hz, Amplitude der Klinge: 1,3 mm und Vorwärtsgeschwindigkeit der Klinge von 0,02-0,03 mm/s, abhängig von der Gewebesteifigkeit.
    HINWEIS: Das Schneiden ist bis zu einer Dicke von 70 μm möglich, wenn die Klingengeschwindigkeit auf 0,01 mm/s reduziert wird. Bestimmte Vibratome (z. B. Leica V1200s) ermöglichen die Automatisierung des Schneidens durch Einstellen eines Schnittfensters.
  3. Um Schnitte zu entnehmen, übertragen Sie die Gewebescheibe vorsichtig, indem Sie sie mit einer Bürste aus dem Vibratom-Tray in eine 24-Well-Platte schöpfen, die mit 0,01 % Azid in PBS gefüllt ist. Zum Schluss konservieren Sie die Lungenschnitte bei 4 °C.

4. Immunfärbung von Elastin, CD31, HTII-280 und SMA

  1. Permeabilisieren und blockieren (1 % Rinderserumalbumin + 0,5 % Triton + 5 % normales Ziegenserum) das Gewebe bei 4 °C unter leichtem Schütteln für 45 min.
  2. Verdünnen Sie die Primärantikörper (SMA 1:500; Elastin 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) in PBS geben, 300 μl pro Vertiefung zugeben und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
  3. Ohne die Scheibe zu berühren und die Primärantikörper mit einer Pipettenspitze zu entfernen, 3 x 20 min (400 μl) mit PBS waschen.
  4. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper (1:1000) in PBS, fügen Sie 300 μl pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C unter leichtem Schütteln für 90 Minuten.
  5. Entfernen Sie die sekundären Antikörper mit einer Pipettenspitze, fügen Sie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)(1:1000) und Tomatenlektin-488 (1:500) für eine 30-minütige Inkubation hinzu und waschen Sie sie 3 x 10 Minuten lang mit PBS.
  6. Geben Sie drei Tropfen Eindeckmedium auf den Objektträger, montieren Sie ein Deckglas und fahren Sie mit der Bildgebung fort.

Ergebnisse

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Der Prozess der Erzeugung von Lungengewebeschnitten umfasst mehrere wichtige Schritte, darunter die Vorbereitung, das Einbetten und das Schneiden. Die Agaroselösung (3 % (w/v) wird durch Auflösen von 1,5 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 ml sterilem PBS hergestellt. Zu den benötigten Verbrauchsmaterialien gehören ein Plastikbecher, ein Deckel aus einem konischen 50-ml-Röhrchen (Rand entfernt), eine Pinzette und eine Schere. Das Lungengewebe wird mit einer feinen Pinzette und einer sterilen Schere vorsichtig in kleinere Blöcke zerlegt (Abbildung 1A,B). Um die Lungengewebeblöcke einzubetten, wird der Boden des Bechers mit einer kleinen Menge der Agarose gefüllt, ein Deckel wird auf die Oberfläche der Agarose gelegt und der Becher wird 5 Minuten lang bei 4 °C gelagert (Abbildung 1C). Etwa 1 ml flüssige Agarose wird auf den Deckel gegeben und der Lungengewebeblock wird auf den Deckel gelegt. Die Agarose wird 2-3 Minuten lang bei Raumtemperatur halb erstarren lassen (Abbildung 1D). Sobald ein Lungenblock durch die halberstarrte Agarose an Ort und Stelle gehalten wird, wird flüssige Agarose in den Becher gegossen, bis der Lungengewebeblock vollständig untergetaucht ist. Diese wird bei 4 °C für 15 min gelagert (Abbildung 1E,F). Die Agarose-Einbettung mit niedrigem Schmelzpunkt bietet dem Lungengewebe die notwendige Unterstützung und Steifigkeit, wodurch seine ursprüngliche Architektur während des Schneidevorgangs erhalten bleibt. Eine scharfe Klinge wird verwendet, um überschüssige Agarose zu entfernen, die das Lungengewebe umgibt. Um das Gewebe herum verbleibt eine gleichmäßige Schicht von ca. 5 mm Dicke (Abbildung 1G). Der herausgeschnittene Lungengewebsblock wird dann vorsichtig auf den Gewebehalter geklebt (Abbildung 1H). Die Vibratom-Pufferschale wird mit PBS gefüllt, Eis in das umgebende Eisbad gegeben und die Probenscheibe in die Pufferschale eingebaut (Abbildung 1I). Die auf der Platte eingestellten Parameter für das Vibratomschneiden waren: Scheibendicke: 200 μm; Frequenz: 100 Hz; Amplitude der Klinge: 1,3 mm; Fahrgeschwindigkeit der Klinge: 0,02-0,03 mm/s, abhängig von der Gewebesteifigkeit (Abbildung 1J). Abschließend erfolgt die Färbung auf frei schwebenden Scheiben (Abbildung 1K-M).

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde in 200-μm-Schnitten von jeder Spezies auf glattes Muskelaktin (SMA, ein Marker für glatte Muskelzellen und Myofibroblasten), Elastin (extrazelluläres Matrixprotein) und Lycopersicon esculentum Lektin (LEA), das an bronchoalveoläre Epithelzellen bindet, durchgeführt. Die Lunge ist ein strukturell heterogenes Gewebe und als solches wird eine unterschiedliche SMA- und Elastinverteilung über Strukturen hinweg beobachtet, einschließlich Alveolargängen, Blutgefäßen, intrapulmonalen Bronchiolen und Alveolen von Mäusen, Schweinen und Menschen (Abbildung 2A-L). Ein hochauflösendes Rendering eines 20 μm großen Volumens einer Bronchiole zeigt, wie feine Strukturen innerhalb der Lunge auf semi-dreidimensionaler Ebene untersucht werden können (Supplemental Video S1). Als quantitatives Beispiel zeigen wir mit Hilfe von Bildverfolgung, wie sich die Größe der Alveolen zwischen den Proben unterscheidet (n = 20 Alveolen) (Abbildung 2L,M).

Um zu zeigen, wie es möglich ist, diese fortschrittlichen Bildgebungsdaten quantitativ zu nutzen, verglichen wir die Zellverteilungen von Typ-2-Pneumozyten (TII) im menschlichen Lungengewebe eines Erwachsenen und eines Säuglings. Der humanspezifische Typ-2-Alveolarzell-Antikörper HTII-280 hat eine starke Affinität zur Oberfläche menschlicher Typ-2-Zellen (Abbildung 3A-F). Diese Zellen können im dreidimensionalen Raum einer einzelnen Alveole mit Hilfe der volumetrischen Bildgebung weiter betrachtet werden (Supplemental Video S2). Um die TII-Zahl zwischen den Proben von Erwachsenen und Säuglingen zu quantifizieren, haben wir die HTII-280-Zählung über 10 zufällige Sichtfelder (FOV) verarbeitet. Zwischen diesen Proben ergab die Säuglingsprobe eine signifikant höhere TII-Zellzahl (Abbildung 3G). Allerdings wies die Säuglingsprobe auch eine signifikant höhere Gerüstabdeckung auf als die des Erwachsenen, was die höhere Zellzahl erklären könnte (Abbildung 3H). Um dies zu berücksichtigen, bewerteten wir dann die Anzahl der TIIs auf der Grundlage der Gerüstabdeckung als Zellen promm2 Gewebe, die immer noch eine signifikant höhere Anzahl von TIIs in der Säuglingsprobe aufwiesen (Abbildung 3I). Die höhere TII-Zahl in der Säuglingsprobe ist also nicht auf eine erhöhte Gerüstabdeckung zurückzuführen und unterstreicht, wie wichtig es ist, die Zellverteilung in der Lunge auf der Grundlage der Fläche des Gerüsts und nicht des Gesamtsichtfelds zu beurteilen.

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Abbildung 1: Protokoll zum Schneiden von Lungengewebeschnitten. (A) Lösungen und Materialien: eine 3%ige (w/v) Agaroselösung, die durch Auflösen von 1,5 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung erhalten wird; einen Plastikbecher; einen Deckel aus einem konischen 50-ml-Röhrchen; Zange und Schere. (B) Das Lungengewebe wurde mit einer feinen Pinzette und einer sterilen Schere präpariert. (C) Füllen Sie den Boden des Bechers mit einer kleinen Menge Agarose und legen Sie den Deckel auf die Oberfläche der Agarose. lagern Sie es dann 5 Minuten lang bei 4 °C. (D) Geben Sie 1-2 ml flüssige Agarose langsam auf den Deckel, legen Sie den Lungengewebebrocken vorsichtig auf den Deckel und lagern Sie ihn 2 Minuten lang bei 4 °C. (E,F) Gießen Sie die flüssige Agarose in den Becher, bis der Lungengewebebrocken vollständig eingetaucht ist, lagern Sie ihn 15 Minuten lang bei 4 °C. und dann den Plastikbecher vorsichtig zerbrechen. (G) Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um überschüssige Agarose zu entfernen, die das Lungengewebe umgibt, und lassen Sie eine gleichmäßige Schicht von etwa 5 mm Dicke um das Gewebe zurück. (H) Der herausgeschnittene Lungengewebeblock wird dann vorsichtig auf den Gewebehalter geklebt. (I) Füllen Sie die Vibratom-Pufferschale mit PBS, legen Sie Eis in das umgebende Eisbad und setzen Sie die Probenscheibe in die Pufferschale ein. (J) Stellen Sie die Schnittparameter auf der Platte des Vibratoms ein; Schichtdicke: 200 μm, Frequenz: 100 Hz, Amplitude des Messers: 1,3 mm und Fahrgeschwindigkeit der Klinge von 0,02-0,04 mm/s. (K-M) Repräsentative Bilder einer frei schwebenden Scheibe, die noch in Agarose eingebettet ist und für die Immunfluoreszenzfärbung bereit ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Immunfluoreszenzbilder der Lungenstruktur bei Mensch, Schwein und Maus. (A-L) Repräsentative Bilder eines Alveolargangs, eines Blutgefäßes, eines Bronchiols und einer Alveole in Lungengewebeschnitten von Maus, Schwein und Mensch. SMA (grün dargestellt) ist ein Marker für glatte Muskelzellen und wird in den Gefäß- und Bronchialwänden des Lungengewebes beobachtet. Elastin (rot dargestellt) ist Teil der extrazellulären Matrix der Lunge. (M) Quantifizierung der Alveolargröße durch Auswahl von 20 zufälligen Positionen auf jedem Lungengewebeschnitt für Menschen-, Schweine- und Mausproben. Histogramme wurden verwendet, um die Verteilung der Alveolargröße innerhalb jeder Gruppe zu veranschaulichen. Maßstabsbalken = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Kruskall-Wallis-Test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon esculentum lectin; SMA = Aktin der glatten Muskulatur; ms = Maus; hmn = Mensch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3. Typ-2-Pneumozytenverteilung in menschlichen Erwachsenen- und Säuglingsproben. (A,B) Repräsentative Bilder von menschlichem Lungengewebe von Erwachsenen und Säuglingen, gefärbt auf HTII-280 (rot), CD31 (grün) und LEA (grau dargestellt). (C,D) Repräsentative Bilder von Erwachsenen und Säuglingen, die nur die Verteilung der Typ-2-Pneumozyten zeigen. (E,F) Einzelzellauflösung: repräsentative Bilder eines einzelnen Typ-2-Pneumozyten aus menschlichen Lungenproben von Erwachsenen und Säuglingen. (G) Quantifizierung der Anzahl von Typ-2-Pneumozyten zwischen Proben von Erwachsenen und Säuglingen. (H) Quantifizierung der Abdeckung des Lungengewebegerüsts (% vs. Luft) in Proben von Erwachsenen und Säuglingen. (I) Quantifizierung von Typ-2-Pneumozyten promm2 Gewebe in Proben von Erwachsenen und Säuglingen. Maßstabsbalken = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 Sichtfeld pro Probe. Ungepaarter t-Test oder Mann-Whitney-Test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abkürzungen: DAPI = 4', 6-Diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon esculentum lectin; HTII = menschliche Typ-II-Zellen; CD31 = Adhäsionsmolekül für Thrombozyten-Endothelzellen-1/Differenzierungscluster 31; Sichtfeld = Sichtfeld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video S1: Video des 20-μm-Bildgebungsvolumens eines einzelnen porcinen Atemwegs, der mit DAPI, LEA, SMA und Elastin gefärbt wurde, zeigt eine hochauflösende Ansicht der Struktur von Atemwegswandelementen. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon esculentum lectin; SMA = Aktin der glatten Muskulatur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: Video des 30-μm-Bildgebungsvolumens einer einzelnen Alveole, gefärbt mit DAPI, LEA und HTII-280, zeigt die Verteilung der Typ-2-Pneumozyten in der Struktur. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon esculentum lectin; SMA = Aktin der glatten Muskulatur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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In diesem Protokoll stellen wir eine verbesserte Vibratom-basierte Methode zur Generierung von Lungenschnitten vor. Im Vergleich zu paraffinbasierten Verarbeitungstechniken ist diese Methode kostengünstiger, zeiteffizienter und umweltfreundlicher22. Darüber hinaus trägt diese Methode dazu bei, die strukturelle Integrität von Lungengewebeschnitten zu erhalten, und ermöglicht eine fortschrittliche Immunfluoreszenzbildgebung, ohne dass ein Antigengewinn erforderlich ist. Während unserer Experimente haben wir jedoch auch bestimmte Einschränkungen für diesen Arbeitsablauf festgestellt. Eine erkrankte Lunge kann den Schneideprozess durch Gewebezerstörung durch krankhafte Veränderungen stören. Bei der Verwendung des Vibratoms zum Schneiden können Atemwegsobstruktionen und schweres fibrotisches Lungengewebe die Klinge behindern, was den Prozess des Schneidens dieser Gewebe schwieriger macht. Dies kann jedoch überwunden werden, indem die Klingengeschwindigkeit reduziert und das Gewebe mit einem feinen Pinsel gestützt wird. Ähnliche Herausforderungen ergeben sich aus der Verdickung des Brustfells, die ein häufiges Ergebnis bei Rippenfellentzündung, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und idiopathischer Lungenfibrose (IPF) ist23,24,25. Wenn das Rippenfell für ein Experiment nicht von Interesse ist, empfehlen wir, es vor der Durchtrennung zu entfernen oder ein Lungenvolumen vom Rippenfell entfernt zu isolieren. Wenn das Pleura notwendig ist, kann es mit einer ähnlichen Manipulation wie oben geschnitten werden, wobei langsamere Klingengeschwindigkeiten und Scheibenunterstützung durch eine feine Bürste erforderlich sind.

Während präzise geschnittene Lungenschnitte die dreidimensionale Architektur und die native Umgebung der Lunge erhalten können26, ist es wichtig zu beachten, dass die Erzeugung von PCLS ein komplexer und zeitaufwändiger Prozess ist. Der Erfolg der Erzeugung von Lungengewebeschnitten hängt stark von der Effizienz der Agarosefüllung ab, die wiederum durch das Vorhandensein intakter Pleura und lebensfähiger Injektionsstellen im gewonnenen Gewebe beeinflusst wird. Dies ist bei Nagetieren einfach zu erreichen, da Agarose leicht durch die Luftröhre in intakte Lungen eingebracht werden kann27,28,29. In der Großtierforschung stammen Biopsien, die im Rahmen eines Experiments entnommen werden, jedoch in der Regel aus distalen Lungenabschnitten, die nicht groß genug sind, um zu kanülieren30,31. Anstatt also Agarose in die Bronchien oder Blutgefäße zu injizieren, wenden wir diese Methode an, bei der Lungengewebe, unabhängig von der Herkunft oder dem Probenvolumen, in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet wird, um Lungengewebeschnitte zu erzeugen. Dieser Ansatz ist technisch einfacher und zielt darauf ab, Gewebeschäden so gering wie möglich zu halten. Basierend auf unseren Erfahrungen hat diese Methode eine höhere Effizienz und Leichtigkeit bei der Erstellung von Lungengewebeschnitten gezeigt. Es bewahrt effektiv die Morphologie der Alveolen und eignet sich besonders zum Schneiden von Lungengewebe, wodurch wiederholbare hochauflösende Multiplex-Fluoreszenzbildgebung erzeugt werden kann.

In dieser Studie demonstrieren wir außerdem zwei stichprobenbasierte Quantifizierungen für die generierten Bilddaten. Bei der ersten Studie wurde die Bildverfolgung verwendet, um Unterschiede in der Alveolargröße zwischen den Proben der Spezies zu bewerten. Es überrascht nicht, dass die Alveolen von Mäusen die kleinsten waren, während die Alveolen von Schweinen und Menschen ähnlich groß waren, was Schweine als interessantes translationales Modell für die Lungenforschung hervorhebt.

Für die zweite Quantifizierung verglichen wir die HTII-Verteilung zwischen einer Lungenprobe eines Erwachsenen und eines Säuglings. Typ-2-Pneumozyten spielen eine wichtige Rolle in der Struktur des distalen Lungenepithels. Diese einzigartige Fähigkeit von TIIs trägt zur Reparatur und Regeneration des Alveolarepithelsbei 32. In der gesunden erwachsenen menschlichen Lunge machen TIIs etwa 15 % der gesamten Zellpopulation aus, während ihre Abdeckung der Alveolaroberfläche auf etwa 5 % geschätzt wird33. HTII-280 ist ein weithin anerkannter lungenspezifischer Marker für die Untersuchung der Entwicklung und Reaktion von Alveolarepithelzellen auf Verletzungen, und er ist spezifisch an den apikalen Plasmamembranen von TIIs lokalisiert. In dem Experiment wurde adultes Gewebe von einem Spenderpatienten gewonnen, der an einer intrazerebralen Blutung starb und gleichzeitig eine Lungenverletzung aufwies, während die Säuglingsprobe von einer erstickungsbedingten Mortalität stammte. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression von HTII-280 in der Lungenprobe eines Erwachsenen signifikant niedriger war als in der Säuglingsprobe. Interessanterweise wird HTII-280 zwar in der Mehrzahl der HTIIs exprimiert, seine Expression kann aber auch durch die Gewebequalität beeinflusst werden, und es ist in verletztem menschlichem Lungengewebe signifikant reduziert34. Gealtertes Lungengewebe weist im Vergleich zu jungen Geweben eine signifikante Abnahme der Anzahl und sekretorischen Aktivität von TIIs auf, und ältere Personen zeigen im Vergleich zu jungen Geweben eine deutlich geringere Proliferation, Sekretion und anti-apoptotische Aktivität von TIIs35. In diesem Sinne könnte die Identifizierung und der Nachweis eines Zelloberflächenproteins, das spezifisch für menschliche TIIs ist, dazu beitragen, den Schweregrad der Lungenschädigung zu beurteilen und Behandlungsansätze zu bewerten, die darauf abzielen, die Lungenreparatur zu verbessern36,37. Daher wäre es von großem Interesse, unter Verwendung dieser Pipeline alveoläre TII-Studien in größeren menschlichen Kohorten von Gesundheit und Krankheit durchzuführen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll einen schnelleren und einfacheren Ansatz für das Schneiden von Lungengewebe darstellt. Diese Methode liefert detaillierte Anweisungen für die Vorbereitung, das Schneiden und Färben von Lungengewebe, um den Erhalt der intakten Lungengewebestruktur zu gewährleisten. Es optimiert das Modell für die Untersuchung sowohl gesunder als auch kranker Lungenarchitektur, was zu einer verbesserten experimentellen Effizienz führt. Insgesamt stellt diese Studie einen vielversprechenden Ansatz vor, um komplexe räumliche Biologie in der Pathophysiologie von Lungengewebe über Spezies hinweg zu untersuchen, was dazu beitragen kann, die molekularen Mechanismen, die bei Krankheit und Reparatur eine Rolle spielen, besser zu verstehen.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung durch die Wallenberg Molecular Medicine Foundation und das Stem Cell Center der Universität Lund und danken dem Lund University Bioimaging Centre (LBIC) für den Zugang zum Nikon A1RHD.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-Gewebekultur-InsertsSARSTEDT83.3932.300
4 % ParaformaldehydSOLVECO6095714
4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)Thermo Fisher scientificD1306
50 mL Falcon-Röhrchen  SARSTEDT2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31)Abcamab28364
Konfokalmikroskop NikonA1R HD25
ElastinAbcamab23747
Epredia X1000 DeckglasThermo Fisher wissenschaftliche10318963
Epredia SuperFrost Plus AdhäsionsfolienThermo Fisher wissenschaftliche10149870
PinzetteAESCULAPFB395R
Ziege Anti-Maus 647 Invitrogen A21235
Ziege Anti-Kaninchen 568Invitrogen A11011
Humane Typ-II-ZellenTerrace BiotechTB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluormount-G EindeckmediumThermo Fisher scientificE41473
Niedrige Geliertemperatur AgaroseSigma-Aldrich1003467046
Lycopersicon Esculentum LektinThermo Fisher scientific2531965
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher scientific50-100-8798
Kunststoffbecherkontorsgiganten885221
SchereSTILLE101-8380-18
Aktin für glatte MuskelnAbcamab5694
NatriumazidSigma-AldrichK54329188239
SekundenkleberLOCTITE2721643
Vibrierendes MikrotomLeicaVT1200S

Referenzen

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  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493(2022).
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