Methodenartikel

Feldentnahme und Laborroutine-Identifizierung von Rhodiola crenulata

DOI:

10.3791/65947

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27. Oktober 2023

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1School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die Identifizierung von Rhodiola Crenulata anhand des Lebensraums, der Pflanzenmorphologie, der medizinischen Eigenschaften, der mikroskopischen Merkmale und der Dünnschichtchromatographie.

Zusammenfassung

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Die Identifizierung von medizinischen Materialien ist die Voraussetzung und Garantie für die Arzneimittelsicherheit. Die Mehrheit der wissenschaftlichen Forscher wird den einfachen, schnellen, effektiven und kostengünstigen Identifizierungsprozess von Kräutern bevorzugen. Rhodiola crenulata ist eine traditionelle tibetische Medizin, die in großen Höhen angebaut wird und hauptsächlich in den Regionen Tibet, Yunnan und Sichuan in China verbreitet ist. Rhodiola-Crenulat besitzt mehrere Bioaktivitäten, wie z. B. entzündungshemmende, antihypoxie- und antioxidative Eigenschaften, und hat ein großes Entwicklungspotenzial. Mit der steigenden Marktnachfrage und einem raschen Rückgang des Ressourcengehalts hat eine große Anzahl verwirrter Produkte von Rhodiola crenulata die Menschen beunruhigt. Daher führt dieses Protokoll ein Standardverfahren für die Identifizierung von Rhodiola crenulata im Feld in Kombination mit routinemäßigen Labortests ein. Die Kombination aus Lebensraum, mikroskopischen Merkmalen und Dünnschichtchromatographie wird Rhodiola crenulata zweifellos schnell, effizient und wirtschaftlich identifizieren und zur kontinuierlichen Entwicklung der tibetischen Medizin und zur Qualitätskontrolle von medizinischen Materialien beitragen.

Einleitung

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Die Kräutermedizin hat eine lange Geschichte und reiche Anwendungserfahrung in China und war die erste systematische Aufnahme in Shennongs Kräuterklassiker1. Die Entdeckung von Artemisinin bei Malaria förderte die Entwicklung der Kräutermedizin in ein neues Stadium1. Der Einsatz moderner wissenschaftlicher Technologien zur Aufdeckung des genauen Mechanismus der Kräutermedizin erhöht die Nutzungsrate und die Nachfrage nach Kräutermedizin und eröffnet einen neuen internationalen Markt dafür 2,3,4. Dies hat jedoch zu einer Reihe negativer Auswirkungen geführt. Laien haben ein vages Verständnis der Eigenschaften der Kräutermedizin, was die Verwendung von Kräutermedizin zu einem großen Sicherheitsrisiko macht5.

Rhodiola crenulata, eine der Pflanzen der Rhodiola-Arten, ist hauptsächlich in Tibet, im Nordwesten von Yunnan und im westlichen Sichuan Chinas verbreitet (Abbildung 1)6,7. Rhodiola crenulata umfasst Salidrosid, Tyrosol, Gallussäure und andere Verbindungen zur Behandlung hypoxischer Erkrankungen durch die Funktion "belebendes Qi und Förderung der Durchblutung, Puls klärend und Asthma beruhigend"8,9,10,11. Felduntersuchungen zeigen, dass Rhodiola crenulata in den alpinen Schuttzonen, Rinnen und Felsspalten in einer Höhe von 4.000-5.600 m zu finden ist. Ihre Vegetationsumgebung ist kalt, sonnenreich und strahlenintensiv und sie gehört zum Ökosystem der Almwiesen. Rhodiola crenulata kann je nach Wachstumsgelände in lamellären und punktförmigen Populationen verteilt werden, und der Genfluss kann durch Fremdbestäubung erfolgen.

Der Pollenabort der Gattung Rhodiola, die illegale Ausgrabung und die degenerierte ökologische Umwelt machen Rhodiola crenulata zu einer gefährdeten Art 6,12. Angesichts des hohen medizinischen Wertes von Rhodiola crenulata ist zu erwarten, dass gefälschte Produkte auf den Markt kommen. Dieser Artikel stellt den Lebensraum von Rhodiola crenulata und einige praktische Laborbestimmungsmethoden vor. Zunächst beobachteten wir die Wachstumsumgebung von Rhodiola crenulata und ihre medizinischen Eigenschaften. Zweitens wurde die Mikrostruktur des medizinischen Pulvers mikroskopisch beobachtet. Der letzte Schritt ist der entscheidende Punkt. Die repräsentativen Komponenten von Rhodiola crenulata wurden getrennt und nach den unterschiedlichen Adsorptions- oder Auflösungseigenschaften dieser Komponenten in einer bestimmten Substanz identifiziert. DNA-basierte Authentifizierungs- oder Metabolomik-Analysemethoden von Heilpflanzen sind kompliziert und teuer13. Diese einfachen, bequemen und wirtschaftlichen Methoden können Rhodiola crenulata schnell identifizieren.

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Protokoll

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Rhodiola crenulata wird im Schneeberg Zhuoda im Kreis Ganzi, Tibetische Autonome Präfektur Ganzi, Provinz Sichuan, China (N 31,44570°, E 99,96086°, 4892 m) gesammelt. Die Pflanzen werden von Professor Yi Zhang an der School of Ethnic Medicine der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine als echt authentifiziert.

1. Sammlung von Rhodiola crenulata

  1. Fotografieren Sie die Habitatkarte von Rhodiola crenulata.
  2. Fotografieren Sie die ganze Pflanze, die Blätter, den Kelch und das Rhizom von Rhodiola crenulata.
  3. Verwenden Sie einen Spaten, um das Unkraut und die zerbrochenen Steine innerhalb von 1 m um die Rhodiola crenulata zu entfernen, um den anschließenden reibungslosen Abbau zu gewährleisten.
  4. Graben Sie den Boden mit einer Hacke aus, bis die gesamte Rhizosphäre sichtbar ist, und sammeln Sie die Pfahlwurzel.
    HINWEIS: Die Wurzeln und Rhizome von Rhodiola crenulata , die in medizinischen Teilen verwendet werden, sollten im Herbst gesammelt werden, wenn die Blütenstiele verwelken.

2. Identifizierung von Merkmalen

  1. Beobachten Sie die Erscheinungsmerkmale von Rhodiola crenulata mit bloßem Auge: zylindrische und kurze Pfahlwurzeln und Rhizome, braune Oberfläche, häutige gelbe Epidermis mit rosa Muster und orangerote oder burgunderrote Scheiben.
  2. Identifizieren Sie es anhand des Geruchs: Es gibt einen duftenden Geruch, wenn es sich in der Nähe der Nase befindet.
  3. Identifizieren Sie es nach Geschmack: Nehmen Sie ein kleines Stück Wurzel in den Mund, nehmen Sie es zuerst und kauen Sie es dann, schmecken Sie leicht bitter, dann süß.

3. Mikroskopische Identifizierung von Stärkekörnchen in medizinischem Pulver

  1. Entfernen Sie die Erde von der Oberfläche der Rhodiola crenulata mit einer Bürste, schieben Sie sie bei 40 °C in den Ofen und wenden Sie die Kräuter alle 24 h.
    HINWEIS: Die Leichtigkeit des Brechens von medizinischen Materialien gilt als Standard für die Trocknung von Feuchtigkeit.
  2. Pulverisieren Sie die getrockneten medizinischen Materialien mit einer Pulvermaschine und filtern Sie das medizinische Pulver mit dem medizinischen Sieb Nr. 3 (siehe Materialtabelle).
  3. Nehmen Sie einen sauberen Objektträger (siehe Materialtabelle), graben Sie das Pulver mit einer Präpariernadel (siehe Materialtabelle) und legen Sie es gleichmäßig auf ein Drittel des Objektträgers innerhalb von 2 mm.
  4. Verwenden Sie eine Glaspipette (siehe Materialtabelle), um dem Pulver einen Tropfen deionisiertes Wasser hinzuzufügen. Halten Sie mit einer Pinzette (siehe Materialtabelle) ein Ende des Deckglases (siehe Materialtabelle), um den Flüssigkeitsstand schnell zu berühren und das Pulver abzudecken.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine anatomische Nadel, um Wasser und medizinisches Pulver vorsichtig zu mischen, um eine gleichmäßige Probenmischung zu gewährleisten. Es sollten keine Luftblasen zwischen Objektträger, Pulver und Deckglas vorhanden sein.
  5. Öffnen Sie das Mikroskop (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Objektträger in Schritt 3.4 auf die Plattform, um ihn zu sichern. Stellen Sie die Lichtquelle und die grobe Fokusspirale ein, um das Pulver zu sehen. Stellen Sie die feine parafokale Spirale ein, bis das Gewebe deutlich zu sehen ist. Wechseln Sie zu einem 40-fachen Objektiv und beobachten Sie die Stärkekörnchen.
    HINWEIS: Stärken Sie die Körner, die sich als einzelne oder mehrere Körner präsentieren, und die Nabelschnurspitze erscheint fischgrät- oder rissförmig.

4. Mikroskopische Identifizierung von Kathetern, Korkzellen, Fasern, Holzparenchymzellen und Pigmentmassen in medizinischem Pulver

  1. Nehmen Sie einen sauberen Objektträger (siehe Materialtabelle), graben Sie das Pulver mit einer Präpariernadel (siehe Materialtabelle) und legen Sie es auf ein Drittel des Objektträgers.
  2. Verwenden Sie eine Glaspipette (siehe Materialtabelle), um dem Pulver einen Tropfen Chloralhydrat (siehe Materialtabelle) hinzuzufügen. Nehmen Sie den Objektträger mit einer Pinzette (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie ihn dreimal in der Alkohollampe, jedes Mal 1 s lang.
    HINWEIS: Blasen sollten beim Erhitzen vermieden werden. Die Flüssigkeit bleibt nicht fließend, was darauf hinweist, dass die Penetration abgeschlossen ist.
  3. Verwenden Sie eine Glaspipette, um einen Tropfen Glycerin hinzuzufügen (siehe Materialtabelle). Halten Sie mit einer Pinzette ein Ende des Deckglases fest, um den Flüssigkeitsstand schnell zu berühren.
  4. Öffnen Sie das Mikroskop und legen Sie den Objektträger auf die Plattform, um ihn zu sichern. Stellen Sie die Lichtquelle und die grobe Fokusspirale ein, um das Pulver zu sehen. Stellen Sie die feine parafokale Spirale ein, bis das Gewebe deutlich zu sehen ist. Beobachten Sie den Katheter, die Korkzellen, die Fasern, die Holzparenchymzellen und den Pigmentblock, indem Sie zu einer 40-fachen Objektivlinse wechseln.
    HINWEIS: Polygonal oder lang polygonal von Korkzellen, spiralförmiges Gefäß mit deutlicher spiralförmiger Struktur, Xylemparenchym mit Calciumoxalat-Sandkristallen und rotem oder bräunlich-rotem Pigmentblock.

5. Herstellung von Dünnschichtchromatographieproben (DC) von Rhodiola crenulata und ihrer Referenz

  1. Legen Sie das Wiegepapier auf die Waage (siehe Materialtabelle) und wiegen Sie 3 g Pulver Rhodiola crenulata.
  2. Nehmen Sie das Pulver in eine konische 100-ml-Flasche (siehe Materialtabelle) und fügen Sie 25 mL Methanol mit einer Großbauchpipette hinzu (siehe Materialtabelle). Legen Sie die konische Flasche in das Ultraschallgerät. Stellen Sie die Leistung auf 250 W, die Frequenz auf 40 kHz und die Zeit auf 30 min ein (siehe Materialtabelle) und schalten Sie das Gerät ein.
    HINWEIS: Der Zweck des Ultraschallgeräts besteht darin, sicherzustellen, dass das Pulver von Rhodiola crenulata vollständig aufgelöst wird, ohne die Ergebnisse nachfolgender chromatographischer Dünnschichtexperimente zu beeinträchtigen.
  3. Entfernen Sie die konische Flasche und spülen Sie die äußere Flasche mit fließendem Wasser auf Raumtemperatur (RT) aus.
  4. 800 μl der in Schritt 5.3 hergestellten Flüssigkeit werden mit einer 1-ml-Spritze abgesaugt. Filtern Sie mit einer mikroporösen 0,22-μm-Filtermembran (siehe Materialtabelle) und sammeln Sie 400 μl Midstream-Probenlösung von Rhodiola crenulata in einer chromatographischen Probenflasche.
  5. Wiegen Sie 2 mg Salidrosid, Tyrosol und Gallussäure (siehe Materialtabelle) und geben Sie sie in 3 separate konische 100-ml-Flaschen. Geben Sie 25 ml Methanol mit einer Pipette mit großem Bauch in jede konische Flasche.
  6. Setzen Sie die konische Flasche in das Ultraschallgerät, stellen Sie die Leistung auf 250 W, die Frequenz auf 40 kHz und die Zeit auf 30 min ein und wiederholen Sie Schritt 5.3 (siehe Materialtabelle).
  7. 800 μl der in Schritt 5.6 hergestellten Flüssigkeit werden mit einer 1-ml-Spritze abgesaugt. Filtern Sie mit einer mikroporösen 0,22-μm-Filtermembran (siehe Materialtabelle) und sammeln Sie 400 μl Midstream-Salidrosid-, Tyrosol- und Gallussäure-Standardlösung in entsprechenden chromatographischen Probenflaschen.

6. TLC-Identifizierung

  1. Pipettieren Sie Trichlormethan (5 ml), Ethylacetat (4 ml), Methanol (2 ml) und Ameisensäure (0,5 ml) (siehe Materialtabelle). Auf eine Seite des Doppeltank-Chromatographiezylinders geben (siehe Materialtabelle), schütteln und gleichmäßig mischen. Decken Sie den oberen Zylinderkopf ab.
  2. Die Gallussäure, das Salidrosid, die Tyrosol-Standardlösung und die Rhodiola crenulata-Lösung werden in den Positionen A1 bis A4 auf das Probengestell gelegt.
  3. Legen Sie die 5 cm x 10 cm große Silikonfolie (siehe Materialtabelle) auf den Probenahmetisch. Starten Sie die automatische Probenahmemaschine (siehe Materialtabelle) und öffnen Sie das Luftregelventil.
  4. Öffnen Sie die Software visionCATS (siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf Neu > Neuer Ordner (mit dem Namen Rhodiola crenulata sample test) > auf OK. Klicken Sie auf Neue Methode (Name Rhodiola crenulata sample test) > OK > ATS 4.
  5. Klicken Sie auf Schrittdefinition beenden. Klicken Sie auf Track-Zuweisung , um die Beschreibung zu bearbeiten (Gallussäure-, Salidrosid-, Tyrosol- und Rhodiola crenulata-Probe ).
  6. Klicken Sie auf HPTLC-Schritte. Stellen Sie die Parameter für die dünne Schicht ein (5 cm x 10 cm). Wählen Sie Anwendungstyp (Band), legen Sie die Parameter fest (Tabelle 1) und klicken Sie auf die Schaltfläche OK .
  7. Offene Füll-/Spülqualität. Aktivieren Sie Nur programmiertes Volumen füllen. Stellen Sie die untere Ebene des Fläschchens (mm) auf 0,5 ein und klicken Sie auf die Schaltfläche OK .
  8. Klicken Sie auf Methode ausführen.
  9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Spurzuweisung , aktivieren Sie Zentrieren und stellen Sie die Parameter ein (Tabelle 2).
  10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um die automatische Probenahme zu starten.
  11. Schalten Sie die automatische Probenahmemaschine und das Luftventil aus. Entfernen Sie die Silikonfolie aus dem Probenahmeautomaten.
  12. Legen Sie die Silikonfolie in Schritt 6.1 auf die andere Seite des Doppeltank-Chromatographiezylinders, decken Sie den oberen Zylinderkopf ab und tränken Sie ihn 20 Minuten lang vor.
  13. Klemmen Sie das obere Ende der dünnen Schichtplatte vorsichtig mit einer Pinzette fest, legen Sie die Silikonfolie schnell in das Entwicklungsmittel und decken Sie den oberen Zylinderkopf ab.
    HINWEIS: Nehmen Sie die Silikonfolie heraus, wenn die sich entfaltende Vorderkante 0,5-1,0 cm vom oberen Ende der dünnen Schichtplatte entfernt ist.
  14. Nachdem das organische Lösungsmittel verdunstet ist, sprühen Sie die chromogene Lösung bei Raumtemperatur auf die Oberfläche der Silikonfolie, um chromogene Ergebnisse zu erzielen.
    HINWEIS: Die chromogene Lösung ist eine wässrige Lösung, die 2 % FeCl3 und 1 % K3[Fe(CN)6] enthält.

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Ergebnisse

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Dieses Versuchsprotokoll beschreibt die Identifizierung und das Sammeln von Rhodiola-Crenulat im Feld. Rhodiola crenulate lebt in der Regel in den alpinen Schuttzonen, Rinnenhängen und Felsspalten in großen Höhen. Der Lebensraum, die ganze Pflanze, die Blüte und die Blätter von Rhodiola crenulate sind in Abbildung 2 dargestellt. Rhodiola crenulate hat ein rötlich-braunes Rhizom (Abbildung 3A). Ein repräsentatives Bild des medi...

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Diskussion

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Es gibt mehr als 90 Arten von Rhodiola-Pflanzen auf der Welt, und mehr als 60 % aller Arten kommen in China vor, darunter Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis und Rhodiola algida17. Rhodiola crenulata, die im ersten Teil des Chinesischen Arzneibuchs (2020) verzeichnet ist, ist eine traditionelle tibetische Medizin, die in großen Höhen angebaut wird. Die Marktnachfrage nach Rhodiola crenulata steigt jährlich, daher ist die Gewährle...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81973569, 82274207 und 82104533), dem Xinglin Scholar Research Promotion Project der Chengdu University of TCM (XKTD2022013) und dem Key Research and Development Program von Ningxia (2023BEG02012) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 μm m Millipore FilterMilliporeSLGP033RB
Automatische ProbenahmemaschineCAMAGATS 4
ChloralhydratFuzhou Brunei Technology Co., LtdST1002
Chromatographisch  Probe  FlaschenZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
KonuskolbenSichuan Shubo Co., Ltd1121
DeckglasCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd10211818c
PräpariernadelShanghai Bingyu Fluid Technology Co., LtdBY-5026
Elektronische WaageSHIMADZUATX124
EthylacetatChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2022120901
AmeisensäureChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021110801
GallussäureChengdu Herbpurify Co., LtdM-017
GlycerolSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10010618
Hochgeschwindigkeits  BrecherBeijing Zhongxingweiye Instrument Co., LtdFW-100
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
MikroskopChongqing Oprec Nistrument Co.,  LtdB203
ObjektträgerCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
OfenShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
ArzneibuchsiebHangzhou Xingrun Siebfabrik572423281330
PipetteChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120302008
SalidrosidChengdu Herbpurify Co., LtdH-040
Sättigungstank  Yancheng Liegu Technology Co., Ltd10*20 P-1
KieselgelplatteYantai Jiangyou Silica Gel Development   Co., LtdHSG20211227
TrichlormethanChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20221013-1
Pinzette  Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
TyrosolChengdu Herbpurify Co., LtdL-042
UltraschallgerätNingbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., LtdSB-8200DTS Volumetrische
PipetteChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120301006

Referenzen

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Identifizierung von Rhodiola crenulataLaboridentifizierungArzneistoffemikroskopische UntersuchungD nnschichtchromatographieSt rkek rnerKorkzellenUltraschallextraktionSalidrosid Nachweis

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