Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der langfristigen Plastizität der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsalen lateralen Genikulatkern, der in ex vivo Hirnschnitten erhalten bleibt.
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Methodenartikel
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der langfristigen Plastizität der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsalen lateralen Genikulatkern, der in ex vivo Hirnschnitten erhalten bleibt.
Der dorsale laterale Genikulatkern (dLGN) wurde lange Zeit als grundlegendes Relais für visuelle Informationen angesehen, die von der Netzhaut zu den kortikalen Bereichen gelangen, aber neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die funktionelle Plastizität von dLGN-Hauptzellen weitgehend unterschätzt wird. Die zellulären Mechanismen, die diese Veränderungen unterstützen, sind jedoch noch nicht vollständig erforscht. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Induktion der Langzeitpotenzierung der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit (LTP-IE) in dorsalen dLGN-Relaiszellen aus akuten Hirnschnitten junger Ratten. Die intrinsische Plastizität wird im Allgemeinen parallel zur synaptischen Plastizität induziert. In dLGN-Neuronen wird LTP-IE jedoch zuverlässig durch Spike-Aktivität bei einer Frequenz von 40 Hz für 10 Minuten induziert. LTP-IE in dLGN-Relaisneuronen ist langanhaltend, da es bis zu 40 Minuten nach dem Induktionsprotokoll verfolgt werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Studie den ersten Beweis für die Induktion von intrinsischer Plastizität in dLGN-Relaiszellen liefern, was auf die Rolle von thalamischen Neuronen bei der aktivitätsabhängigen visuellen Plastizität hinweist.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodenarbeit ist es, eine einfache Möglichkeit zu bieten, eine lang anhaltende Plastizität der neuronalen Erregbarkeit in visuellen thalamischen Neuronen der Ratte in vitro zu induzieren, indem der Standard-Stromklemmenmodus der Patch-Clamp-Technik verwendet wird1,2. Der Grund für die Entwicklung dieser Technik ist ihre Einfachheit und Reproduzierbarkeit. Der Vorteil gegenüber alternativen Techniken, wie z.B. der Stimulation von synaptischen Inputs, gepaart oder nicht mit postsynaptischen Aktionspotentialen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgegeben werden, ist ihre Zuverlässigkeit.
Plastizität im visuellen System wird traditionell ausschließlich auf kortikaler Ebene exprimiert, während der dorsale laterale Genikulatkern (dLGN), eine primäre Empfängerstruktur von retinalen Eingaben auf thalamischer Ebene, traditionell nur als Relais visueller Informationen angesehen wird3. Diese anfängliche Schlussfolgerung wurde jedoch durch neuere Arbeiten in Frage gestellt, die darauf hinweisen, dass diese vereinfachende Sichtweise nicht gilt4,5,6. So werden funktionelle Defizite in der visuellen Reaktion bereits bei amblyopen Patienten im Stadium der LGN7 beobachtet. Darüber hinaus erhält ein großer Teil der dLGN-Relaisneuronen in einem gegebenen monokularen Gebiet Eingaben von jedem Auge, was auf eine potenzielle Binokularität für einen großen Teil der dLGN-Neuronen hinweist8,9,10. Darüber hinaus führt monokulare Deprivation zu einer signifikanten Verschiebung der okulären Dominanz in dLGN-Neuronen5,11,12.
Unter den Mechanismen der funktionellen Plastizität, die bei der Verschiebung der okulären Dominanz auftreten können, ist die Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit ein potenzieller Kandidat. In der Tat exprimieren viele Gehirnregionen, einschließlich visueller Areale, intrinsische Plastizität, die verschiedenen Verhaltensaufgaben folgt13,14. Langfristige intrinsische Plastizität wurde in zentralen Neuronen nach Stimulation afferenter Glutamat-Inputs berichtet15,16,17,18, Spiking Activity19,20, sensorische Stimulation21 oder nach Aktivität oder sensorischer Deprivation20,22,23. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Induktion der Langzeitpotenzierung der intrinsischen Erregbarkeit (LTP-IE) in dLGN-Relaisneuronen nach Spike-Aktivität bei einer Frequenz von 40 Hz ermöglicht. Die Feuerfrequenz von 40 Hz entspricht einer Frequenz, die bei den meisten dLGN-Neuronen in vivo bei visueller Stimulation beobachtet wird24,25.
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Alle Versuche wurden gemäß den europäischen und institutionellen Richtlinien durchgeführt (Richtlinie 86/609/EWG des Rates und französischer Nationaler Forschungsrat und genehmigt von der lokalen Gesundheitsbehörde (Veterinärdienste, Präfektur des Bouches-du-Rhône, Marseille)).
1. Tiere
2. Akute Scheiben von Ratten-dLGN
3. Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie
HINWEIS: Für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von dLGN-Relaisneuronen verwenden Sie einen speziellen Patch-Clamp-Verstärker.
4. Datenerfassung
5. Induktion von LTP-IE
6. Datenanalyse
HINWEIS: Das Analyseverfahren ist vor (Kontrollbedingungen) und nach der LTP-IE-Induktion gleich.
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dLGN-Neuronen wurden im Ganzzell-Konfiguration aufgezeichnet, und die LTP-IE wurde durch Aktionspotentiale mit einer Frequenz von 40 Hz über 10 min in Gegenwart von ionotropen Glutamat- und GABA-Rezeptorantagonisten induziert (Abbildung 3A). Eine dreifache Zunahme der Anzahl an Aktionspotentialen wurde 20–30 min nach der Induktion beobachtet (Abbildung 3B), ohne dass sich der Eingangswiderstand, Rin, veränderte (Abbildung 3C
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Wir berichten hier über die Induktion von LTP-IE in dLGN-Neuronen, die in akuten Hirnschnitten durch Stimulation des aufgezeichneten Neurons am Leben erhalten wurden, um Aktionspotentiale bei einer Frequenz von 40 Hz für 10 min hervorzurufen. Dieses Protokoll ist in jedem neurophysiologischen Labor einfach zu implementieren, da es eine minimale Anzahl von Geräten erfordert (Slicer, Mikroskop, 1 Verstärker, 1 Erfassungsplatine und Computer). Es müssen jedoch einige kritische Schritte beachtet werden, um wertvolle Daten zu...
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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Unterstützt von INSERM, CNRS (bis DD), AMU (bis MR), FRM (DVS20131228768 bis DD und DEQ20180839583 bis DD), NeuroSchool ("France 2030" Programm über A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) und ANR-Finanzierung (ANR-17-EURE-0029 bis AW) und ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 bis DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 bis DD). Wir danken A Venture & K Milton für die hervorragende Tierpflege.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Automatisiertes Vibrationsklingen-Mikrotom | Leica | VT-1200S | Vibratom/Slicer |
| Borosilikatglasröhre | Phymep | B-15086-10 | |
| Controller Typ V | Luigs& Neumann | Typ V | Temperaturregler |
| Igor-Software | Wavemetrics-Analysesoftware | ||
| Infrarot-Videomikroskopie | Olympus | XM-10 Kamera | |
| Kynurenate | Merk/Sigma | K3375 | AMPA/NMDA-Rezeptorblocker |
| Rauscharmes Datenerfassungssystem | Axon - Molekulare Bauelemente | Digidata 1440A | Analog/Digital-Schnittstelle |
| Mikromanipulatoren | Luigs& Neumann | LN Mini25 | |
| Multiclamp 200B | Axon - Molekulare Geräte | N/A | Patch-Clamp-Verstärker |
| Multiclamp 700B | Axon - Molekulare Geräte | N/A | Patch-Clamp-Verstärker |
| PC-100 Abzieher | Narishige | PC-100 | Mikropipetten-Abzieher |
| PClamp10 | Axon - Molekulare Geräte | N/A | Patch-Clamp-Aufnahmesoftware |
| Picrotoxin | AbCam | ab120315 | GABAA-Rezeptorblocker |
| Slice Mini-Kammer | Luigs& Neumann | LN Chambre Slice mini I-II | Untergetauchtes |
| Kammermikroskop | Olympus | BX51 WI |
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