Mikroglia gelten als einige der vielseitigsten Zellen des Körpers, die zur morphologischen und funktionellen Anpassung fähig sind. Ihre Heterogenität und Multifunktionalität ermöglicht die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und ist gleichzeitig mit verschiedenen neurologischen Pathologien verbunden. Hier wird eine Technik zur Reinigung von Rückenmarksmikroglia beschrieben.
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Methodenartikel
Schnelle und effiziente Anreicherung von Mikroglia des Rückenmarks der Maus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Wirbelsäule definiert ein Wirbeltier und formt den Wirbelkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt. Die richtige Entwicklung und Funktion des zentralen Nervensystems von Säugetieren hängt maßgeblich von der Aktivität der ansässigen Makrophagen ab, die als Mikroglia bekannt sind. Mikroglia weisen Heterogenität und Multifunktionalität auf, was eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn ermöglicht. Zahlreiche Studien haben die Funktion der zerebralen Mikroglia untersucht und die Reinigungsmethoden ausführlich beschrieben. Für die Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark bei Mäusen fehlt jedoch eine umfassende Beschreibung. Im Gegensatz dazu fehlt der Verwendung einer hochgereinigten Kollagenase im Gegensatz zu einem unraffinierten Extrakt die Berichterstattung im Gewebe des zentralen Nervensystems. In dieser Studie wurden die Wirbelsäule und das Rückenmark von 8-10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen herausgeschnitten. Bei der anschließenden Verdauung wurde eine hochgereinigte Kollagenase verwendet, und bei der Mikrogliareinigung wurde ein Dichtegradient verwendet. Die Zellen wurden für die Durchflusszytometrie gefärbt, wobei die Lebensfähigkeit und Reinheit durch CD11b- und CD45-Färbung beurteilt wurde. Die Ergebnisse ergaben eine durchschnittliche Viabilität von 80 % und eine mittlere Reinheit von 95 %. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Manipulation der Mikroglia der Maus eine Verdauung mit einer hochgereinigten Kollagenase beinhaltete, gefolgt von einem Dichtegradienten. Dieser Ansatz erzeugte effektiv beträchtliche Populationen von Rückenmark-Mikroglia.
Einleitung
Das bestimmende Merkmal von Wirbeltieren ist die Wirbelsäule oder Wirbelsäule, in der der Notochord durch eine Abfolge segmentierter Knochen ersetzt wurde, die als Wirbel bezeichnet werden und durch Bandscheiben getrennt sind. Diese Abfolge von knöchernem Material formt den Spinalkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt1. Bei der Gattung Rodentia besteht die Wirbelsäule in der Regel aus sieben Halswirbeln, dreizehn Brustwirbeln, sechs Lendenwirbeln und einer variablen Anzahl von Schwanzwirbeln 2,3. Die Länge des Rückenmarks ähnelt der der Wirbelsäule, und das terminale Filumum ist eine nicht-nervöse Struktur, die das Rückenmark im Kreuzbein verankert. Zusätzlich treten Nervenfasern durch das Foramen intervertebralisaus 1.
Die Entwicklung und ordnungsgemäße Funktion des zentralen Nervensystems bei Säugetieren hängt entscheidend von der Aktivität der im Nervensystem ansässigen Makrophagen, den sogenannten Mikroglia4, ab. Obwohl Mikroglia ursprünglich als hirnresidente Phagozyten beschrieben wurden, haben neuere Forschungen diesen Zellen viele dynamische Funktionen zugeschrieben 5,6. Die Größe von Mikroglia reicht von 7 bis 10 μm in der Homöostase; Sie gelten als eine der vielseitigsten Zellen des Körpers und können sich morphologisch und funktionell an ihre sich ständig verändernde Umgebung anpassen7. Diese Zellen weisen sowohl im embryonalen als auch im adulten Stadium eine hohe Heterogenität auf8,9, während sie im adulten Stadium auch eine komplexe funktionelle Heterogenität aufweisen, die auf ihrem raumzeitlichen Kontext beruht10. Die Heterogenität und die vielfältigen Funktionen von Mikroglia ermöglichen eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von CD11b, CD45, CD86 und CCR9 im Rückenmark höher ist als im Gehirn 8,9.
Es existieren mehrere Protokolle für die Isolierung zerebraler Mikroglia11,12; Für Rückenmarksmikroglia existieren jedoch nur wenige13,14. Die Optimierung einer Methode zur Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erleichtert die Entwicklung mehrerer Studien, die sich auf die Entdeckung der Mikroglia-Physiologie konzentrieren. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache und hochgradig reproduzierbare Extraktion des Rückenmarks der Maus und die Reinigung von Mikroglia zu beschreiben (Abbildung 1).
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Protokoll
Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der offiziellen mexikanischen Norm NOM-062-ZOO-1999 und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Die Genehmigung für die Studie wurde von den Ausschüssen für Forschung, Ethik und Biosicherheit des mexikanischen Kinderkrankenhauses (HIM/2023/006) und der Kommission für Forschung und Bioethik des Allgemeinen Krankenhauses von Mexiko Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62) erteilt. Drei C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden aus dem Mexico Children's Hospital bezogen, wo sie unter isolierten Bedingungen in belüfteten Racks in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren aufgezogen wurden.
1. Vorbereitung von Materialien und Reagenzien
- Ca2+ und Mg2+ freies PBS sowie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auf 37 °C vorwärmen.
- Ergänzen Sie die HBSS-Lösung mit 100 μg/ml Liberase und 4 μg/ml DNase (HBSS-LD). Stellen Sie sicher, dass die Lösung einen physiologischen pH-Wert von 7,4 beibehält.
HINWEIS: 1 ml Arbeitslösung pro Rückenmark ist erforderlich. - Bereiten Sie eine isotonische 90%ige Lösung für die Dichtegradientenzentrifugation vor (handelsüblich, siehe Materialtabelle) und wärmen Sie sie auf 37 °C vor.
- Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 5 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) mit PBS kombinieren, und lagern Sie die Mischung auf Eis.
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium-High Glucose (1g/L) (DMEM) auf 37 °C vorwärmen.
- Ergänzen Sie das DMEM-Medium mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 200 U/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 500 pg/ml Amphotericin B (siehe Materialtabelle), um DMEM-S herzustellen.
2. Dissektion und Präparation des Rückenmarks
- Euthanasieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Überdosis Pentobarbital in einer Dosis von 150 mg/kg. Sterilisieren Sie den Thorax und den Rücken der Maus mit 70%igem Ethanol.
HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Euthanasie erfolgreich war, bevor Sie mit der Sektion der Maus fortfahren. - Rasieren Sie den thorakolumbalen Bereich und befestigen Sie die Extremitäten mit Klebeband am Sezierbrett.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen vorsichtigen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie vom Hinterhaupt bis zum Sakralbereich (Abbildung 2).
- Mit Hilfe eines stereoskopischen Operationsmikroskops wird in Schichten präpariert, bis die Lendenwirbelsäule erreicht ist und der letzte Rippenbogen identifiziert wird.
HINWEIS: Die 13 Rippenbögen sind in den Brustwirbeln artikuliert; wenn sie präpariert werden, werden sie oberhalb des L1-Wirbelssichtbar 2. - Bestimmen Sie den letzten Halswirbel und das Kreuzbein und machen Sie dann einen Schnitt, um die Wirbelsäule zu trennen (Abbildung 2).
- Führen Sie mit einer Präparierzange eine dorsale Laminektomie der Wirbel durch, um das Rückenmark zu extrahieren (Abbildung 3A-D).
HINWEIS: Mit Ausnahme der ersten beiden Halswirbel (Atlas und Achse) haben alle beweglichen Wirbel ein gemeinsames morphologisches Design in verschiedenen Regionen (Hals-, Brust- oder Lendenwirbelsäule). Jeder typische bewegliche Wirbel weist an seinem vorderen Ende einen zylindrischen Wirbelkörper auf. An der Rückseite des Körpers ist ein knöcherner Bogen befestigt, der als Wirbelbogen (Neuralbogen) bezeichnet wird und aus Laminae und Dornfortsätzen besteht. Zwischen diesen Strukturen liegt das Foramen vertebralis15. - Entfernen Sie die Nerven, die durch die Foramina (dorsale und ventrale Wurzeln) austreten, die das periphere Nervensystem bilden und infiltrierte Makrophagen enthalten können (Abbildung 3D).
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Pia mater oder die Hirnhäute zu entfernen, da das Dichtegradientenmedium kontaminierende Astrozyten effektiv eliminiert. Darüber hinaus verkürzt die Retention der Hirnhäute die Reinigungszeit und verbessert die Lebensfähigkeit.
3. Gewebeverdauung und Isolierung von Mikroglia
- Legen Sie das Rückenmark auf das Präparierbrett und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Vannas-Schere in 2 mm große Stücke, was durchschnittlich 10 Stücke ergibt.
- Die Abschnitte des Rückenmarks werden in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit flachem Boden überführt (Abbildung 3E,F).
- 1 ml der HBSS-LD-Arbeitslösung zugeben (Schritt 1.2). Bei 37 °C 25 min inkubieren, alle 5 min kräftig vortexieren.
- Den Inhalt jedes Aufschlusses durch ein 40-μm-Sieb passieren und dann 7 ml HBSS mit 2 % FBS hinzufügen, um den Aufschluss zu neutralisieren.
- Zerkleinern Sie das verbleibende Gewebe mit einem 1-ml-Spritzenkolben. Die Suspension wird in einem konischen 50-ml-Röhrchen 5 min bei 220 x g, 4 °C zentrifugiert.
- Verwerfen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Mikropipette und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml HBSS mit 2 % FBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Mit 2 ml isotonischem Dichtegradientenmedium mit 90 % kombinieren. 25 min bei 160 x g, 18 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Verwenden Sie langsames Beschleunigen und vermeiden Sie es, die Bremse zu benutzen. - Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Schnittstelle zu entnehmen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu überführen. Die Zellen werden mit 10 ml PBS gewaschen und 5 Minuten lang bei 220 x g und 4 °C zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM-S (Schritt 1.6) und lagern Sie sie auf Eis.
4. Bestimmung der Reinheit/Lebensfähigkeit
- Für die Quantifizierung lebensfähiger Zellen mit einer Hämozytometerkammer wird eine 0,4%ige Trypanblaufärbung verwendet (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Im Durchschnitt liefert eine einzelne Maus 4-6 Millionen Zellen. - Um lebensfähige Zellen mit einem Durchflusszytometer zu quantifizieren, verwenden Sie die kommerziell erhältliche aminreaktive Fluoreszenzfarbstofffärbung (siehe Materialtabelle).
- 1 Million Zellen in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen (FACS) überführen. Verdünnen Sie den Fluoreszenzfarbstoff mit PBS in einem Verhältnis von 1:1000 (wodurch die Arbeitslösung für die Lebensfähigkeit entsteht).
- Die Proben werden mit der Viabilitätslösung im Dunkeln bei 4 °C für 30 min inkubiert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl Färbepuffer (Schritt 1.4).
- Blockieren Sie die Zellen mit 2,4G2 Anti-FcRIII/I (siehe Materialtabelle) im eiskalten Färbepuffer für 15 min bei 4 °C.
- Formulieren Sie den Antikörper-Färbecocktail durch Zugabe der fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper CD45-PerCP und CD11b-eFluor 450 zum Färbepuffer (in einer Verdünnung von 1:300) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Obwohl beide Techniken verfügbar sind, wählen Sie diejenige aus, die am besten zum nachfolgenden Protokoll passt. - Die Proben mit dem Antikörper-Färbecocktail werden im Dunkeln bei 4 °C für 30 min inkubiert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Färbepuffer. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl Färbepuffer.
- Erfassen Sie 250.000 Ereignisse auf einem Durchflusszytometer, wie durch die Gating-Strategie in Schritt 6 beschrieben (Abbildung 4).
5. Immunfluoreszenz-Färbung
- Legen Sie ein vorbehandeltes Deckglas in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: Um Deckgläser zu behandeln, geben Sie sie in eine Petrischale mit 500 μl L-Polylysin-Lösung (0,01 mg/ml, siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang. Waschen Sie sie anschließend dreimal mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie trocknen. - Säen Sie 200.000 Zellen mit 500 μl DMEM-S-Lösung auf das behandelte Deckglas. 24 Stunden inkubieren.
- Entfernen Sie die Deckgläser und fixieren Sie die Zellen mit 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit eiskaltem PBS.
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 15 min bei Raumtemperatur. Anschließend die Deckgläser dreimal mit kaltem PBS waschen. Blockieren Sie die Zellen mit 0,2% BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper (in einer Verdünnung von 1:300, siehe Materialtabelle) werden in der Blockierungslösung verdünnt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit eiskaltem PBS.
- Tragen Sie DAPI-haltiges Eindeckmedium auf den Objektträger auf und versiegeln Sie es dann mit einem Deckglas.
HINWEIS: Die Objektträger können sofort mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop analysiert oder bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden.
6. Gating-Strategie für Rückenmarksmikroglia
- Generieren Sie ein Punktdiagramm und richten Sie ein Gate ein, um lebensfähige Zellen auf der Grundlage der Viabilitätsfärbung und eines leeren Fluoreszenzkanalszu isolieren 16. Schließen Sie nicht lebensfähige Zellen aus.
- Erstellen Sie ein weiteres Diagramm unter Verwendung von Vorwärts- und Seitenstreuparametern, um Trümmerzu eliminieren 16.
- Entwicklung eines zusätzlichen Punktdiagramms und Analyse der Expression von CD11b und CD45 zur Differenzierung von Mikroglia.
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Ergebnisse
Unter Verwendung von Rückenmarksgewebe von Mäusen wurde die enzymatische Verdauung mit einer Mischung durchgeführt, die stark mit Kollagenase und Thermolysin angereichert war. Das resultierende verdaute Gewebe wurde durch einen 40-μm-Filter geleitet, um unverdautes Material zu eliminieren. Die gesammelten Zellen wurden durch einen Percoll-Dichtegradienten angereichert, wobei 90 % im unteren und 45 % im oberen Teil lagen. Die mit Mikroglia angereicherten Zellen innerhalb der Grenzfläche wurden dann mit CD45- und CD11b-Ant...
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Diskussion
Für die Untersuchung von Mikroglia wurden aufgrund ihrer Bedeutung für die Homöostase des Gehirns zahlreiche Protokolle entwickelt. Bei diesen Methoden werden Mikroglia typischerweise aus den Großhirnhemisphären von embryonalen oder neonatalen Ratten und Mäusen gewonnen17. Eine begrenzte Anzahl von Studien befasste sich mit der Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse13,14. Diese Techniken beinhalten eine enzymatische V...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Council of Science and Technology (CONACYT) unterstützt (702361). Die Autoren würdigen das Ph.D.-Programm in Biological Chemical Sciences der National School of Biological Sciences des National Polytechnic Institute.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15 mL Entnahmeröhrchen | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL Mikroröhrchen | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 Anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL Entnahmeröhrchen | Corning, USA | 430829 | |
| Ethanol | |||
| Antibiotikum-Antimykotikum (Penicillin, Streptomycin, Amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antikörper CD11b eFluor 450 gegen Maus | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antikörper CD45 PerCP gegen Maus | BioLegend, USA | 103130 | |
| Ausgewogene Salzlösung (PBS) Calcium-Magnesium-frei | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Sieb 40 μ m | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Klar Nicht behandelt | Corning, USA | CLS3736 | |
| Deckgläser | |||
| Digital Heizung Schütteln Trockenbad | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Präparierzange für die Mikrochirurgie | FT von DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´ s Modifizierter Adler&akut; s Mittelhohe Glukose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Elektrorasierer | |||
| FACS Schlauch | Thermo, USA | 352058 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | PAN Biotech, Deutschland | P30-3306 | |
| Durchflusszytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank' s ausgewogene Salzlösung | Merck, USA | H2387 | |
| L-Glutamin | Corning, USA | ||
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer Kammer Zählkammern | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | Dichtegradientenzentrifugation |
| Poly-L-Lysin-Lösung | Merck, USA | P8920 | |
| Skalpell Nr. 25 | HERGOM, Mexiko | H23 | |
| Snaplock-Mikrozentrifugenröhrchen 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoskopisches Mikroskop | Velab, Mexiko | HG927831 | |
| Gerade chirurgische Schere (10 cm) | HERGOM, Mexiko | ||
| Gerade Vannas Schere | HERGOM, Mexiko | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypanblauer Fleck 0,4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex-Mischer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | Amin-reaktive Fluoreszenzfarbstofffärbung |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
