Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Gesamtsiderophoren, Pyoverdin und Pyochelin aus Pseudomonas aeruginosa.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist dafür bekannt, dass er eine Vielzahl von Virulenzfaktoren produziert, um Infektionen im Wirt zu etablieren. Ein solcher Mechanismus ist das Abfangen von Eisen durch Siderophorproduktion. P. aeruginosa produziert zwei verschiedene Siderophore: Pyochelin, das eine geringere Eisenchelat-Affinität aufweist, und Pyoverdin, das eine höhere Eisenchelat-Affinität aufweist. Dieser Bericht zeigt, dass Pyoverdin direkt aus bakteriellen Überständen quantifiziert werden kann, während Pyochelin vor der Quantifizierung aus Überständen extrahiert werden muss.

Die primäre Methode zur qualitativen Analyse der Siderophorproduktion ist der Chrom-Azurolsulfonat-Agarplatten-Assay (CAS). In diesem Assay führt die Freisetzung des CAS-Farbstoffs aus dem^Fe3+-Farbstoffkomplex zu einem Farbwechsel von Blau zu Orange, was auf eine Siderophorproduktion hinweist. Für die Quantifizierung der gesamten Siderophore wurden bakterielle Überstände zu gleichen Teilen mit CAS-Farbstoff in einer Mikrotiterplatte gemischt, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse bei 630 nm. Pyoverdin wurde direkt aus dem bakteriellen Überstand quantifiziert, indem es zu gleichen Teilen mit 50 mM Tris-HCl gemischt wurde, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse. Ein Peak bei 380 nm bestätigte das Vorhandensein von Pyoverdin. Was Pyochelin betrifft, so war eine direkte Quantifizierung aus dem bakteriellen Überstand nicht möglich, so dass es zuerst extrahiert werden musste. Die anschließende spektrophotometrische Analyse ergab das Vorhandensein von Pyochelin mit einem Peak bei 313 nm.

Einleitung

Organismen benötigen Eisen, um verschiedene lebenswichtige Funktionen zu erfüllen, wie z. B. den Elektronentransport und die DNA-Replikation¹. Es ist bekannt, dass Pseudomonas aeruginosa, ein gramnegativer opportunistischer Erreger, eine Vielzahl von Virulenzfaktoren besitzt, um eine Infektion im Wirt zu etablieren, von denen ein Mechanismus die Siderophorbildung^{ist 2}. Unter eisenabbauenden Bedingungen setzt P. aeruginosa spezialisierte Moleküle frei, die als Siderophore bezeichnet werden und Eisen aus der Umgebung abschrecken. Siderophore chelatieren Eisen extrazellulär, und der resultierende Eisen-Siderophor-Komplex wird aktiv zurück in die Zelle^{transportiert 3}.

Es ist bekannt, dass P. aeruginosa zwei Siderophore, Pyoverdin und Pyochelin, produziert. Es ist bekannt, dass Pyoverdin eine höhere Eisenchelat-Affinität (1:1) hat, während Pyochelin eine geringere Eisen-Chelat-Affinität (2:1)⁴ aufweist. Pyochelin wird auch als sekundärer Siderophor bezeichnet, da es eine geringere Eisenchelataffinität aufweist⁵. Die Produktion und Regulation von Siderophoren wird aktiv durch Quorum Sensing (QS)-Systeme in P. aeruginosa⁶ gesteuert.

Neben der Eisenlöschung sind Siderophore auch an der Regulation von Virulenzfaktoren beteiligt und spielen eine aktive Rolle bei der Biofilmbildung⁷. Siderophore erfüllen weitere wichtige Rollen, darunter die Beteiligung an der Zellsignalisierung, die Abwehr von oxidativem Stress und die Erleichterung von Interaktionen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften⁸. Siderophore werden in der Regel nach den spezifischen funktionellen Gruppen kategorisiert, durch die sie Eisen chelatisieren. Die drei primären zweizähnigen Liganden in dieser Klassifikation sind Catecholat, Hydroxamat und α-Hydroxycarboxylat³. Pyoverdine sind Kennzeichen fluoreszierender Pseudomonas-Arten wie P. aeruginosa und P. fluorescens⁵. Sie bestehen aus einem gemischten grün fluoreszierenden Chromophor, der an ein Oligopeptid gekoppelt ist, das 6-12 Aminosäuren enthält. An ihrer Synthese sind mehrere nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPs) beteiligt⁹. Vier Gene, die an der Produktion und Regulation von Pyoverdin beteiligt sind, sind pvdL, pvdI, pvdJ und pvdD¹⁰. Pyoverdin ist auch für Infektionen und Virulenz bei Säugetieren verantwortlich¹¹. Es ist bekannt, dass P. aeruginosa Pyochelin unter mäßig eisenlimitierenden Bedingungen produziert, während Pyoverdin unter schweren eisenlimitierenden Umgebungen produziert wird¹². Zwei Operone, die an der Pyochelinproduktion beteiligt sind, sind pchDCBA und pchEFGHI¹³. Es wird darauf hingewiesen, dass Pyochelin (Katecholat) in Gegenwart von Pyocyanin oxidative Schäden und Entzündungen induziert und Hydroxylradikale erzeugt, die für das Wirtsgewebe schädlich sind¹¹.

Der Chrom-Azurolsulfonat-Assay (CAS) ist aufgrund seiner Umfassendheit, seiner hohen Sensitivität und seines größeren Komforts im Vergleich zu mikrobiologischen Assays, die zwar empfindlich, aber überspezifisch sein können, weit verbreitet¹⁴. Der CAS-Assay kann auf Agaroberflächen oder in einer Lösung durchgeführt werden. Es beruht auf der Farbänderung, die auftritt, wenn das Eisen-Ion von seinem intensiven blauen Komplex zu orange übergeht. Der kolorimetrische CAS-Assay quantifiziert die Verarmung von Eisen aus einem ternären Fe-CAS-Tensidkomplex. Dieser spezielle Komplex, bestehend aus Metall, organischem Farbstoff und Tensid, hat eine blaue Farbe und weist einen Absorptionspeak bei 630 nm auf.

In diesem Bericht wird eine Methode zum qualitativen Nachweis der Siderophorproduktion vorgestellt, bei der die Produktion von Siderophoren auf einer Agarplatte nachgewiesen werden kann. Eine Methode zur quantitativen Abschätzung der gesamten Siderophorproduktion in einer Mikrotiterplatte und zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von zwei Siderophoren, Pyoverdin und Pyochelin, aus P. aeruginosa wird ebenfalls bereitgestellt.

Protokoll

Alle Bakterienisolate von P. aeruginosa wurden aus medizinischen mikrobiologischen Labors in Vadodara und Jaipur, Indien, bezogen. Alle ausgewählten klinischen Isolate wurden in der Biosicherheitswerkbank (BSL2) gehandhabt und beim Umgang mit Bakterienisolaten während der Experimente wurde äußerste Sorgfalt walten lassen. Die kommerziellen Details aller Reagenzien/Lösungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Chrom-Azurolsulfonat (CAS)-Farbstoff und Agar-Agar-Medien

1. CAS-Farbstoff (100 ml) mit der folgenden Zusammensetzung herstellen:
   1. 60 mg CAS werden in 50 ml destilliertem Wasser (Lösung 1) gelöst.
   2. 2,7 mg FeCl₃·_6H2Owerden in 10 ml 10 mM HCl (Lösung 2) gelöst.
   3. 73 mg Cetrimoniumbromid (HDTMA) werden in 40 ml destilliertem Wasser (Lösung 3) gelöst.
   4. Mischen Sie Lösung 1, Lösung 2 und Lösung 3 vorsichtig. Bewahren Sie es in einer Glasflasche auf.
2. Bereiten Sie CAS-Agar vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. 100 ml MM9-Salzlösung in 750 ml destilliertes Wasser geben.
   2. 32,24 g Piperazin-N,N'-BIS(2-ethansulfonsäure)-freie Säure (PIPES) werden gelöst.
   3. Fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklavieren und abkühlen lassen.
   4. Geben Sie 30 ml sterile Casaminosäurelösung und 10 ml sterile 20%ige Glukoselösung in die Mischung.
   5. Fügen Sie 100 ml CAS-Farbstoff hinzu, mischen Sie ihn und gießen Sie ihn unter aseptischen Bedingungen ein.
      ANMERKUNG: Die Herstellung von MM9-Medien, Casaminosäurelösung und 8-Hydroxychinolin ist in der Zusatzdatei 1 enthalten. PIPES-Puffer ist pH-empfindlich. Es löst sich erst auf, wenn ein pH-Wert von 5,6 erreicht ist. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert ständig überwacht wird, denn wenn sich PIPES in Wasser aufzulösen beginnt, wird der pH-Wert weiter gesenkt. Extrakt Casaminosäure mit dem gleichen Volumen von 3% 8-Hydroxychinolin, gelöst in Chloroform. Lassen Sie die nicht mischbare Lösung ca. 20 min bei 4 °C stehen und fangen Sie die obere Phase der Lösung vorsichtig auf, ohne die untere Phase zu stören.

2. Qualitative Analyse der Produktion von Siderophoren

1. Stellen Sie den OD₆₀₀ nm auf 0,2 für 24 h gewachsene Kulturen von P. aeruginosa ein.
2. Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Bakterienkultur auf eine CAS-Agarplatte zu streichen.
3. 24 h bei 30 °C inkubieren.
   HINWEIS: Zur Verdünnung der Bakterienkultur können Pepton-Wassermedien oder 0,8 % normale Kochsalzlösung verwendet werden. Wenn nach 24 Stunden kein Bakterienwachstum beobachtet wird, werden die CAS-Platten 48 bis 72 Stunden lang inkubiert.

3. Quantitative Schätzung der gesamten Siderophore

1. 24-Stunden-Kulturen von P. aeruginosa werden in Pepton-Wassermedien erneut inokuliert, nachdem der OD₆₀₀ nm auf 0,25 eingestellt wurde, und 48 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.
2. Nach 48 h zentrifugiert man die Bakterienkultur bei 4650 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
3. Nach der Zentrifugation werden 100 μl zellfreier Überstand auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und 100 μl CAS-Farbstoff hinzugefügt.
4. Die Platte mit Alufolie abdecken und bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.
5. Nach der Inkubation werden spektrophotometrische Messungen bei 630 nm durchgeführt.
6. Berechnen Sie die erhaltenen Ergebnisse für die Quantifizierung der gesamten Siderophore als prozentuale Siderophoreinheit (PSU).
   HINWEIS: Das Netzteil kann wie folgt berechnet werden: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   wobei A_r = Absorption der Referenz bei 630 nm, A_s = Absorption des zellfreien Überstandes der Probe. Als Referenz sollte der CAS-Farbstoff zu nicht inokulierten Pepton-Wassermedien hinzugefügt werden. Füllen Sie alle Gläser wie Reagenzgläser, Kolben usw. 2 h lang mit 6 M HCl und spülen Sie sie zweimal mit destilliertem Wasser ab, um alle Spuren von Eisen zu entfernen.

4. Quantitative Schätzung von Pyoverdin

1. 24 h gezüchtete Kulturen von P. aeruginosa in Pepton-Wassermedien nach Einstellung von OD₆₀₀ nm auf 0,25 erneut inokuliert und 48 h bei 30 °C inkubiert.
2. Messen Sie nach 48 Stunden den OD₆₀₀ nm des Bakterienwachstums, bevor Sie fortfahren.
3. Die Bakterienkultur wird bei 4650 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
4. Nach der Zentrifugation werden 100 μl zellfreier Überstand auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) hinzugefügt.
5. Führen Sie spektralphotometrische Messungen bei OD₄₀₅ nm durch.

5. Pyochelin-Extraktion und Spektrophotometrie

1. 24-h-gezüchtete Kulturen von P. aeruginosa werden in King's B-Medien (Ergänzungsdatei 1) erneut inokuliert, nachdem OD₆₀₀ nm auf 0,25 eingestellt wurde, und 24 h lang bei 30 °C inkubiert.
2. Nach 24 h werden 100 ml Kultur entnommen und bei 4650 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
3. Nach der Zentrifugation werden 5 ml 1 M Zitronensäure in den Überstand gegeben. Zweimal mit 50 ml Ethylacetat extrahieren.
4. Die organische Phase mit Magnesiumsulfat durch einen Spritzenvorsatzfilter filtrieren. Lagern Sie die filtrierte organische Phase bei -20 °C.
5. Führen Sie spektralphotometrische Messungen bei 320 nm durch.
   HINWEIS: Da Pyochelin bei Raumtemperatur eine sehr instabile Verbindung ist, führen Sie den Extraktionsprozess auf Eis durch. Verwenden Sie eine sterile 50-ml-Spritze für die Filtertrennung. Legen Sie Watte auf die Spitze der Spritze und geben Sie 1 g Magnesiumsulfat darauf. Befestigen Sie einen sterilen Spritzenfilter an der Spitze der Spritze und sammeln Sie das Filtrat in einem sterilen Röhrchen.

Ergebnisse

Vor der Quantifizierung von Siderophoren aus klinischen Isolaten wurde ein qualitatives Screening auf die Siderophorproduktion durchgeführt, um die Produktion von Siderophoren sicherzustellen. Der qualitative Nachweis von Siderophoren aus klinischen Isolaten wurde durch streifende Bakterien auf CAS-Agarplatten beobachtet. Drei klinische Isolate, nämlich MR1, TL7, J3, sowie PAO1 (der Referenzstamm), wurden für die Studie ausgewählt. Alle drei klinischen Isolate und PAO1 zeigten positive Er...

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, die Gesamtzahl der Siderophore und zwei verschiedene Siderophore von P. aeruginosa, nämlich Pyoverdin und Pyochelin, aus dem bakteriellen zellfreien Überstand zu quantifizieren. Im CAS-Agarplatten-Assay bilden der CAS-Farbstoff und^Fe3+-Ionen einen Komplex. Wenn Bakterien Siderophore produzieren, löschen sie^Fe-3+-Ionen aus dem CAS-Fe3⁺-Komplex, was zu einer Farbänderung um das Bakterienwachstum herum führt. Diese Veränderung führt zu e...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar-Agar, Typ I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxychinolin	Loba Chemie	4151
Casaminosäure	SRL Chemikalien	68806
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chromazurolsulfonat	HIMEDIA	RM336-10G
Zitronensäure	Merck	100241
Dextrose-Monohydrat	Merck	108342
Dichlormethan	Merck	107020
Eisenchlorid-Hexahydrat	HIMEDIA	GRM6353
Glaskolben	Borosil	5100021
Glas Reagenzgläser	Borosil	9820U05
Salzsäure	SDFCL	20125
King's Medium B Base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salze	HIMEDIA	G013-500G
Magnesiumsulfat	Qualigens	10034
MultiskanGO UV-Spektralphotometer	Thermo Scientific	51119200
Pepton Typ I, bakteriologisch	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES freie Säure	MP Biomedicals	190257
Kaliumdihydrogenphosphat	Merck	1048731000
Proteose Pepton	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spektralphotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Natriumchlorid	Qualigens	15915