<ol><li> Konstruieren Sie eine Flusskammer wie im Video gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Parafilm wieder dicht ist und dem Gebrauch gewaschen Deckgläser. </li><li> Inkubieren Aktin-Bindemittel in der Kammer für 5-10 &quot;. </li><li> Block unspezifische Bindungsstellen auf dem Deckglas mit einer hemmenden Proteins. </li><li> Polymerisieren Aktin in der Kammer durch fließendes in G-Aktin-Polymerisation in Puffer. </li><li> Washout polymerisierten Aktin durch fließendes über Puffer. </li></ol>

Überwachung aktin demontage mit zeitraffer-mikroskopie

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Okay, was ich heute zeigen möchte, ist, wie man eine Durchflusskammer, eine Fusionskammer zur Bildgebung an einem aufrechten Mikroskop, konstruiert. Dazu erzeuge ich zwei Bereiche mithilfe von Folie. Dazu nehme ich die Parafolie und schneide sie in kleine Streifen.Danach werde ich im Wesentlichen die Kanäle für die Wände bilden und trockne sie mit schrägem Luftstrom. Ich lege den Deckglaser auf das Para. Hier ist das fertige Präparat. Anschließend erhitze ich es auf einem Heizblock, um das Para zu schmelzen und im Wesentlichen eine Abdichtung zu erzeugen.Das hier ist also das Deckglas, und darauf befinden sich, wie Sie hier sehen, zwei Schichten aus Phim. Darüber liegt erneut ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas, genau dieses hier, das ich gegen das Param drückte, um die Abdichtung zu erzielen.Okay, die Flüssigkeit wird hier in die eine Richtung eingeführt, und ich kann sie hier mit einem Filterpapier in dieser Richtung abziehen. Ich zeige Ihnen gleich, wie das funktioniert. Was ich gerne mache, ist, es in eine befeuchtete Kammer zu stellen, was sehr einfach ist.Nehmen Sie zwei Arten erhöhter Streifen und legen Sie ein Filterpapier darunter. Und um es geräuschvoll zu halten, lege ich das Deckglas auf die Durchflusskammer. Um eine Lösung in die Kammer einzubringen, setzen Sie die Pipettenspitze einfach am Eingang der Kammer an und geben die Flüssigkeit ab.Jetzt inkubiere ich die Kammer mit geschlossenem Deckel für 10 Minuten. Um die Flüssigkeit von der anderen Seite abzusaugen, nehme ich normalerweise ein Filterpapier und schneide es in dünne Streifen wie diesen. Einen dieser dünnen Streifen verwende ich, um gleichzeitig die Lösung am Eingang zuzugeben und das Filterpapier am Ausgang anzusetzen, um den Austausch, also die Lösung, abzusaugen.Sie werden sehen, wie die Flüssigkeit durch die Lösung fließt. Dann warte ich fünf Minuten auf den mittleren Abschluss. Nun bin ich bereit, das Aktin tatsächlich in die Flusskammer einzubringen; das Aktin muss ich polymerisieren, und zwar direkt innerhalb der Flusskammer, wobei die gleichen Verfahren wie zuvor angewendet werden.Da nun die Aktion polymerisiert ist, wasche ich die überschüssige, nicht polymerisierte Aktion mit einem großen Puffer-Volumen aus. Hier habe ich etwa hundert Mikroliter, was einigen Reaktionskammer-Volumina an Puffer entspricht. Einfach so, wie Sie wissen, wenn das Filterpapier gesättigt ist, muss ich die Richtung wechseln. Okay?Und so bin ich bereit, damit die Bildgebung durchzuführen. Die Perfusionskammer mit an ihr befestigtem Aktin liegt vor. Nun nehme ich den Objektträger, befestige ihn unter dem Mikroskop und da ich mit einem Öl-Objektiv abbilde, gebe ich etwas Immersionsöl auf die obere Oberfläche des Deckglases, sodass der Öltropfen die Lösung, das Protein oder jegliches Material auf dem Aktin im Inneren erreicht.Was ich also mache, ist, dass ich die Lösung während der zeitraffenden Bildaufnahme tatsächlich austauschen kann. So eben.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

<ol><li> Konstruieren Sie eine Flusskammer wie im Video gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Parafilm wieder dicht ist und dem Gebrauch gewaschen Deckgläser. </li><li> Inkubieren Aktin-Bindemittel in der Kammer für 5-10 ". </li><li> Block unspezifische Bindungsstellen auf dem Deckglas mit einer hemmenden Proteins. </li><li> Polymerisieren Aktin in der Kammer durch fließendes in G-Aktin-Polymerisation in Puffer. </li><li> Washout polymerisierten Aktin durch fließendes über Puffer. </li></ol>

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

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