<ol><li> Konstruieren Sie eine Flusskammer wie im Video gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Parafilm wieder dicht ist und dem Gebrauch gewaschen Deckgläser. </li><li> Inkubieren Aktin-Bindemittel in der Kammer für 5-10 &quot;. </li><li> Block unspezifische Bindungsstellen auf dem Deckglas mit einer hemmenden Proteins. </li><li> Polymerisieren Aktin in der Kammer durch fließendes in G-Aktin-Polymerisation in Puffer. </li><li> Washout polymerisierten Aktin durch fließendes über Puffer. </li></ol>

Überwachung aktin demontage mit zeitraffer-mikroskopie

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Okay, was ich heute tun möchte, ist, Ihnen zu zeigen, wie man eine Strömungskammer konstruiert, eine Fusionskammer für die Bildgebung an einem aufrechten Mikroskop. Was ich dann mache, ist, dass ich mit Film zwei Räume erschaffe. Was ich also mache, ist, dass ich den Para-Film nehme und ihn in kleine Streifen schneide.Als nächstes werde ich im Grunde die Kanäle für die Wände bilden und sie mit gekippter Luft trocknen. Ich habe den Deckzettel auf den Para gelegt, Und hier ist das Fertige. Dann erhitze ich es auf einem Heizblock, um den Parameter zu schmelzen und im Grunde eine Versiegelung zu erzeugen.Das ist also das Deckglas hier, und dann auf dem Deckglas befinden sich zwei Schichten Phim, wie Sie hier sehen. Und dann gibt es dann wieder einen, es ist ein 22 mal zwei Mil Meter großer Deckzettel. Dieser hier, den ich gegen den Param drückte, um das Siegel fallen zu lassen.Okay, also die Flüssigkeit geht hier in eine Richtung rein und ich kann sie hier mit einem Filterpapier in diese Richtung aussaugen. Und ich zeige Ihnen gleich, wie das geht. Was ich also gerne mache, ist, dass ich es gerne in eine befeuchtete Kammer lege, was sehr einfach ist.Nehmen Sie zwei Arten von erhöhten Streifen und legen Sie einen Papierfilter darunter. Und um es so laut zu halten, wie ich, lege ich die Abdeckung und den Deckslip auf die Durchflusskammer. Die Art und Weise, wie Sie eine Lösung in die Kammer einführen, besteht darin, dass Sie einfach die Pipettenspitze an den Eingang der Kammer setzen und einfach teilen.Jetzt inkubiere ich die Kammer bei geschlossenem Deckel für 10 Minuten. Was ich normalerweise mache, um die Flüssigkeit von der anderen Seite herauszusaugen, ist, sie zu verwenden, ein Filterpapier zu holen und sie in dünne Streifen zu schneiden, wie dieser. Und ich nehme einen dieser dünnen Streifen und trage gleichzeitig die Lösung in den Eingang auf, während ich das Filterpapier an den Ausgang lege, um den Austausch, die Lösung, zu saugen.Sie werden also sehen, wie die Flüssigkeit durch die Lösung fließt. Und dann warte ich fünf Minuten auf den Mid Close. Jetzt bin ich bereit zu tun, das Aktin und das Aktin, ich muss tatsächlich polymerisieren, ich polymerisiere in der Durchflusskammer und es ist genau das gleiche Verfahren vorher.Denn auf diese Weise, und dann, jetzt, wo die Wirkung polymerisiert ist, wasche ich all die nicht überschüssige, nicht polymerisierte Wirkung mit einem großen Volumen nur Puffer aus. Hier habe ich also etwa hundert Mikroliter und es sind ein paar Reaktionskammervolumen Puffer. Wenn das Filterpapier gesättigt ist, muss ich die Richtung ändern. Okay?Und so bin ich bereit, damit Bildgebung zu machen. Also Perfusionskammer mit daran befestigtem Aktin. Jetzt nehme ich den Objektträger, montiere ihn unter dem Mikroskop, und da ich mit einem Ölobjektiv bilde, werde ich etwas Immersionsöl auf die Oberseite der Abdeckung auftragen, Gras berühren, wie z.B. die Lösung oder das Protein oder irgendetwas über die Wirkung im Inneren beurteilen.Was ich also mache, ist, dass ich die Lösungsseite austauschen kann, während ich das Zeitraffer-Imaging mache. Schlechthin.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

<ol><li> Konstruieren Sie eine Flusskammer wie im Video gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Parafilm wieder dicht ist und dem Gebrauch gewaschen Deckgläser. </li><li> Inkubieren Aktin-Bindemittel in der Kammer für 5-10 ". </li><li> Block unspezifische Bindungsstellen auf dem Deckglas mit einer hemmenden Proteins. </li><li> Polymerisieren Aktin in der Kammer durch fließendes in G-Aktin-Polymerisation in Puffer. </li><li> Washout polymerisierten Aktin durch fließendes über Puffer. </li></ol>

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

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