In diesem Artikel wird ein optimiertes Protokoll für die Etablierung eines Pulpitis-Modells bei Mäusen unter Verwendung eines innovativen Mundknebels vorgestellt, gefolgt von einer anschließenden histologischen Analyse.
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Methodenartikel
Etablierung eines murinen Pulpa-Expositionsmodells mit einem neuartigen Mundknebel für die Pulpitisforschung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pulpitis, eine häufige Ursache für natürlichen Zahnverlust, führt zu Nekrose und Verlust der Bioaktivität in der entzündeten Zahnpulpa. Die Aufklärung der Mechanismen, die der Pulpitis zugrunde liegen, und ihre effiziente Behandlung ist ein ständiger Schwerpunkt der endodontischen Forschung. Daher ist das Verständnis des Entzündungsprozesses in der Zahnpulpa für die Verbesserung der Pulpakonservierung von entscheidender Bedeutung. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Experimenten bietet ein murines Pulpitis-Modell einen authentischeren und genetisch vielfältigeren Kontext, um das pathologische Fortschreiten der Pulpitis zu beobachten. Die Verwendung von Mäusen stellt jedoch trotz ihrer Kosteneffizienz und Zugänglichkeit aufgrund ihrer geringen Größe, schlechten Koordination und geringen Verträglichkeit Schwierigkeiten dar, was intraorale und zahnärztliche Eingriffe erschwert. Dieses Protokoll führt ein neuartiges Design und die Anwendung eines Mundknebels ein, um die Pulpa von Mäusen freizulegen und so effizientere intraorale Verfahren zu ermöglichen. Der Mundknebel, der aus einem Zahnbogen besteht, ist den meisten Zahnärzten leicht zugänglich und kann die chirurgische Vorbereitung erheblich beschleunigen, selbst bei erstmaligen Eingriffen. Mikro-CT, Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Immunfluoreszenz-Färbung wurden verwendet, um Veränderungen in der Morphologie und Zellexpression zu identifizieren. Das Ziel dieses Artikels ist es, Forschern dabei zu helfen, ein reproduzierbareres und weniger anspruchsvolles Verfahren zur Erstellung eines Pulpaentzündungsmodells mit diesem neuartigen Mundknebel zu etablieren.
Einleitung
Die Zahnpulpa, ein integraler Bestandteil des Zahns, ist für mehrere wesentliche Funktionen wie Nährstoffversorgung, Dentinbildung, sensorische Funktion und Abwehrreaktionen verantwortlich1. Dennoch ist die von Hartgewebe umgebene Zahnpulpa anfällig für Verletzungen und Schäden durch tiefe Karies, Pulpitis, Trauma oder Folgetherapien 2,3. Das Fehlen von funktioneller Zahnpulpa erhöht das Risiko einer Zahnbrüchigkeit4. Darüber hinaus kann der Verlust der Vitalität der Pulpa bei jungen bleibenden Zähnen die Zahnreifung negativ beeinflussen, und die derzeitigen Prothesentechniken können das neuronale Feedback, das eine gesunde Pulpa bietet, nicht wiederherstellen4. Diese Situation hat Forscher dazu veranlasst, alternative Lösungen für den Umgang mit entzündeter Pulpa zu erforschen, die über die bloße Entfernung hinausgehen.
Im Jahr 2007 initiierten Murray et al. die Anwendung von Tissue Engineering in der regenerativen Endodontie und weckten damit ein erhöhtes Interesse an der Erhaltung und Regeneration der Pulpa5. Entzündetes Pulpagewebe stellt jedoch eine Herausforderung dar, da die Zellen Entzündungsfaktoren wie IL-6 freisetzen, die Entzündungszellen rekrutieren und zu Zellnekrose, Verlust der Pulpavitalität und Komplikationen bei der funktionellen Wiederherstellung führen 6,7. Das Verständnis von Entzündungen und dem damit verbundenen Zelltod ist daher entscheidend für Fortschritte bei der Konservierung vitaler Pulpa. Es gibt eine Reihe von Experimenten, die durchgeführt wurden, um die Molekularbiologie der entzündeten Pulpa in vivo oder in vitro zu erforschen 8,9. Obwohl In-vitro-Experimente wie 2D- oder 3D-Zellkulturen seit Jahren entwickelt werden und ausgereift sind und weit verbreitet sind, um Reaktionen von Pulpazellen auf Entzündungsfaktoren zu testen, können diese Experimente die Interaktion zwischen Pulpagewebe und dem systemischen Immunsystem nicht widerspiegeln10. Wenn das untersuchte Phänomen aus Zellen anderer Gewebeherkunft wie Immun-, Gefäß- und Nervensystem stammt, führt die reine Zellkultur in eine Sackgasse. Daher sind In-vivo-Experimente sehr notwendig und referenziell.
Mäuse sind aufgrund ihrer Kosteneffizienz, hohen Fruchtbarkeit und Vitalität zunehmend zu einer häufigen Wahl in der Entzündungsforschung in vivo geworden. Ein umfassendes Protokoll für das Pulpitis-Modell von Mäusen gibt es derzeit jedoch nicht, das als Referenz dienen kann. Die geringe Größe der Mäuse und ihre Empfindlichkeit gegenüber Stimulation stellen eine große Herausforderung bei den experimentellen Verfahren dar. Die Beobachtung der winzigen Zähne, die tief im Mund der Maus verborgen sind, erfordert oft den Einsatz eines Auslegermikroskops, ungeachtet der häufigeren Präsenz von Tischmikroskopen in Laboratorien. Das Fehlen eines Mundöffners erfordert die Hilfe anderer. Um dies zu beheben, hat die Gruppe einen Mundknebel aus leicht verfügbaren Materialien entwickelt, der ein standardisiertes und reproduzierbares Protokoll für die Konstruktion des Pulpitis-Modells von Mäusen bereitstellen soll. In diesem Artikel wird das Verfahren detailliert beschrieben, das die präoperative Vorbereitung, die Immobilisierung, die Pulpafreilegungsoperation und die Probenentnahme an C57-Mäusen umfasst. Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung des Mundknebels und liefert Informationen über seine Struktur, Herstellung und Anwendung, um anderen Forschern die Replikation des Verfahrens zu erleichtern.
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Protokoll
Die experimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan genehmigt (WCHSIRB-D-2021-125). Adulte C57BL/6-Mäuse wurden von der Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China, gewonnen. Die gesamte Krone des ersten Backenzahns des Oberkiefers bricht 21 Tage nach der Geburt durch. Mäuse für die Operation sollten älter als 21 Tage sein und eine normale Vitalitätaufweisen 11. Hier wurden 6 bis 8 Wochen alte Mäuse für die Modellierung verwendet. Abbildung 1 ist ein Flussdiagramm, das das verwendete Protokoll zeigt.
1. Präoperative Vorbereitung (Abbildung 2)
- Besorgen Sie sich folgende Instrumente: Stereoskopisches Mikroskop, Fixierplatte, medizinisches Klebeband, Mundknebel, minimalinvasiver Zahnfräser mit einem Durchmesser von 0,6 mm, zahnärztliches Hochgeschwindigkeits-Zahnhandstück, 8# C+ Feile, Heizkissen, 1 mL Spritze, steriler Wattebausch, Augenzange.
- Besorgen Sie sich die folgenden Medikamente: Anästhesiemischung, Veterinärsalbe.
2. Vorbereitung des Mundknebels
- Wiegen und betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesie-Mix-Lösung (10 % Ketaminhydrochlorid + 5 % Xylazin + 85 % sterile isotonische Kochsalzlösung) bei 0,007 ml/g Körpergewicht und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie durch die Zehenkneifmethode. Tragen Sie eine Augenschmiersalbe auf die Augen auf, um Augenverletzungen durch Austrocknung während der Operation zu vermeiden.
HINWEIS: Medizinische Hüte, Masken, Handschuhe und Overalls sowie andere grundlegende Schutzmaßnahmen sind erforderlich. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Operationsumgebung als auch die Mauskammer sauber und sicher sind. Ein Wärmekissen zur thermischen Unterstützung während des gesamten Eingriffs ist erforderlich. - Bereiten Sie den Mundknebel wie unten beschrieben vor (Abbildung 3).
- Beziehen Sie folgende Materialien: Kieferorthopädischer Bogendraht mit einem Durchmesser von 8 μm, eine junge Schlaufenbiegezange, ein schwerer Drahtschneider, ein Markierungsstift, eine Gummikappe mit einer Länge von 3 mm und einem Querschnittsdurchmesser von 1 mm.
- Zuerst richten Sie den Bogendraht mit der linken Hand zur Fixierung aus und Daumen, Zeigefinger der rechten Hand beugen sich leicht gegen den Drahtbogen. Wiederholen Sie diese Aktion mehrmals, um das Biegen auf den richtigen dreidimensionalen Winkel zu erleichtern.
- Biegen Sie mit der Yong-Schlaufenbiegezange die Oberkante (Bild 3G, a-i) des Trapezes (Bild 3C, a-l-k-b) etwa 8 mm lang in der Mitte des Bugdrahtes. Stellen Sie sicher, dass sich Punkt a (Abbildung 3) am Rand des Zangeschnabels befindet.
- Halten Sie die Zange mit der linken Hand fest, klemmen Sie mit dem rechten Daumen und Zeigefinger das freie Ende des Bügeldrahtes fest und biegen Sie den Bügeldraht von Punkt a aus in einen Winkel von etwa 120°. Duplizieren Sie die vorherige Aktion bei Punkt i (Abbildung 3G). Überprüfen Sie, ob sich der Bogen auf einer Ebene befindet, indem Sie ihn ohne Aufhebeln auf einen horizontalen Tisch legen.
- Lassen Sie auf jeder Seite etwa 9 mm Länge (Abbildung 3D, a-b, l-k) und biegen Sie das freie Ende in einen 75°-Winkel, indem Sie die gleiche Vorgehensweise wie in Schritt 2.2.4 anwenden, wobei Sie darauf achten, dass sich jede Kante auf einer Ebene befindet. Biege diesen spitzen Winkel mit der Spitze des Zangeschnabels.
- Finde den Punkt c etwa 5 mm von Punkt b entfernt. Befolgen Sie die gleiche Fähigkeit, um einen 105°-Winkel auf Punkt c zu biegen. Biegen Sie einen weiteren 105°-Winkel an Punkt d 5 mm von Punkt c entfernt. Lassen Sie etwa 4,5 mm von Punkt d entfernt und suchen Sie Punkt e. Biegen Sie das freie Ende an Punkt e so, dass es einen Winkel von etwa 100 -105° bildet (Abbildung 3E).
HINWEIS: Die 6-8 Wochen alten C57-Mäuse, die wir verwendet haben, wogen etwa 20 g. Der Abstand von 5 mm könnte nicht nur den Ober- und Unterkiefer der Mäuse einklemmen, ohne sich zu bewegen, sondern würde auch nicht auf die Haut der Mäuse drücken und Beschwerden verursachen. Wenn andere Arten oder Alter von Mäusen verwendet werden, passen Sie bitte die Länge der c-d- und i-h-Teile an die tatsächliche Situation an (Abbildung 3E, G). - Beugen Sie einen zusätzlichen Zungenspatel für den Unterkieferteil (Abbildung 3G, j-i-h-g).
- Doppelte Biegeschritte des a-b-c-Teils auf dem l-k-j-Teil. Klemmen Sie i-k- und k-j-Teile gleichzeitig und biegen Sie das freie Ende an Punkt j, um es senkrecht zur i-k-j-Ebene zu machen. Klemmpunkt i, der 5 mm von Punkt j entfernt ist, biegen Sie das freie Ende so, dass es sowohl zur i-k-j-Ebene als auch zum c-d-Teil parallel ist (Abbildung 3H).
- Lassen Sie 5 mm Länge von Punkt i, biegen Sie den Bogen an Punkt h vertikal zum i-h-Teil und parallel zur j-i-h-Ebene. Ermitteln Sie Punkt g bei 5 mm von Punkt h. Klemmen Sie die Ebene j-i-h-g und biegen Sie das freie Ende symmetrisch zum k-j-Teil. Dann sollte das freie Ende nach dem Punkt f symmetrisch zum freien Ende des Punktes e sein (Abbildung 3H).
- Setzen Sie Gummikappen auf das freie Ende (Abbildung 3F).
3. Immobilisierung
- Fixieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Fixierplatte, wobei die Gliedmaßen mit Hautband gesichert sind. Die freien Enden des Mundknebels mit Daumen und Zeigefinger zusammendrücken.
- Fixieren Sie die vorderen Schneidezähne der Maus in der trapezförmigen Rille von zwei Armen. Stellen Sie sicher, dass der Arm mit dem Zungenspatel für den Unterkiefer bestimmt ist. Passen Sie den Mundknebel an, um sicherzustellen, dass die Zunge der Maus immobilisiert, aber nicht ischämisch ist.
4. Beurteilung der Zähne
- Stellen Sie sicher, dass der erste Backenzahn des Oberkiefers für die Operation frei von Karies, Traumata und Odontogenese ist. Stellen Sie sicher, dass sich keine Rötungen, Schwellungen oder Fisteln auf der umgebenden Gingiva befinden. Stellen Sie sicher, dass die gegenüberliegenden Zähne gesund sind und als gesunde Kontrollgruppe zur Verfügung stehen.
5. Exposition der Pulpa
- Bohren Sie mit Zahnfräser an der okklusalen Seite des ersten Molaren des Oberkiefers mit einer Drehzahl von 20.000 U/min. Stellen Sie sicher, dass der Zahnschmelz entfernt wird. Halten Sie die Operation mit dem zahnärztlichen Handstück nur in einer flachen Dentinschicht, um eine übermäßige thermische Stimulation des Zahnpulpagewebeszu vermeiden 12.
- Verhindern Sie gleichzeitig eine Überhitzung, indem Sie während der Operation alle 3 Minuten mit einer Spritze normale Kochsalzlösung auf den Zahn tropfen.
- Legen Sie eine 8# oder 10# C+ Feile auf die unterste Position der Bohrgrube und stechen Sie durch das letzte Dentin, um die Pulpakammer freizulegen. Es wird ein offensichtliches Sturzgefühl sein, wenn das lokale Dentin gründlich entfernt wird. Nicht zu tief bohren, da sonst Zahnpulpagewebe aus der Pulpakammer herausgeholt werden könnte.
- Reinigen Sie die Fragmente um den Zahn herum. Nehmen Sie den Mundknebel ab; Die Operation ist abgeschlossen. Verwenden Sie den gegenüberliegenden ersten Molaren des Oberkiefers als Kontrolle ohne Operation.
6. Nachsorge
- Verabreichen Sie nach der Operation Carprofen (5 mg/kg) subkutan und legen Sie die Maus bis zur Genesung aus der Narkose in Bauchlage auf das chemothermische Heizkissen. Füttern Sie die Mäuse und stellen Sie Trinkwasser zur Verfügung. Der Wiederherstellungsprozess sollte überwacht werden. Keine anderen Tiere sollten sich in derselben Kammer befinden, bis sich die Maus vollständig erholt hat.
7. Probenentnahme und -lagerung
- Euthanasieren Sie die Maus mit zervikaler Luxation unter tiefer Betäubung 24 Stunden nach der Operation oder zu einem anderen Zeitpunkt gemäß Experiment9. Schneiden Sie die Skelettmuskulatur, die am Oberkiefer und am Jochbein befestigt ist, mit einer Augenschere durch. Skelett, Stirnbein und Weichgewebe entfernen und die Lamina gnathostegit mit den Oberkiefermolaren herausnehmen.
HINWEIS: Laut He et al. wird empfohlen, dass die Pulpitis-Probe weniger als 72 Stunden nach der Operation entnommen werden sollte, um eine ausgedehnte Nekrose im Zahnpulpagewebe zu vermeiden13. - Teilen Sie das Gnathostegit sagittal in zwei Hälften und lagern Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, bei 4 °C für die 24h-Fixierung.
8. Histologische Analyse
- Waschen Sie das Gewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entkalken Sie es in täglich gewechselter Entkalkungslösung von 5 % EDTA und 4 % Saccharose in PBS, pH 7,4, bei 4 °C für 2-4 Wochen10.
- Betten Sie den 1/2 Gnathostegit in Paraffin ein und stellen Sie sicher, dass sich das sagittale Gesicht ohne Zähne am unteren Rand der Gewebekassetten befindet.
- Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Paraffinmikrotom in 5 μm dicke Scheiben. Passen Sie den Winkel des Paraffinblocks entsprechend der unter dem Mikroskop beobachteten proximalen, distalen, oberen und unteren Beziehung an, um sicherzustellen, dass die gesamte Kronenpulpa und die Perforation des ersten Molaren durchtrennt werden können.
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Ergebnisse
Das oben beschriebene Verfahren wurde an den ersten Molaren des rechten Oberkiefers von 3 6-8 Wochen alten C57BL/6-Mäusen durchgeführt, während die ersten Molaren des linken Oberkiefers als Kontrolle erhalten blieben. Zur Demonstration wurden histologische und immunfluoreszierende Ergebnisse der Blindkontrolle, 12-stündige Pulpitis- und 24-stündige Pulpitis-Proben verwendet.
Nach dem Protokoll der CT-Analyse von Goldman et al.15 wurde die Exposition der Pulpa durch Mikr...
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Diskussion
Als einzelnes Weichgewebe in den Zähnen spielt die Zahnpulpa eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Bioaktivität des Zahns, bleibt aber hochempfindlich. Die Erhaltung dieser lebenswichtigen Pulpa hat sich in den letzten endodontischen Behandlungen zum bevorzugten Ansatz entwickelt, was ein umfassendes Verständnis der Entzündungsmechanismen der Zahnpulpa erforderlich macht16. Die räumlich-zeitliche Fluktuation der inflammatorischen Mikroumgebung und die Wechselwirkungen zwischen res...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) und 82100982 (F. L.) sowie durch das Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.) finanziert. Alle Originaldaten und Bilder sind in diesem Artikel enthalten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Animal | |||
| C57/B6J Mäuse | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | Für die Etablierung der Zellstoffexposition |
| Equipment | |||
| mL Spritze | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrumente Co. LTD. | SB1-074(IV) | Bei der Injektion von Arzneimitteln anwenden. |
| 8# C+ Datei | Readysteel | 0010047 | Anwenden bei der Freilegung des Daches der Zellstoffkammer. |
| Anästhesie-Mix-Lösung | 10% Ketaminhydrochlorid + 5% Xylazin + 85% sterile isotonische Kochsalzlösung. | ||
| DAPI Färbelösung | Beyotime | C1005 | In der Immunfluoreszenzfärbung zur Gegenfärbung des Zellkerns anwenden. |
| Zahnärztliches Hochgeschwindigkeits-Dentalhandstück | Jing Yuan E-Commerce-Technologie | WJ-422 | Bewerben Sie sich bei der Pulpa-Exposition. |
| Schwerer Drahtschneider | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | keine | Inarc-Schneiden anwenden. |
| Hämatoxylin- und Eosin-Färbeset | Biosharp | BL700B | Für die histologische Analyse der Objektträger. |
| IL-6 Antikörper | Novus | NBP2-89149 | Bei Immunfluoreszenzfärbung anwenden, um die Entzündung der Zahnpulpa nachzuweisen. |
| Ketamin (Ketaminhydrochlorid) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100 mg / kg, IP. Bewerben Sie sich in der Nesthetisierung. |
| Medizinischer Wasserhahn | 3M | 1530 | Anwendung bei der Immobilisierung von Mäusen. |
| Kieferorthopädischer Draht | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co., Ltd. | K417 | Durchmesser von 8µ m |
| Runder Zahnfräser (0,6 mm) | Shofu global | 072208 | Zum Entfernen von Zahnschmelz und flachen Dentinschichten auftragen. |
| Junge Schlaufenbiegezange | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | keine | Anwenden im Lichtbogenbiegen. |
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