Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Schneidezahn der Maus zu einer unschätzbaren Plattform für die Erforschung der Prinzipien der Regulation adulter Stammzellen und der Zahnregeneration entwickelt ^1,2. Der Schneidezahn der Maus wächst kontinuierlich und erneuert sich während des gesamten Lebens des Tieres. Dies geschieht durch die Erhaltung sowohl epithelialer als auch mesenchymaler Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelltypen des Zahns differenzieren können ^1,2. Während aus dentalen Epithelstammzellen Ameloblasten entstehen, die die Schmelzmatrix absondern, entstehen aus dentalen mesenchymalen Stammzellen Odontoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten, die Dentin, Zement bzw. Parodontalband bilden 3,4,5,6. Diese konstante Zufuhr neuer Zellen hält die Gewebehomöostase aufrecht und ermöglicht den Ersatz alter Zellen, die durch Kauverschleiß oder Verletzungen verloren gehen ^7,8. Die Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Erhalt und die Differenzierung von dentalen Stammzellen regulieren, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Zahnregeneration, einem Bereich von wachsendem Interesse.

Anatomisch gesehen ist ein großer Teil des Schneidezahns der erwachsenen Maus vom Kieferknochen umhüllt. Während die Schneidekante des Zahns freiliegt, passt das apikale Ende des Schneidezahns in eine Alveole und ist über parodontale Bänder und Bindegewebe fest mit dem umgebenden Knochen verbunden (Abbildung 1A,B). Das apikale Ende des Schneidezahns ist auch die Wachstumsregion des Zahns und erhält Zahnstamm- und Vorläuferzellen sowohl in der Epithelschicht als auch in der mesenchymalen Pulpa 9,10,11,12,13. Insbesondere werden dentale Epithelstammzellen am knolligen Ende des Epithels gehalten, der sogenannten apikalen Knospe, die auch als labiale zervikale Schleife bezeichnet wird (Abbildung 1C). Ähnlich wie im Darmepithel und in der Epidermis wird die Epithelerneuerung im Schneidezahn in erster Linie durch aktiv zyklische Stammzellen und ihre hochproliferativen Zwischennachkommen, die sogenannten transitverstärkenden Zellen 14,15,16,17, unterstützt, die sich beide im inneren Teil der Zervixschlinge befinden. Ob das Schneideepithel während der Regeneration ruhende Stammzellen enthält und verwertet, muss jedoch noch geklärt werden. Im Gegensatz dazu wurden sowohl aktive als auch ruhende mesenchymale Stammzellen in der apikalen Pulpa identifiziert, und die ruhenden Stammzellen fungieren als Reservepopulation, die während der Verletzungsreparatur aktiviert wird^13,18.

Viele der Entdeckungen über die Biologie der Erneuerung und Regeneration der Schneidezähne von Mäusen sind das Ergebnis histologischer Untersuchungen, bei denen Proben an bestimmten zeitlichen Punkten entnommen, fixiert, verarbeitet und dann entlang einer bestimmten Ebene in mikrometerdünne Scheiben geschnitten werden. Durch die detaillierte Analyse histologischer Schnitte aus verschiedenen Mausmodellen, die eine Rückverfolgung der Abstammungslinie oder genetische Störungen ermöglichen, haben die Wissenschaftler die Zelllinien verschiedener Vorläuferpopulationen sowie die genetischen und Signalwege identifiziert, die die Homöostase der Schneidezähne und die Reparatur von Verletzungen steuern 19,20,21. Die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder von nicht-vitalen Zellen in Schnitten können jedoch nicht das gesamte Spektrum zellulärer Verhaltensweisen und räumlicher Organisationen in lebendem Gewebe erfassen, wie z. B. Zellformveränderungen, Bewegungen und zelluläre Kinetik. Das Erkennen und Messen dieser schnellen zellulären Veränderungen, die in einer Zeitskala auftreten, die durch Gewebeschnitte nicht aufgelöst werden kann, erfordert eine andere Strategie. Darüber hinaus ist die Erfassung solcher Informationen auch entscheidend, um zu verstehen, wie Zahnzellen miteinander interagieren, auf verschiedene Signalreize reagieren und sich selbst organisieren, um Gewebestrukturen und -funktionen aufrechtzuerhalten.

Das Aufkommen der vierdimensionalen (4D) Tiefengewebebildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie²², einer Technologie, die drei räumliche Dimensionen mit zeitlicher Auflösung integriert, überwindet die inhärenten Einschränkungen der histologischen Analyse, indem sie eine raumzeitliche Untersuchung von kultivierten Gewebeexplantaten, Organoiden oder sogar Geweben in situ ermöglicht 23,24,25,26 . Zum Beispiel hat die 4D-Live-Bildgebung des sich entwickelnden Zahnepithels die raumzeitlichen Muster von Zellteilungen und -migrationen enthüllt, die das Gewebewachstum, die Bildung von Signalzentren und die Morphogenese des dentalen Epithels koordinieren 27,28,29,30,31,32. Im Schneidezahn der erwachsenen Maus wurde die 4D-Bildgebung kürzlich angepasst, um das zelluläre Verhalten während der Reparatur von Zahnepithelverletzungen zu untersuchen. Live-Bildgebung zeigte, dass Stratum-Intermedium-Zellen in der suprabasalen Schicht direkt in Ameloblasten in der Basalschicht umgewandelt werden können, um das geschädigte Epithel zu regenerieren, was das traditionelle Paradigma der Reparatur von Epithelverletzungen in Frage stellt¹⁵.

Hier beschreiben wir die Dissektion, Kultivierung und Bildgebung des adulten Mausschneidezahns, wobei wir uns auf Epithelzellen in der labialen Zervixschleife konzentrieren (Abbildung 1). Diese Technik bewahrt die Vitalität der Zahnzellen für mehr als 12 Stunden und ermöglicht das Live-Tracking von fluoreszenzmarkierten Zellen mit Einzelzellauflösung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Zellbewegungen und -migrationen sowie dynamische Veränderungen der Zellform und Teilungsorientierung unter normalen Kulturbedingungen oder in Reaktionen auf genetische, physikalische und chemische Störungen.

Alle Mäuse wurden in pathogenfreien Tiereinrichtungen an der University of California Los Angeles (UCLA) oder der Hebrew University of Jerusalem (HUJI) gehalten. Alle Experimente mit Mäusen wurden gemäß den Vorschriften und Protokollen durchgeführt, die vom jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden (ARC-2019-013; UCLA) oder (MD-23-17184-3; HUJI). Ein allgemeiner Ablauf der Versuchsschritte ist in Abbildung 2A dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Instrumenten, Reagenzien und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung von Lösungen und Gelen

1. Präpariermedium: Frisches DMEM/F12 mit 0,5 % Glukose zubereiten und bei 37 °C warm halten, bis es in Schritt 2.4 benötigt wird.
   HINWEIS: Wir verwenden DMEM/F12 ohne Phenolrot, um die Autofluoreszenz während der Live-Bildgebung zu reduzieren.
2. 1x Nährmedium: Frisches Medium mit 50 % DMEM/F12, 50 % Rattenserum, 1x Glutaminersatz, 1x MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Glukose, 0,1 mg/ml L-Ascorbinsäure und 0,5 % Penicillin-Streptomycin herstellen. Halten Sie es bei 37 °C warm, bis Sie es in Schritt 5.5 benötigen. Dieses Medium wird für die Kultivierung von Schneidezahn-Explantaten während der Live-Bildgebung verwendet.
   HINWEIS: Das Rattenserum sollte von hoher Qualität sein und speziell für die Kultivierung des gesamten Gewebes durch Forscher oder aus einer kommerziellen Quelle vorbereitet werden. Insbesondere muss das Blut zentrifugiert werden (für 5 min bei 1.200 × g bei Raumtemperatur), bevor sich eine Gerinnung bildet. Nach der Zentrifugation sollte das entstandene Fibringerinnsel gequetscht und verworfen^{werden 33}.
3. Kulturgel: Das Gel dient der Immobilisierung von Proben während der Bildgebung und wird frisch zubereitet.
   1. Stellen Sie 2% Gel in DMEM/F12 her, indem Sie 200 mg Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 10 ml DMEM/F12 in einer Mikrowelle auflösen. Bewahren Sie das 2%ige Gel bei 37 °C auf.
   2. Stellen Sie 2x Nährmedium (ohne DMEM/F12) her, indem Sie 50% Rattenserum, 1x Glutaminersatz, 1x MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Glukose, 0,1 mg/ml L-Ascorbinsäure und 0,5% Penicillin-Streptomycin mischen. Das 2x Nährmedium (ohne DMEM/F12) auf 37 °C erwärmen.
   3. Stellen Sie 1 % Kulturgel her, indem Sie gleiche Mengen von 2 % Gel und 2x Nährmedium (ohne DMEM/F12) mischen. Das 1%ige Kulturgel wird bei 37 °C aufbewahrt, bis es in Schritt 5.1 benötigt wird.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen vor dem Mischen warm sind, um ein Gelieren zu vermeiden. Wir fanden heraus, dass 1%iges Gel für die Kultivierung des Schneidezahns der erwachsenen Maus geeignet ist. Der Gelprozentsatz sollte empirisch bestimmt werden, wenn andere Gewebe kultiviert werden sollen.

2. Entnahme der adulten Maus-Mandibeln

1. Euthanasieren Sie Mäuse im gewünschten Alter mit Standardverfahren, die von der IACUC genehmigt wurden.
   HINWEIS: Hier verwenden wir eine CO_{2 -}Erstickung mit anschließender Zervixluxation. Die Vorschriften für die Euthanasie von Tieren können in verschiedenen Regionen unterschiedlich sein. Forscher sollten vor der Durchführung von Experimenten die erforderliche institutionelle Genehmigung einholen und die Einhaltung der lokalen Tierpflegevorschriften sicherstellen.
2. Desinfizieren Sie die Maus mit 70%igem Ethanol.
3. Enthaupte die Maus und ziehe den linken und rechten Unterkiefer heraus.
   1. Lege die Maus auf den Bauch und schneide dann mit einer #9 einschneidigen Industrierasierklinge in den Halsbereich und trenne den Mauskopf vom Rest des Körpers.
      HINWEIS: Wenn auch Gewebe aus dem Rachen oder der Halsregion entnommen werden soll, sollte keine Enthauptung durchgeführt werden, und man kann direkt mit Schritt 2.3.2 fortfahren.
   2. Drehen Sie die Maus so, dass die Bauchseite nach oben zeigt und die Mandibeln leicht zugänglich sind.
   3. Befestigen Sie den Kopf des Tieres, indem Sie ihn sanft zwischen Daumen und Zeigefinger halten.
   4. Verwende die Rasierklinge, um einen mittleren sagittalen Schnitt zu machen, der über die Haut des Unterkiefers von der Unterlippe in Richtung Dekolleté schneidet.
      HINWEIS: Eine chirurgische Klinge #15 kann auch verwendet werden, um den Schnitt und die anschließenden Dissektionen vorzunehmen (Schritte 2.3.6-2.3.9).
   5. Während der Schnitt gemacht wird, spreizen Sie die geschnittene Haut mit Daumen und Zeigefinger, um die darunter liegenden Muskeln und den Kieferknochen freizulegen.
   6. Verwenden Sie die Rasierklinge, um die Kaumuskeln auf der bukkalen Seite des Unterkiefers zu durchtrennen, so dass die Außenseite der linken und rechten Hemimandible nun frei von Muskelansätzen ist.
   7. Durchtrennen Sie die mylohyoiden Muskeln entlang der Innenseite des Unterkiefers, um dort Muskelansätze zu entfernen.
   8. Machen Sie einen weiteren Schnitt an der Unterkiefersymphyse, die die beiden Hemimandiblen verbindet. Nach dem Durchtrennen wird der Unterkiefer in die linke und rechte Hälfte geteilt.
   9. Klemmen Sie die Rasierklinge zwischen den Unterkieferkondylus und das temporale Unterkiefergelenk und sezieren Sie vorsichtig das Hemimandible vom Rest des Kopfes.
      HINWEIS: Wir fanden es hilfreich, während des Schneidens gleichzeitig sanft am Schneidezahn zu ziehen. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Unterkiefer nicht bricht und das darin befindliche Weichgewebe nicht beschädigt wird.
4. Die präparierten Mandibeln werden sofort mit dem vorgewärmten Dissektionsmedium in eine Petrischale überführt (Schritt 1.1) und das verbleibende Muskelgewebe mit einer chirurgischen Klinge #15 entfernt.
   HINWEIS: Das Aufbewahren von Proben in kalten Medien verlangsamt die Zellaktivitäten, was zu einer verzögerten oder sogar fehlgeschlagenen Wiederherstellung bestimmter Zellaktivitäten, wie z. B. Proliferation oder Zellbewegung, während der Live-Bildgebung führt.

3. Isolierung der gesamten Mausschneidezähne

HINWEIS: Die weitere Isolierung des Schneidezahns erfolgt unter einem Hellfeld-Dissektionsmikroskop.

1. Identifizieren Sie visuell den ovalen Bereich des Unterkiefers, der die Schneidezahnpfanne bedeckt und den apikalen Teil des Schneidezahns beherbergt.
2. Positionieren Sie den Unterkiefer so, dass die innere (linguale) Oberfläche nach oben zeigt.
3. Während Sie den Unterkiefer mit einer gezackten Pinzette an Ort und Stelle halten, erzeugen Sie ein Fenster im ovalen Bereich, indem Sie den darüber liegenden Membranknochen mit einer chirurgischen Klinge #15 in einer Richtung abrasieren, die vom Kondylus zu den Backenzähnen führt. Dadurch wird das Weichgewebe des apikalen Schneidezahns auf der Innenfläche freigelegt.
4. Drehen Sie den Unterkiefer um, so dass die äußere (bukkale) Oberfläche nach oben zeigt.
5. Erzeugen Sie ein Fenster im ovalen Bereich des äußeren Unterkiefers, wie in Schritt 3.3 beschrieben, und entfernen Sie mit der Spitze des Skalpells alle verbliebenen Knochenfragmente am Rand. Achten Sie darauf, dass das apikale Ende des Zahns von beiden Seiten sichtbar ist.
   HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßigen Druck beim Rasieren der Knochen, um Schäden am darunter liegenden Weichgewebe zu vermeiden.
6. Schneiden Sie systematisch die Knochen um den Schneidezahn herum weg, um den gesamten Zahn zu isolieren.
   1. Machen Sie einen sauberen Schnitt an einer Ebene, die unmittelbar an den apikalen Schneidezahn angrenzt, um zuerst den Kondylenfortsatz zu entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht in den Schneidezahn zu schneiden.
   2. Machen Sie einen zweiten Schnitt direkt hinter dem 3. Backenzahn, aber dorsal zum Schneidezahn, ohne den Zahn zu beschädigen. Dadurch wird der Knochen entfernt, der den Coronoidfortsatz enthält.
   3. Seriell von der Spitze des Winkelfortsatzes in Richtung Schneidezahn schneiden, um den ventralen Unterkiefer schrittweise zu entfernen.
      HINWEIS: Das Zahnepithel und das zugehörige parodontale Gewebe sind oft am Knochen kleben und leicht abgerissen, wenn ein großer Teil des ventralen Knochens auf einmal durchtrennt wird. Um den Knochen vom Schneidezahnweichgewebe zu trennen, kann man das Skalpell (oder eine scharfe, nicht gezackte Pinzette) zwischen die beiden Gewebe am apikalen Ende des Schneidezahns einführen und das Instrument vorsichtig nach vorne schieben.
   4. Schneiden Sie den Alveolarknochen mit den Backenzähnen und alle verbliebenen Knochen, die noch am Schneidezahn befestigt sind, weg.
   5. Der gesamte Schneidezahn ist nun isoliert. Den vollständig präparierten Schneidezahn in eine Schale mit sauberem, warmem Seziermedium überführen (Schritt 1.1).
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6, um bei Bedarf weitere Schneidezähne zu isolieren.
   HINWEIS: Die oberen/oberen Schneidezähne der Maus enthalten auch adulte Stammzellen und können zur Untersuchung der Zahnregeneration verwendet werden³⁴. Zahnforscher konzentrieren sich in der Regel auf die unteren Schneidezähne, da sie leichter zugänglich sind und leichter präpariert werden können als die oberen Schneidezähne. Die Unterschiede zwischen den Vorläuferzellen des Unterkiefers und des oberen Schneidezahns müssen noch ermittelt werden.

4. Entfernung von parodontalem Gewebe zur Freilegung der Schneidezahn-Epithelschlinge

1. Während der gesamte Schneidezahn auf der lingualen Seite liegt und während Sie den Zahn mit einer gezackten Pinzette an Ort und Stelle halten, beginnen Sie mit einer feinen Pinzette #5 mit dem Anziehen des Parodontalgewebes, das den apikalen Schneidezahn und die Halsschlingenregion bedeckt.
2. Ziehen Sie das parodontale Gewebe vorsichtig von der apikalen Knospe ab, so dass die laterale Seite der Zervixschlinge (oder andere interessante Regionen) unter dem Endoskop sichtbar wird.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass das Zahnepithel nicht beschädigt oder vom Mesenchym abgelöst wird. Wenn der Schneidezahn Fluoreszenzsignale in der interessierenden Region aufweist und ein Fluoreszenzdissektionsmikroskop zur Verfügung steht, können Fluoreszenzsignale verwendet werden, um zwischen Gewebetypen zu unterscheiden und die Dissektion zu unterstützen. Es ist wichtig, die Abschnitte 2-4 effizient durchzuführen, damit die Proben schnell in die Nährmedien überführt und durch die Explantat-Kultivierung angemessen gepflegt werden können (siehe unten).

5. Gewebeeinbettung für die Explantatkultur

1. Geben Sie 500 μl warmes, nicht verfestigtes Kulturgel in eine Vertiefung in einer 24-Well-Platte und übertragen Sie die präparierten ganzen Schneidezähne schnell in die Vertiefung. Schwenken Sie die Platte einige Male, um die Schneidezähne zu spülen.
2. Geben Sie 400 μl warmes, nicht verfestigtes Kulturgel in eine Kulturschale und geben Sie die gespülten Schneidezähne in die Schale.
   HINWEIS: Wir verwenden eine handelsübliche Kulturschale, die mit dem Perfusionsaufbau kompatibel ist. Siehe Schritt 6.4 für alternative Optionen.
3. Richten Sie den Schneidezahn so aus, dass er die zervikale Schleifenregion (oder andere interessierende Regionen) in der Mitte der Schale positioniert (Abbildung 2A,B) und passen Sie die Neigung des apikalen Schneidezahns für die gewünschte Abbildungsebene an.
   HINWEIS: Die Gewebeorientierung sollte vor der vollständigen Gelierung schnell erfolgen.
4. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, entfernen Sie mit einer feinen Pinzette das Gel auf der gewünschten Region, damit sie nicht vom Gel bedeckt ist.
5. Fügen Sie eine ausreichende Menge warmes Nährmedium hinzu, indem Sie es langsam gegen den Rand der Schale pipettieren, um die Probe nur zu bedecken (~150 μl).
6. Bringen Sie die Explantatkultur in einen 37 °C warmen Zellkultur-Inkubator, damit sich das Gewebe 1 Stunde lang absetzen und an den Kulturzustand angepasst werden kann.

6. Zeitraffer-Mikroskopie von Schneidezahn-Explantaten

HINWEIS: In diesem Experiment haben wir ein aufrechtes Mikroskop verwendet, das mit einem 25-fachen Wassertauchobjektiv ausgestattet ist, das eine numerische Apertur von 1 hat. Im Allgemeinen eignet sich ein Wassertauchobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur am besten für die Bildgebung von tiefem Gewebe.

1. Schalten Sie das Mikroskop und den Zwei-Photonen-Laser ein.
2. Befestigen Sie die Kulturschale am Bühnenadapter und montieren Sie den Perfusionsadapterring darauf (Abbildung 2C).
3. Schließen Sie den Tischadapter an einen Temperaturregler an, der die Kultur auf 37 °C hält.
4. Verbinden Sie den Einlass und den Auslass des Adapterrings mit einer Mikroperfusionspumpe und beginnen Sie mit der Perfusion des Nährmediums, wobei die Perfusionsgeschwindigkeit an der Pumpe auf 20 eingestellt ist. Dadurch wird ein langsamer Fluss (~5 ml/h) des Nährmediums über die Proben erzeugt (Abbildung 2C).
   HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten über das System, um das Gewebe in einer stabil kontrollierten Umgebung zu halten. Es können auch andere Systeme verwendet werden. Es kann auch eine Kombination aus einer 37 °C-Heizplatte und einer selbstgebauten Perfusionskulturschale (Ergänzungsbild S1) mit einem Ein- und Auslass verwendet werden, die mit Spritzenpumpen verbunden sind.
5. Platzieren Sie einen atmosphärischen Barrierering (ACBR) auf dem Adapterring und senken Sie das Objektiv durch den ACBR ab, um gerade noch Kontakt mit dem Nährmedium herzustellen (Abbildung 2D).
6. Stellen Sie die Laserwellenlänge auf 920 nm ein, um sowohl GFP- als auch rote Fluoreszenzsignale (z. B. tdTomato) sichtbar zu machen.
7. Lokalisieren Sie Proben durch Okulare und dann über die Software des Mikroskops.
8. Richten Sie mit der Software Z-Stapel, Bildgebung mit mehreren Positionen und Zeitintervalle ein. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie eine z-Schrittweite von 4 μm und ein Zeitintervall von 5 Minuten für 14 Stunden.
   HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass ein Zeitintervall von mehr als 5 Minuten oft nicht ausreicht, um reibungslose Zellbewegungen und -teilungen zu erfassen.
9. Initiieren Sie die Zeitraffer-Aufnahme.
   HINWEIS: Die Probenposition kann sich während der ersten Stunde verschieben und weitere Anpassungen können erforderlich sein.
10. Speichern Sie Dateien für die nachgelagerte Datenverarbeitung und Analysen.

Die apikale Region des adulten Mausschneidezahns ist vom Unterkiefer umhüllt (Abbildung 1) und daher nicht direkt zugänglich, um die Vorläuferzellen, die sich in der Wachstumsregion befinden, zu visualisieren und live zu verfolgen. Daher haben wir eine Methode entwickelt, um den gesamten Schneidezahn aus dem Kieferknochen zu extrahieren und in einem Explantatkultursystem für die Zwei-Photonen-Zeitraffermikroskopie zu erhalten (Abbildung 2). Hier beschreiben wir repräsentative Ergebnisse, die den dynamischen Prozess der Zellproliferation und -bewegung in der labialen zervikalen Schleifenregion des Zahnepithels erfassen.

Um die experimentellen Verfahren zu demonstrieren, haben wir zwei verschiedene Mausmodelle verwendet, die grüne Fluoreszenz im Zahnepithel exprimieren. Die erste Mauslinie ist K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, wobei K14Cre (MGI:2680713) die Cre-Rekombinase aus einem Keratin-14-Promotor35 exprimiert und die Expression des reversen Tetracyclin-gesteuerten Transaktivators im Epithel aus dem R26rtTA-Allel 36 (MGI:3584524) aktiviert. Nach Verabreichung von Doxycyclin induziert rtTA die Histon-H2B-GFP-Expression aus dem tetO-H2B-GFP-Allel 37 (MGI:3043783) und markiert Epithelzellkerne mit grüner Fluoreszenz. Dies ist besonders nützlich für die Zellverfolgung und für die Erkennung von Zellteilungen. In diesem Experiment fütterten wir die Tiere 24 Stunden lang mit Doxycyclinfutter, bevor sie geopfert wurden, um die H2B-GFP-Expression zu aktivieren. Die zweite Mauslinie ist K14Cre; R26mT/mG, wobei R26mT/mG (MGI:3803814) ein Cre-Reporter38 ist. In Abwesenheit von Cre-Aktivität exprimieren die Zellen membranlokalisierte tdTomate (mT) mit roter Fluoreszenz. Bei Cre-vermittelter Rekombination exprimieren Zellen Membran-GFP (mG). K14Cre; R26mT/mG markiert also Epithelzellmembranen mit grüner Fluoreszenz, während Nicht-Epithelzellen rot bleiben. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung von Zellformen, -teilungen und -bewegungen.

Wir begannen den Eingriff mit der Präparation der Mandibeln (Abbildung 3A) und entfernten dann systematisch alle Knochen, die den Schneidezahn umgaben (Abbildung 3B-G). So entstanden ganze Schneidezähne mit unbeschädigtem Epithel (Abbildung 3H). Wir bestätigten die Unversehrtheit des Zahnepithels, indem wir die grüne Fluoreszenz im K14Cre untersuchten; R26rtTA; tetO-H2B-GFP und K14Cre; R26mT/mG-Mäuse (Abbildung 4A,B,E,F). In diesem Stadium bedeckt das undurchsichtige parodontale Gewebe noch den apikalen Schneidezahn, und die zervikale Schleife erscheint daher aufgrund der Lichtstreuung verschwommen, was die nachgeschaltete Zeitrafferbildgebung ebenfalls behindern würde (Abbildung 4C,G). Wir entfernten daher vorsichtig das parodontale Gewebe, so dass in jedem Schneidezahn das Zahnepithel mit der zervikalen Schleife zu erkennen war (Abbildung 4D,H).

Die Schneidezähne wurden dann in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und in einem Perfusionsaufbau für die Zwei-Photonen-Live-Bildgebung kultiviert, wie in Abbildung 2 dargestellt. Für diese Übung haben wir uns auf die zervikale Schleifenregion des Zahnepithels konzentriert und Z-Stack-Bilder in 4-μm-Intervallen alle 5 min über einen Zeitraum von 14 h aufgenommen (Abbildung 5A). Bemerkenswert ist, dass H2B-GFP-Signale hauptsächlich in der transitverstärkenden Region der zervikalen Schleife beobachtet wurden, wo es aktive Zellteilungen gibt (Abbildung 5B). Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass es nach DNA-Replikationen in diesen aktiven Zellen zu einem höheren H2B-GFP-Austausch an offenen Chromatinen und zum Einbau in Nukleosomen kommt39.

Anschließend untersuchten wir die Zeitrafferbilder mit ImageJ und konnten anhand der Trennung der H2B-GFP-Signale40 zahlreiche Zellteilungen während des gesamten Bildgebungszeitraums beobachten (Supplemental Video S1 und Supplemental Video S2). Dies deutete darauf hin, dass die Gewebe in der Explantatkultur ausreichend erhalten blieben und die Zellen aktiv waren. Insbesondere konnten wir die Kondensation und Ausrichtung der Chromosomen an der Metaphasenplatte in mitotischen Zellen beobachten, gefolgt von ihrer Segregation in zwei Tochterzellen während der Anaphase (Abbildung 5C-N, manuell mit dem ImageJ-Plugin TrackMate verfolgt). Die meisten dieser Unterteilungen waren senkrecht oder in einem schrägen Winkel relativ zur Basalmembran (Abbildung 5C-K und ergänzendes Video S1). Horizontale Teilungen parallel zur Basalmembran konnten ebenfalls nachgewiesen werden, wenn auch seltener (Abbildung 5L-N und Supplemental Video S2). Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die Zytokinese im Zahnepithel oft schnell, innerhalb von 5-10 Minuten, erfolgt. Infolgedessen können Zeitrafferintervalle von mehr als 5 Minuten einige dieser Unterteilungen übersehen.

Zellteilungsereignisse zeigten sich auch in K14Cre; R26mT/mG zervikale Schleifen, bei denen alle Epithelzellmembranen grün markiert waren (Abbildung 6A). Wir konnten mitotische Zellen anhand ihrer Zellrundung und dann der Zytokinese identifizieren (Supplemental VideoS 3), und sowohl vertikale als auch horizontale Zellteilungen waren beobachtbar (Abbildung 6B-G), was den Ergebnissen mit H2B-GFP ähnelt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass dieses Protokoll als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung des Zellverhaltens in den Schneidezahnexplantaten dienen kann, wenn es mit genetischen Modellen der Maus kombiniert wird, die unterschiedliche subzelluläre Strukturen fluoreszieren.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Mauskiefers und der Schneidezahnschlinge. (A) Ein erheblicher Teil des Schneidezahns ist in den Kieferknochen eingebettet. Die Wachstumsregion befindet sich am apikalen Ende des Zahnes und unterstützt dessen kontinuierliches Wachstum (dunkelgrüner Pfeil). (B) Eine Vergrößerung des apikalen Schneidezahns, der von parodontalem Gewebe umgeben ist. Der Zahn besteht aus Zahnschmelz und Dentin, die hochmineralisierte Strukturen sind, die von Ameloblasten bzw. Odontoblasten gebildet werden. (C) Ein sagittaler Schnitt des apikalen Schneidezahns, der zeigt, dass sich dentale Epithel-Vorläuferzellen und transitverstärkende Zellen in der labialen zervikalen Schleife befinden und Ameloblasten im distaleren Epithel entstehen lassen (dunkelgrüner gestrichelter Pfeil). Im Vergleich zur labialen Zervixschlinge ist die linguale Zervixschleife kleiner und bildet normalerweise keine Ameloblasten. Mesenchymale Stammzellen aus dem Zahn sind in der Zahnpulpa (violetter Bereich) vorhanden und führen zur Bildung von Odontoblasten. Abkürzungen: En = Emaille; De = Dentin; Am = Ameloblast; Od = Odontoblast; TACs = transit-amplifizierende Zellen; laCL = labiale Halsschlinge; liCL = linguale Halsschlinge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aufrechterhaltung des Explantats der Mausschneidezähne für die Live-Bildgebung. (A) Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte des Protokolls, von der Präparation des Schneidezahns bis zur Einbettung des Gewebes in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt für die Live-Bildgebung. Ein Perfusionsaufbau wird verwendet, um eine konstante Nährstoffversorgung während der Bildgebung zu gewährleisten, und die Kultur wird bei 37 °C gehalten. (B-D) Eine Schritt-für-Schritt-Demonstration der Einstellung der Kulturschale und der Perfusionskammer für die Live-Bildgebung. Der Medieneinlass und -auslass werden als rosa bzw. gelbe Pfeile angezeigt. Abkürzung: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Isolierung des gesamten Mausschneidezahns. (A) Intakter Kiefer. (B-H) Die Knochen wurden nach und nach entfernt, um den gesamten Schneidezahn freizulegen. Rote gestrichelte Linien in B und C zeigen das freiliegende Weichgewebe des apikalen Schneidezahns nach dem Abrasieren des Membranknochens, der über der lingualen und bukkalen Seite der Schneidezahnpfanne liegt (Schritte 3.3-3.5 im Protokoll). (D-G) Blaue Pfeilspitzen stellen die Kondylen, Backenzähne und Alveolarknochen dar, die entfernt wurden, um den gesamten Zahn zu isolieren (Schritt 3.6 im Protokoll). Maßstabsleiste = 2 mm (H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Entfernung von parodontalem Gewebe für die Live-Bildgebung. (A-H) Repräsentative Proben aus (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP und (E-H) K14Cre; In unserer Demonstration des Protokolls wurden R26mT/mG-Mäuseverwendet. Vor der Dissektion war die GFP-Expression im Zahnepithel durch den Knochen sichtbar (A,E, gelbe Pfeilspitzen). Weiße gestrichelte Linien umreißen die nicht präparierten Schneidezähne. E' zeigt die linguale Seite. In isolierten Schneidezähnen (B,C,F,G) wurde die GFP-Fluoreszenz zunächst durch das parodontale Gewebe, das die apikalen Schneidezähne bedeckte (weiße und rote Pfeilspitzen), gebeugt. Die rote Fluoreszenz in F und G markiert nicht-epitheliale Zellen. Die Entfernung von parodontalem Gewebe ermöglicht einen klaren und ungehinderten Blick auf die grün fluoreszierenden Halsschleifen (D,H, grüne Pfeilspitzen). Maßstabsleiste = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); und 300 μm (C,D,G,H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zeitraffermikroskopie des K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP zervikale Schlinge. (A) Ein Schema, das das Zeitraffer-Setup veranschaulicht. (B) eine repräsentative Z-Ebene des K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisore labiale zervikale Schleife, die eine nukleäre Markierung durch H2B-GFP vor allem in der transitamplifizierenden Region zeigt, in der sich die Zellen aktiv teilen. Das gelbe Kästchen stellt den allgemeinen Bereich der unten gezeigten vergrößerten Bilder dar. (C-K) Zeitrafferbilder, die vertikale und schräge Zellteilungen relativ zum BM zeigen. (L-N) Zeitrafferbilder zeigen ein Beispiel für die horizontale Zellteilung relativ zum BM. (D,G,J,M) Zellen in Metaphase oder Anaphase werden in den mittleren Feldern angezeigt. Die Schemata der einzelnen Gleisabschnitte sind auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsbalken in N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Abkürzung: BM = Basalmembran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Zeitraffermikroskopie des K14Cre; R26mT/mG zervikale Schlinge. (A) eine repräsentative Z-Ebene des K14Cre; R26mT/mG Schneidezahn-Labialschlinge. Alle Epithelzellen exprimieren Membran-GFP. Das gelbe Kästchen stellt den Bereich der Zellverfolgung dar, der in den Vergrößerungen angezeigt wird. (B-G) Zeitrafferbilder, die sowohl (B-D) horizontale als auch (E-G) vertikale Zellteilungen relativ zum BM erfassen. (C,F) Die mittleren Tafeln zeigen die mitotische Zellrundung. Die Schemata der einzelnen Gleisabschnitte sind auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsleiste = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Abkürzung: BM = Basalmembran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Selbsthergestellte Perfusionsschale. (A) Eine 35-mm-Kulturschale kann zur Herstellung einer Perfusionsschale verwendet werden. Eine Glasbodenschale kann verwendet werden, wenn die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop durchgeführt wird. (B) Erhitzen Sie einen Nagel mit einer Flamme. (C) Mit dem erhitzten Nagel werden auf beiden Seiten der Schale zwei Öffnungen (weiße Pfeilspitzen) erzeugt. (D) Befestigen Sie zwei 16-G-Nadeln mit stumpfem Ende, eine als Medieneinlass und die andere als Medienauslass, mit Epoxidkleber durch die Öffnungen. Wenn eine Gasperfusion gewünscht ist, kann eine dritte Öffnung/Nadel in die Schale gegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsvideo S1: Live-Bildgebung einer K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisore labiale zervikale Schleife, die vertikale und schräge Zellteilungen zeigt. Die Zellen werden manuell verfolgt, und verschiedenfarbige Punkte stellen verschiedene Paare von Mutter-Tochter-Zellen dar. Maßstabsleiste = 30 μm (linker Rahmen); 7 μm (rechter Rahmen). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: Live-Bildgebung einer K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisore labiale zervikale Schleife, die ein Beispiel für horizontale Zellteilung zeigt. Die horizontale Teilung erfolgt an der 10-s-Marke und wird manuell mit blauen Punkten verfolgt. Maßstabsleiste = 30 μm (linker Rahmen); 7 μm (rechter Rahmen). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzungsvideo S3: Live-Bildgebung einer K14Cre; R26mT/mG incisore labiale zervikale Schleife, die sowohl vertikale als auch horizontale Zellteilungen zeigt. Zellen werden manuell verfolgt, und verschiedenfarbige Kreise stellen verschiedene Paare von Mutter-Tochter-Zellen dar. Maßstabsleiste = 30 μm (linker Rahmen); 7 μm (rechter Rahmen). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.