Summary
Ex vivo live imaging är en kraftfull teknik för att studera de dynamiska processerna för cellulära rörelser och interaktioner i levande vävnader. Här presenterar vi ett protokoll som implementerar tvåfotonmikroskopi för att spåra tandepitelceller i odlade hela vuxna musframtänder.
Abstract
Den ständigt växande musframtanden håller på att växa fram som ett mycket lätthanterligt modellsystem för att undersöka regleringen av vuxna epitelceller och mesenkymala stamceller och tandregenerering. Dessa stamcellspopulationer delar sig aktivt, flyttar och differentierar för att upprätthålla vävnadshomeostas och regenerera förlorade celler på ett lyhört sätt. Traditionella analyser med fasta vävnadssnitt kunde dock inte fånga de dynamiska processerna i cellulära rörelser och interaktioner, vilket begränsade vår förmåga att studera deras regleringar. Denna artikel beskriver ett protokoll för att upprätthålla hela musframtänder i ett explantodlingssystem och levande tandepitelceller med hjälp av multifotontimelapse-mikroskopi. Denna teknik kompletterar vår befintliga verktygslåda för dentalforskning och gör det möjligt för utredare att få spatiotemporal information om cellbeteenden och organisationer i en levande vävnad. Vi förväntar oss att denna metodik kommer att hjälpa forskare att ytterligare utforska mekanismer som styr de dynamiska cellulära processer som äger rum under både tandförnyelse och regenerering.
Introduction
Under de senaste två decennierna har musframtänderna vuxit fram som en ovärderlig plattform för att undersöka principerna för reglering av vuxna stamceller och tandregenerering 1,2. Musens framtand växer kontinuerligt och förnyar sig under hela djurets liv. Det gör det genom att upprätthålla både epitel- och mesenkymala stamceller, som kan förnya sig själva och differentiera till olika celltyper i tanden 1,2. Medan dentala epitelstamceller ger upphov till ameloblaster, som utsöndrar emaljmatrisen, ger dentala mesenkymala stamceller upphov till odontoblaster, cementoblaster och fibroblaster, som bildar dentin, cement respektive parodontala ligament, 3,4,5,6. Denna konstanta tillförsel av nya celler upprätthåller vävnadshomeostas och gör det möjligt att ersätta gamla celler som går förlorade på grund av tuggslitage eller skador 7,8. Att belysa de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar underhåll och differentiering av tandstamceller är därför centralt för att förstå tandregenerering, ett område av växande intresse.
Anatomiskt sett är en stor del av framtänderna hos vuxna möss inneslutna i käkbenet. Medan tandens snittkant är exponerad, passar framtandens apikala ände i ett uttag och är ordentligt fäst vid det omgivande benet genom parodontala ligament och bindväv (Figur 1A,B). Framtandens apikala ände är också tandens tillväxtområde och upprätthåller tandstams- och stamceller i både epitelskiktet och den mesenkymala pulpan 9,10,11,12,13. Specifikt upprätthålls dentala epitelstamceller i den bulliga änden av epitelet, känd som den apikala knoppen, även kallad den labiala cervikala slingan (Figur 1C). I likhet med tarmepitelet och epidermis stöds epitelförnyelsen i framtänderna främst av aktivt cirkulerande stamceller och deras mycket proliferativa mellanliggande ättlingar, kallade transitförstärkande celler 14,15,16,17, båda belägna i den inre delen av livmoderhalsslingan. Huruvida framtändernas epitel innehåller och använder vilande stamceller under regenereringen återstår dock att fastställa. Däremot har både aktiva och vilande dentala mesenkymala stamceller identifierats i den apikala pulpan, och de vilande stamcellerna fungerar som en reservpopulation som aktiveras under skadeläkning13,18.
Många av upptäckterna om biologin bakom förnyelse och regenerering av framtänder hos möss har varit resultatet av histologiska undersökningar, där prover tas vid distinkta tidsmässiga tidpunkter, fixeras, bearbetas och sedan delas upp i mikrontunna skivor längs ett visst plan. Genom detaljerad analys av histologiska sektioner från olika musmodeller som möjliggör härstamningsspårning eller genetiska störningar har forskare identifierat cellinjerna för olika stamcellspopulationer, såväl som de genetiska och signalvägar som styr framtändernas homeostas och skadereparation 19,20,21. De statiska tvådimensionella (2D) bilderna av icke-vitala celler i snitt kan dock inte fånga hela spektrumet av cellulära beteenden och rumsliga organisationer i levande vävnad, såsom cellformförändringar, rörelser och cellulär kinetik. Att upptäcka och mäta dessa snabba cellulära förändringar, som sker på en tidsskala som inte går att lösa genom vävnadssnittning, kräver en annan strategi. Dessutom är det också viktigt att skaffa sådan information för att förstå hur tandceller interagerar med varandra, reagerar på olika signalstimuli och självorganiserar sig för att upprätthålla vävnadsstrukturer och funktioner.
Tillkomsten av fyrdimensionell (4D) djupvävnadsavbildning med hjälp av tvåfotonmikroskopi22, en teknik som integrerar tre rumsliga dimensioner med tidsupplösning, övervinner de inneboende begränsningarna för histologisk analys genom att möjliggöra spatiotemporal undersökning av odlade vävnadsexplantor, organoider eller till och med vävnader in situ 23,24,25,26 . Till exempel har 4D-liveavbildning av det utvecklande tandepitelet avslöjat de spatiotemporala mönstren för celldelningar och migrationer som samordnar vävnadstillväxt, signalcenterbildning och dentalepitelmorfogenes 27,28,29,30,31,32 . I framtänderna hos vuxna möss har 4D-avbildning nyligen anpassats för att studera cellulära beteenden under reparation av tandepitelskador. Live-avbildning avslöjade att stratumintermediumceller i det suprabasala skiktet direkt kan omvandlas till ameloblaster i basalskiktet för att regenerera det skadade epitelet, vilket utmanar det traditionella paradigmet för reparation av epitelskador15.
Här beskriver vi dissektion, odling och avbildning av framtänderna hos vuxna möss, med fokus på epitelceller i den labiala cervikala slingan (Figur 1). Denna teknik bevarar tandcellernas vitalitet i mer än 12 timmar och möjliggör livespårning av fluorescerande märkta celler med encellsupplösning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att undersöka cellrörelser och migration samt dynamiska förändringar i cellform och delningsorientering under normala odlingsförhållanden, eller som svar på genetiska, fysiska och kemiska störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss hölls i patogenfria djuranläggningar vid University of California Los Angeles (UCLA) eller Hebrew University of Jerusalem (HUJI). Alla försök på möss utfördes i enlighet med regler och protokoll som godkänts av respektive Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) eller (MD-23-17184-3; HUJI). Ett allmänt arbetsflöde för de experimentella stegen visas i figur 2A. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla instrument, reagenser och material som används i detta protokoll.
1. Beredning av lösningar och geler
- Dissektionsmedium: Bered färsk DMEM/F12 med 0,5 % glukos och håll den varm vid 37 °C tills den behövs i steg 2.4.
OBS: Vi använder DMEM/F12 utan fenolrött för att minska autofluorescens under live-avbildning. - 1x odlingsmedium: Förbered färskt medium med 50 % DMEM/F12, 50 % råttserum, 1x glutaminersättning, 1x MEM icke-essentiella aminosyror, 1 % glukos, 0,1 mg/ml L-askorbinsyra och 0,5 % penicillin-streptomycin. Håll den varm vid 37 °C tills den behövs i steg 5.5. Detta medium används för att odla framtänder, explantat under levande avbildning.
OBS: Råttserumet bör vara av hög kvalitet och speciellt framställt för odling av hel vävnad av forskare eller från en kommersiell källa. I synnerhet måste blodet centrifugeras (i 5 minuter vid 1 200 × g vid rumstemperatur) innan koagulering börjar bildas. Efter centrifugeringen ska den resulterande fibrinproppen pressas och kasseras33. - Odlingsgel: Syftet med gelen är att immobilisera prover under avbildning och bereds färskt.
- Gör 2% gel i DMEM/F12 genom att lösa upp 200 mg agaros med låg smältpunkt i 10 ml DMEM/F12 i mikrovågsugn. Förvara 2 % gel vid 37 °C.
- Gör 2x odlingsmedium (utan DMEM/F12) genom att blanda 50 % råttserum, 1 x glutaminersättning, 1 x MEM icke-essentiella aminosyror, 1 % glukos, 0,1 mg/ml L-askorbinsyra och 0,5 % penicillin-streptomycin. Värm 2x odlingsmediet (utan DMEM/F12) till 37 °C.
- Gör 1 % odlingsgel genom att blanda lika stora volymer av 2 % gel och 2x odlingsmedium (utan DMEM/F12). Förvara 1%-odlingsgelen vid 37 °C tills det behövs i steg 5.1.
OBS: Se till att alla lösningar är varma innan du blandar för att undvika gelbildning. Vi fann att 1 % gel var lämplig för att odla framtänderna hos vuxna möss. Gelprocenten bör bestämmas empiriskt om andra vävnader ska odlas.
2. Extraktion av de vuxna musunderkäkarna
- Avliva möss vid önskad ålder med hjälp av standardprocedurer som godkänts av IACUC.
OBS: Här använder vi CO2 kvävning följt av cervikal luxation. Reglerna för avlivning av djur kan variera i olika regioner. Forskare bör erhålla nödvändigt institutionellt godkännande innan experiment utförs och se till att lokala djurvårdsföreskrifter följs. - Desinficera musen med 70 % etanol.
- Halshugg musen och dra ut vänster och höger underkäke.
- Lägg musen på magen och använd sedan ett #9 eneggat industriellt rakblad för att skära i nacken och separera mushuvudet från resten av kroppen.
OBS: Om vävnader från svalget eller halsregionen också ska samlas in, bör halshuggning inte utföras, och man kan direkt gå vidare till steg 2.3.2. - Vänd på musen så att dess ventrala sida är vänd uppåt och underkäkarna är lättillgängliga.
- Säkra djurets huvud genom att hålla det försiktigt mellan tummen och pekfingret.
- Använd rakbladet för att göra ett snitt i mitten av sagittalet som skär över huden i underkäken från underläppen mot halsen.
OBS: Ett kirurgiskt blad #15 kan också användas för att göra snittet och efterföljande dissektioner (steg 2.3.6-2.3.9). - När snittet görs, sprid ut den skurna huden med tummen och pekfingret för att exponera musklerna och käkbenet under.
- Använd rakbladet för att skära av tuggmusklerna på den buckala sidan av underkäken, så att utsidan av vänster och höger hemimandibles nu är fria från muskelfästen.
- Skär av mylohyoidmusklerna längs underkäkens insida för att ta bort muskelfästen där.
- Gör ytterligare ett snitt i underkäkens symfys som förbinder de två hemimandiblerna. När underkäken är klippt kommer den att delas upp i vänster och höger halva.
- Kila in rakbladet mellan underkäkskondylen och den temporala underkäksleden och dissekera försiktigt hemimandibeln från resten av huvudet.
OBS: Vi tyckte att det var bra att samtidigt dra försiktigt i framtänderna medan vi klippte. Försiktighet bör iakttas för att undvika att underkäken går sönder och de mjuka vävnaderna i underkäken skadas.
- Lägg musen på magen och använd sedan ett #9 eneggat industriellt rakblad för att skära i nacken och separera mushuvudet från resten av kroppen.
- Överför omedelbart dissekerade underkäkar till en petriskål med det förvärmda dissektionsmediet (steg 1.1) och ta bort de återstående muskelvävnaderna med ett kirurgiskt blad #15.
OBS: Att förvara prover i kalla medier saktar ner cellaktiviteten, vilket resulterar i försenade eller till och med misslyckade återhämtningar av vissa cellaktiviteter, såsom proliferation eller cellrörelse, under levande avbildning.
3. Isolering av hela musens framtänder
OBS: Ytterligare isolering av framtänderna görs under ett ljusfältsdissektionsmikroskop.
- Identifiera visuellt det ovala området av underkäken som täcker framtänderna och rymmer den apikala delen av framtanden.
- Placera underkäken så att den inre (linguala) ytan är vänd uppåt.
- Medan du håller underkäken på plats med en tandad pincett, generera ett fönster vid det ovala området genom att raka av det överliggande membranbenet med ett kirurgiskt blad #15, i en riktning som är från kondylen mot kindtänderna. Detta exponerar den apikala framtandens mjuka vävnad på den inre ytan.
- Vänd underkäken så att den yttre (buckala) ytan är vänd uppåt.
- Skapa ett fönster vid det ovala området på den yttre underkäken enligt beskrivningen i steg 3.3 och använd skalpellens spets för att plocka bort eventuella kvarvarande benfragment vid kanten. Se till att den apikala änden av tanden är synlig från båda sidor.
OBS: Undvik överdrivet tryck när du rakar benen för att förhindra skador på den underliggande mjukvävnaden. - Skär systematiskt bort benen som omger framtänderna för att isolera hela tanden.
- Gör ett rent snitt på ett plan som ligger omedelbart intill den apikala framtänden för att först ta bort kondylprocessen.
OBS: Var försiktig så att du inte skär i framtänderna. - Gör ett andra snitt strax bakom den 3:e kindtanden, men dorsalt till framtänden utan att skada tanden. Detta tar bort benet som innehåller coronoidprocessen.
- Skär i serie från spetsen av den vinklade processen mot framtänderna för att gradvis avlägsna den ventrala underkäken på ett stegvis sätt.
OBS: Tandepitelet och tillhörande parodontala vävnader sitter ofta fast på benet och slits lätt av om en stor del av ventralbenet skärs av på en gång. För att separera benet från framtandens mjukvävnad kan man föra in skalpellen (eller en vass icke-tandad pincett) mellan de två vävnaderna i den apikala änden av framtänden och försiktigt skjuta instrumentet framåt. - Skär bort alveolarbenet med kindtänder och eventuella kvarvarande ben som fortfarande sitter fast vid framtanden.
- Hela framtanden är nu isolerad. Överför den helt dissekerade framtanden till en skål med rent, varmt dissektionsmedium (steg 1.1).
- Gör ett rent snitt på ett plan som ligger omedelbart intill den apikala framtänden för att först ta bort kondylprocessen.
- Upprepa steg 3.2-3.6 för att isolera ytterligare framtänder efter behov.
OBS: Musens överkäke/övre framtänder upprätthåller också vuxna stamceller och kan användas för att studera tandregenerering34. Tandvårdsforskare fokuserar vanligtvis på de nedre framtänderna eftersom de är mer tillgängliga och lättare kan dissekeras än de övre framtänderna. Skillnader mellan mandibulära och maxillära framtänder återstår att fastställa.
4. Avlägsnande av parodontala vävnader för att exponera framtändens epitelial cervikala slinga
- Med hela framtanden liggande på sin linguala sida och medan du håller tanden på plats med en tandad pincett, använd en par #5 fin pincett för att börja stoppa på de parodontala vävnaderna som täcker den apikala framtanden och cervikala slingan.
- Dra försiktigt av parodontalvävnaden från den apikala knoppen, så att den laterala sidan av livmoderhalsslingan (eller andra intresseområden) blir synlig under kikarsiktet.
OBS: Försiktighet bör iakttas för att undvika att skada tandepitelet eller lossa det från mesenkymet. Om framtänderna har fluorescenssignaler i det intressanta området, och ett fluorescerande dissektionsmikroskop finns tillgängligt, kan fluorescenssignaler användas för att hjälpa till att skilja mellan vävnadstyper och underlätta dissektioner. Det är viktigt att effektivt genomföra avsnitten 2–4 så att proverna snabbt kan överföras till odlingssubstratet och underhållas på lämpligt sätt genom explantodling (se nedan).
5. Inbäddning av vävnad för explantering
- Tillsätt 500 μl varm, ej stelnad odlingsgel till en brunn i en platta med 24 brunnar och överför snabbt de dissekerade hela framtänderna till brunnen. Snurra plattan några gånger för att skölja framtänderna.
- Tillsätt 400 μl varm, ej stelnad gelé i en odlingsskål och överför de sköljda framtänderna till skålen.
OBS: Vi använder en kommersiellt tillgänglig odlingsskål som är kompatibel med perfusionsinställningen. Se steg 6.4 för alternativa alternativ. - Rikta framtänderna för att placera cervikala slingområdet (eller andra områden av intresse) i mitten av skålen (Figur 2A,B) och justera lutningen på den apikala framtanden för önskat bildplan.
OBS: Vävnadsorientering bör göras snabbt före fullständig gelbildning. - När gelen har stelnat, använd en fin pincett för att ta bort eventuell gel ovanpå det intressanta området så att den inte täcks av gel.
- Tillsätt en tillräcklig volym varmt odlingsmedium genom att långsamt pipettera det mot skålens kant så att provet precis täcker provet (~150 μL).
- Flytta explantkulturen till en 37 °C cellodlingsinkubator för att låta vävnaden sedimentera och anpassa sig till odlingsförhållandena under 1 timme.
6. Timelapse-mikroskopi av framtänder, explantat
OBS: I det här experimentet använde vi ett upprätt mikroskop utrustat med ett 25x vattendoppningsobjektiv som har en numerisk bländare på 1. I allmänhet är en vattendoppningslins med stor numerisk bländare bäst lämpad för djupvävnadsavbildning.
- Slå på mikroskopet och tvåfotonlasern.
- Fäst odlingsskålen på stage adapter och montera perfusionsadapterringen ovanpå (Figur 2C).
- Anslut stage adapter till en temperaturregulator inställd för att hålla kulturen vid 37 °C.
- Anslut adapterringens inlopp och utlopp till en mikroperfusionspump och påbörja perfusionen av odlingsmediet, med perfusionshastigheten inställd på 20 på pumpen. Detta genererar ett långsamt flöde (~5 ml/h) av odlingsmediet över toppen av proverna (figur 2C).
OBS: Se materialtabellen för detaljer om systemet för att upprätthålla vävnaden i en stabilt kontrollerad miljö. Andra system kan också användas. En kombination av en 37 °C värmeplatta och en hemmagjord perfusionsodlingsskål (kompletterande figur S1) med ett inlopp och ett utlopp anslutet till sprutpumpar kan också användas. - Placera en ACBR-barriärring (Atmospheric Control Barrier Ring) ovanpå adapterringen och sänk objektivet genom ACBR för att bara komma i kontakt med odlingsmediet (Figur 2D).
- Ställ in laservåglängden till 920 nm för att visualisera både GFP- och röda fluorescenssignaler (t.ex. tdTomato).
- Lokalisera prover genom okular och sedan på mikroskopets programvara.
- Ställ in Z-stackar, multipositionsavbildning och tidsintervall med hjälp av programvaran. För att följa detta protokoll, använd en z-stegsstorlek på 4 μm och ett tidsintervall på 5 min i 14 timmar.
OBS: Vi fann att ett tidsintervall på längre än 5 minuter ofta är otillräckligt för att fånga smidiga cellrörelser och delningar. - Starta timelapse-avbildningen.
OBS: Sample position kan ändras under den första timmen och ytterligare justeringar kan krävas. - Spara filer för databearbetning och analyser nedströms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den apikala regionen av den vuxna musens framtand är innesluten i underkäken (figur 1) och är därför inte direkt tillgänglig för visualisering och live-spårning av stamcellerna som finns i tillväxtregionen. Därför har vi utvecklat en metod för att extrahera hela framtanden från käkbenet och behålla den i ett explantodlingssystem för tvåfoton-timelapse-mikroskopi (Figur 2). Här beskriver vi representativa resultat som fångar den dynamiska processen av cellproliferation och rörelse i den labiala cervikala loopregionen i tandepitelet.
För att demonstrera de experimentella procedurerna har vi använt två olika musmodeller som uttrycker grön fluorescens i tandepitelet. Den första muslinjen är K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, där K14Cre (MGI:2680713) uttrycker Cre-rekombinas från en Keratin 14-promotor35 och aktiverar uttrycket av den omvända tetracyklinstyrda transaktivatorn i epitelet från R26rtTA-allelen 36 (MGI:3584524). Vid administrering av doxycyklin inducerar rtTA histon-H2B-GFP-uttryck från tetO-H2B-GFP-allelen 37 (MGI:3043783) och märker epitelcellkärnor med grön fluorescens. Detta är särskilt användbart för cellspårning och för att upptäcka celldelningar. I det här experimentet matade vi djuren med doxycyklinfoder i 24 timmar före avlivning för att aktivera H2B-GFP-uttryck. Den andra muslinjen är K14Cre; R26mT/mG, där R26mT/mG (MGI:3803814) är en Cre-reporter38. I frånvaro av Cre-aktivitet uttrycker cellerna membranlokaliserad tdTomat (mT) med röd fluorescens. Vid Cre-medierad rekombination uttrycker cellerna membran-GFP (mG). K14Cre; R26mT/mG märker alltså epitelcellmembran med grön fluorescens, vilket gör att icke-epitelceller blir röda. Detta möjliggör enkel visualisering av cellformer, uppdelningar och rörelser.
Vi började ingreppet med att dissekera underkäkarna (Figur 3A) och tog sedan systematiskt bort alla ben som omger framtänderna (Figur 3B-G). Detta gav hela framtänder med oskadat epitel (Figur 3H). Vi bekräftade intaktheten hos tandepitelet genom att inspektera den gröna fluorescensen i K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP och K14Cre; R26mT/mG-möss (figur 4A,B,E,F). I detta skede täcker de ogenomskinliga parodontala vävnaderna fortfarande den apikala framtanden, och halsslingan ser därför suddig ut på grund av ljusspridning, vilket på liknande sätt skulle hindra nedströms timelapse-avbildning (Figur 4C,G). Vi tog därför försiktigt bort de parodontala vävnaderna, så att tandepitelet med livmoderhalsslingan kunde urskiljas i varje framtand (Figur 4D,H).
Framtänderna bäddades sedan in i agaros med låg smältpunkt och odlades i en perfusionsuppställning för tvåfotonisk live-avbildning som visas i figur 2. För den här övningen har vi fokuserat på den cervikala loopregionen i tandepitelet och tagit z-stackbilder med 4 μm intervall var 5:e minut under en varaktighet av 14 timmar (Figur 5A). Noterbart är att H2B-GFP-signaler främst observerades i den transitförstärkande regionen av cervikalslingan, där det finns aktiva celldelningar (Figur 5B). Detta beror sannolikt på att det finns ett högre utbyte av H2B-GFP vid öppna kromatiner och inkorporering i nukleosomer efter DNA-replikationer i dessa aktiva celler39.
Vi undersökte därefter timelapse-bilderna med hjälp av ImageJ och baserat på separationen av H2B-GFP-signalerna40 kunde vi observera många celldelningar under hela avbildningsperioden (Supplemental Video S1 och Supplemental Video S2). Detta tydde på att vävnaderna var tillräckligt underhållna i explanteringskulturen och att cellerna var aktiva. Specifikt kunde vi observera kondensationen och inriktningen av kromosomer vid metafasplattan i mitotiska celler, följt av deras segregering i två dotterceller under anafas (Figur 5C-N, manuellt spårad med hjälp av ImageJ-pluginet TrackMate). De flesta av dessa delningar var vinkelräta eller i en sned vinkel i förhållande till basalmembranet (Figur 5C-K och kompletterande video S1). Horisontella delningar parallellt med basalmembranet kunde också detekteras, även om de förekommer mindre ofta (Figur 5L-N och kompletterande video S2). Det är viktigt att påpeka att cytokines i tandepitelet ofta sker snabbt, inom 5-10 minuter. Som ett resultat kan timelapse-intervall på mer än 5 minuter missa några av dessa uppdelningar.
Celldelningshändelser var också uppenbara i K14Cre; R26mT/mG cervikala slingor, där alla epitelcellmembran var märkta med grönt (Figur 6A). Vi kunde identifiera mitotiska celler genom deras cellrundning och sedan cytokines (Supplemental Video S3), och både vertikala och horisontella celldelningar var observerbara (Figur 6B-G), vilket liknar de resultat som erhölls med H2B-GFP. Sammantaget visar dessa resultat att detta protokoll kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellbeteenden i framtänderna när de kombineras med musgenetiska modeller som fluorescerande märker distinkta subcellulära strukturer.
Figur 1: Scheman över muskäken och cervikal slinga i framtänderna. (A) En betydande del av framtänderna är inbäddade i käkbenet. Tillväxtområdet ligger i den apikala änden av tanden och stöder dess kontinuerliga tillväxt (mörkgrön pil). (B) En förstoring av den apikala framtanden, som är omgiven av parodontala vävnader. Tanden består av emalj och dentin, som är mycket mineraliserade strukturer som bildas av ameloblaster respektive odontoblaster. (C) Ett sagittalt snitt av den apikala framtanden, som visar att dentala epitelceller och transitförstärkande celler finns i den labiala cervikala slingan och ger upphov till ameloblaster i det mer distala epitelet (mörkgrön streckad pil). Jämfört med den labiala cervikala loopen är den linguala cervikala loopen mindre i storlek och bildar normalt inte ameloblaster. Dentala mesenkymala stamceller finns i tandpulpan (lila region) och ger upphov till odontoblaster. Förkortningar: En = emalj; De = dentin; Am = ameloblast; Od = odontoblast; TAC = transitförstärkande celler, laCL = labial cervikal slinga; liCL = lingual cervikal loop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Underhåll av framtand från möss för levande avbildning. (A) Scheman som visar de viktigaste stegen i protokollet, från dissekering av framtänderna till inbäddning av vävnaden i agaros med låg smältpunkt för levande avbildning. En perfusionsuppställning används för att ge en konstant tillförsel av näringsämnen under avbildningen och kulturen hålls vid 37 °C. (B-D) En steg-för-steg-demonstration av hur odlingskålen och perfusionskammaren ställs in för levande avbildning. Mediets inlopp och utlopp visas som rosa respektive gula pilar. Förkortning: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Isolering av hela musframtänden. (A) Intakt käke. (B-H) Benen avlägsnades gradvis för att exponera hela framtanden. Röda streckade linjer i B och C visar den exponerade mjukvävnaden i den apikala framtanden efter rakning av membranbenet som ligger över de linguala och buckala sidorna av framtandsskålen (steg 3.3-3.5 i protokollet). (D-G) Blå pilspetsar representerar de kondyler, molarer och alveolära ben som har tagits bort för att isolera hela tanden (steg 3.6 i protokollet). Skalstreck = 2 mm (H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Avlägsnande av parodontala vävnader för levande avbildning. (A-H) Representativa prover från (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, och (E-H) K14Cre; R26mT/mG-mössanvändes i vår demonstration av protokollet. Före dissektion var GFP-uttrycket i tandepitelet synligt genom benet (A,E, gula pilspetsar). Vita streckade linjer konturerar de odissekerade framtänderna. E' visar den språkliga sidan. I isolerade framtänder (B,C,F,G) diffrakterades GFP-fluorescensen initialt av de parodontala vävnaderna som täckte de apikala framtänderna (vita och röda pilspetsar). Röd fluorescens i F och G betecknar icke-epitelceller. Avlägsnande av parodontala vävnader ger en tydlig och obehindrad sikt över de gröna fluorescerande cervikala slingorna (D,H, gröna pilspetsar). Skalstreck = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); och 300 μm (C,D,G,H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Timelapse-mikroskopi av K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP cervikal slinga. (A) Ett schema som illustrerar timelapse-inställningen. B) Ett representativt z-plan för K14Cre. R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisor labial cervikal slinga, som visar nukleär märkning av H2B-GFP främst i den transit-amplifierande regionen, där celler aktivt delar sig. Den gula rutan representerar det allmänna området för de förstorade bilderna som visas nedan. (C-K) Timelapse-bilder som visar vertikala och sneda celldelningar i förhållande till BM. (L-N) Timelapse-bilder visar ett exempel på horisontell celldelning i förhållande till BM. (D,G,J,M) Celler i metafas eller anafas visas i mittpanelerna. Scheman för varje spårad division visas till höger. Skalstapel i N = 36 μm (B). 5 μm (C-N). Förkortning: BM = basalmembran. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Timelapse-mikroskopi av K14Cre; R26mT/mG cervikal slinga. A) Ett representativt z-plan för K14Cre. R26mT/mG incisor labial cervikal slinga. Alla epitelceller uttrycker membran GFP. Den gula rutan representerar området för cellspårning som visas i förstoringarna. (B-G) Timelapse-bilder som fångar både (B-D) horisontella och (E-G) vertikala celldelningar, i förhållande till BM. (C,F) Mittpanelerna visar mitotisk cellavrundning. Scheman för varje spårad division visas till höger. Skalstapel = 35 μm (A). 5 μm (B-G). Förkortning: BM = basalmembran. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Egentillverkad perfusionsform. A) En odlingsskål på 35 mm kan användas för att göra en perfusionsform. En glasbottenskål kan användas om avbildningen utförs med hjälp av ett inverterat mikroskop. (B) Värm nageln med en låga. (C) Två öppningar (vita pilspetsar) skapas på vardera sidan av skålen med hjälp av den uppvärmda spiken. D) Fäst två trubbiga 16 G-nålar, den ena som medieinlopp och den andra som medieutlopp, genom öppningarna med epoxilim. Om gasperfusion önskas kan en tredje öppning/nål läggas till skålen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S1: Live-avbildning av en K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisor labial cervikal slinga, som visar vertikala och sneda celldelningar. Celler spåras manuellt och olika färgade punkter representerar olika par av mor/dotter-celler. Skalstapel = 30 μm (vänster bildruta); 7 μm (höger bildruta). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S2: Live-avbildning av en K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisor labial cervikal slinga, som visar ett exempel på horisontell celldelning. Den horisontella uppdelningen sker vid 10 s-markeringen och spåras manuellt med hjälp av blå prickar. Skalstapel = 30 μm (vänster bildruta); 7 μm (höger bildruta). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S3: Live-avbildning av en K14Cre; R26mT/mG framtand labial cervikal slinga, som visar både vertikala och horisontella celldelningar. Celler spåras manuellt och olikfärgade cirklar representerar olika par av mor/dotter-celler. Skalstapel = 30 μm (vänster bildruta); 7 μm (höger bildruta). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levande vävnadsavbildning är en viktig teknik som gör det möjligt för oss att studera cellernas dynamiska processer och beteenden när de underhålls i sin nischmiljö41. Helst utförs live-avbildning in vivo med hög spatiotemporal upplösning. In vivo-avbildning av däggdjursorgan kan dock vara utmanande på grund av vävnadsotillgänglighet, optisk ogenomskinlighet och svårigheter att immobilisera djuret eller organet under en längre period42. Vävnadsexplantat kringgår några av dessa utmaningar och har framgångsrikt antagits i ett antal studier för att spåra cellbeteenden, såsom under tandmorfogenes och utveckling av ektodermala organ26. Här demonstrerade vi ett relativt enkelt men ändå robust protokoll för att utföra levande djupvävnadsavbildning på odlade hela vuxna musframtänder. Tillämpning av denna teknik kommer att hjälpa oss att förstå regleringen av cellrörelser, ödesbeslut och vävnadsorganisationer under tandregenerering.
Eftersom celldelningar är lätt observerbara händelser och karakteristiska för regenererande vävnader, har vi fokuserat på att spåra celler som delar sig i denna studie för att lyfta fram en användning av protokollet. Vi fann att framtändernas epitelprogenitorer kan genomgå både vertikala och horisontella delningar, vilket liknar andra epitelvävnader43. Att belysa mekanismen som reglerar delningsvinklar och undersöka vilken roll delningsorienteringar spelar för cellens ödesbeslut kommer att vara av betydelse i framtida studier. Att kombinera live-avbildning med olika musgenetiska modeller som också bär fluorescerande cellödesmarkörer, signalvägsrapportörer eller Fucci-cellcykelreportern44,45 kommer att hjälpa till att avslöja hur celldelningsmönster och cellcykeldynamik bidrar till regleringen av epitelhomeostas och regenerering.
En nödvändig praxis i detta protokoll är att utföra tanddissektion på ett snabbt och noggrant sätt, vilket möjliggör snabb övergång till och bevarande av den intakta vävnaden under lämpliga odlingsförhållanden. Vi har funnit att för levande avbildning, dissekering av vävnader i varma medier, snarare än kalla medier, som i experiment som syftar till att extrahera proteiner och mRNA46, håller cellerna i ett fungerande tillstånd. Eftersom framtänderna är ett relativt stort organ för odling är en stadig tillförsel av näringsämnen via mediaperfusion också avgörande för att upprätthålla vävnaden under hela avbildningen47. Om stamcellerna finns i det intressanta området är observation av frekventa celldelningar en bra indikator på att vävnaden är frisk och aktiv. Däremot bör celldöd vara sällsynt, och detta kan verifieras genom att detektera ljusa och kondenserade kärnkroppar under avbildning om en kärnmarkör används eller genom att utföra TUNEL-färgning efter avbildning och vävnadsfixering48. Förutom näringsämnen kan syrenivåerna också påverka explantens livskraft, eftersom antingen syrespänning eller syrebrist kan störa cellöverlevnad, proliferation och differentiering 49,50,51. Enligt vår erfarenhet har vi inte observerat uppenbara skillnader i cellproliferation och celldöd när prover tillhandahölls med eller utan extra syre (t.ex. 95 % O2/5 % CO2 karbogen eller 5 % CO2/21 % O2 / balanserad N2) under avbildning, vilket tyder på att antingen spårmängden syre i systemet är tillräcklig för att hålla framtänden i odling över natten eller att vävnaden kan använda alternativa vägar för att upprätthålla normala cellfunktioner52. Behovet av syre i andra cellulära processer eller korrekt genuttryck bör dock fastställas ytterligare i framtida studier.
I vår demonstration av protokollet har vi använt genetiskt kodad H2B-GFP och membran-GFP för att märka cellkärnor respektive konturer. Dessa fluorescerande markörer är ljusstarka och långvariga under tvåfotonmikroskopi och är därför exempel på idealiska etiketter att använda för att spåra cellrörelser och delningar. I teorin kan fluorescerande vitala färgämnen också användas för att märka olika subcellulära fack för ex vivo live imaging53, men minskad penetration av färgämnena i djupare epitelceller begränsar sannolikt deras användning. På samma sätt, medan standardkonfokalmikroskopi är kapabel till högupplöst live-avbildning på ett djup under 100 μm, ger tvåfotonmikroskopi ökat bilddjup med minskad fotoblekning och fototoxicitet54. Vi har därför valt tvåfotonmikroskopi som avbildningsmodalitet i de flesta av våra live-avbildningsapplikationer.
En potentiell begränsning med detta protokoll är att framtänderna inte helt kan rekapitulera in vivo-miljön och biologin. Data representerar därför cellernas beteende under odlingsbetingelserna och bör tolkas i enlighet med detta samt valideras med hjälp av andra metoder, t.ex. histologi, när så är tillämpligt. Vi var också tvungna att delvis ta bort parodontala vävnader för att få tillgång till livmoderhalsslingan för avbildning. Signalinteraktioner mellan parodontala vävnader och tandepitelet skulle därmed kunna störas. Slutligen, även om mediaperfusion avsevärt förbättrar livskraften hos odlade vävnader, kan det introducera vätskeskjuvspänning som fungerar som en ektopisk mekanisk signal och påverkar resultaten55,56. Vi har inte fastställt effekten av olika flödeshastigheter i vår installation. Men eftersom en låg flödeshastighet på 1-5 ml/h vanligtvis är tillräcklig för att upprätthålla näringstillförseln57, kan effekten av skjuvspänning minimeras. Med dessa begränsningar i åtanke fungerar ex vivo live-avbildning som en kraftfull plattform för att studera förändringar i cellbeteenden när lämpliga kontroller ingår i experiment.
Den kontinuerligt växande musframtanden är ett mycket lätthanterligt modellsystem för att studera stamcellsbaserad vävnadsförnyelse och skadereparation. Protokollet som beskrivs här ger utredare möjlighet att hålla hela vuxna framtänder i odling och extrahera spatiotemporal information om cellbeteenden genom timelapse-mikroskopi. Vi förväntar oss att denna teknik kommer att vara allmänt tillämplig för att studera olika musgenetiska modeller som används i odontologisk forskning och för att bidra till att öka vår kunskap inom området tandregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi tackar UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory och Leica Microsystems Center of Excellence vid California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) för att ha tillhandahållit tvåfotonmikroskopi. AS stöddes av ISF 604-21 från Israel Science Foundation. JH fick stöd av R03DE030205 och R01DE030471 från NIH/NIDCR. AS och JH fick också stöd av anslag 2021007 från USA-Israel Binational Science Foundation (BSF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
References
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
- Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
- Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
- Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
- Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
- Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
- Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
- Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
- Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
- Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
- Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
- Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
- Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
- Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
- Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
- Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
- Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
- Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
- Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).
