Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

Andrew V. Grassetti; Mira B. May; Joseph  H. Davis

doi:10.3791/66023

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Methodenartikel

Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

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DOI:

10.3791/66023

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10. November 2023

Andrew V. Grassetti^*¹ , Mira B. May^*¹ , Joseph H. Davis¹^,²

¹Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, ²Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.

Zusammenfassung

Bei der kryogenen Elektronenmikroskopie (KryoEM) werden gereinigte Makromoleküle auf ein Gitter aufgebracht, das eine löchrige Kohlenstofffolie trägt. Die Moleküle werden dann getupft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und schnell in einer etwa 20-100 nm dicken Schicht aus glasartigem Eis eingefroren, die über etwa 1 μm breite Folienlöcher schwebt. Die resultierende Probe wird mittels kryogener Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und nach der Bildverarbeitung mit geeigneter Software können nahezu atomar aufgelöste Strukturen bestimmt werden. Trotz der weit verbreiteten Akzeptanz der KryoEM bleibt die Probenvorbereitung ein schwerwiegender Engpass in den Arbeitsabläufen der KryoEM, wobei die Anwender oft auf Herausforderungen stoßen, die mit dem schlechten Verhalten von Proben im schwebenden Glaseis zusammenhängen. In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um KryoEM-Gitter mit einer einzigen kontinuierlichen Schicht aus Graphen zu modifizieren, die als Stützfläche fungiert, die oft die Partikeldichte im abgebildeten Bereich erhöht und Wechselwirkungen zwischen Partikeln und der Luft-Wasser-Grenzfläche reduzieren kann. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter und für die schnelle Bewertung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter zur Verfügung. Darüber hinaus beschreiben wir eine EM-basierte Methode, um das Vorhandensein von Graphen zu bestätigen, indem wir sein charakteristisches Beugungsmuster visualisieren. Schließlich demonstrieren wir den Nutzen dieser Graphenträger, indem wir eine Dichtekarte mit einer Auflösung von 2,7 Å eines Cas9-Komplexes unter Verwendung einer reinen Probe in relativ niedriger Konzentration schnell rekonstruieren.

Einleitung

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur Visualisierung biologischer Makromoleküle entwickelt¹. Angetrieben von Fortschritten bei der direkten Elektronendetektion ^2,3,4, der Datenerfassung⁵ und den Bildverarbeitungsalgorithmen ^6,7,8,9,10 ist die KryoEM nun in der Lage, 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung einer schnell ....