Nachweis von Multi-Gen-Einzelnukleotid-Polymorphismen bei Magenkrebs basierend auf einer Ionen-Halbleiter-Sequenzierungsplattform

Zusammenfassung

Dieses Protokoll schlägt ganzheitliche Laborverfahren vor, die zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen in Magenkrebsproben auf der Grundlage einer Ionen-Halbleiter-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Die Zielsequenzen, Ligationsadapter, Bibliotheksamplifikation und -reinigung sowie die Kriterien für die Qualitätskontrolle werden ebenfalls detailliert beschrieben.

Zusammenfassung

Magenkrebs ist ein häufiger heterogener Tumor. Die meisten Patienten haben zum Zeitpunkt der Diagnose Magenkrebs im fortgeschrittenen Stadium und benötigen oft eine Chemotherapie. Obwohl 5-Fluorouracil (5-FU) in großem Umfang zur Behandlung eingesetzt wird, müssen seine therapeutische Sensitivität und Arzneimittelverträglichkeit noch bestimmt werden, was die Bedeutung einer individualisierten Verabreichung unterstreicht. Die Pharmakogenetik kann die klinische Umsetzung einer individualisierten Behandlung leiten. Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) tragen als genetischer Marker zur Auswahl geeigneter Chemotherapien und Dosierungen bei. Einige SNPs sind mit dem Folatstoffwechsel assoziiert, dem therapeutischen Ziel von 5-FU. Die Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) rs1801131 und rs1801133, die Dihydrofolatreduktase (DHFR) rs1650697 und rs442767, die Methioninsynthase (MTR) rs1805087, die Gamma-Glutamylhydrolase (GGH) rs11545078 und die Solute Carrier Family 19 Member 1 (SLC19A1) rs1051298 wurden bei verschiedenen Krebsarten und Antifolat-Antitumormedikamenten untersucht, die eine potenzielle Vorhersage und leitende Bedeutung für Anwendung von 5-FU. Die Ionenstrom-Halbleiter-Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation kann SNPs, die mit Magenkrebs in Verbindung stehen, schnell erkennen. Jedes Mal, wenn eine Base in einer DNA-Kette verlängert wird, wird ein H⁺ freigesetzt, was zu lokalen pH-Änderungen führt. Der ionische Sensor erkennt pH-Änderungen und wandelt chemische Signale in digitale Signale um, wodurch eine Sequenzierung durch Synthese erreicht wird. Diese Technik hat einen geringen Probenbedarf, eine einfache Bedienung, niedrige Kosten und eine schnelle Sequenzierungsgeschwindigkeit, was für die Steuerung der individualisierten Chemotherapie durch SNPs von Vorteil ist.

Einleitung

Magenkrebs ist eine schwere Belastung im Bereich der globalen öffentlichen Gesundheit. Laut der Global Cancer Statistics 2020, die von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) veröffentlicht wurde, ist Magenkrebs die fünfthäufigste diagnostizierte Krebserkrankung und die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache. Weltweit ist die Inzidenz der altersstandardisierten Rate in Ostasien sowohl bei Männern als auch bei Frauen am höchsten¹. Das Auftreten von Magenkrebs ist schleichend, was dazu führt, dass Patienten im Frühstadium oft keine offensichtlichen und spezifischen Symptome haben. Von allen Magenkrebspatienten werden in Ländern ohne Routine-Vorsorgeuntersuchungen 80 % bis 90 % der Patienten entweder in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, in dem der Tumor nicht operiert werden kann, oder es kommt innerhalb von 5 Jahren nach der Operation zu einem Rückfall².

Bei fortgeschrittenem oder metastasiertem Magenkrebs ist die Chemotherapie die Hauptbehandlung, die die Überlebensrate und die Lebensqualität der Patienten verbessern kann. Für die Ersttherapie von Patienten mit metastasiertem Magenkrebs ist eine Platin-Fluoropyrimidin-Therapie die erste Wahl für ein Erstlinien-Chemotherapeutikum³. Fluoropyrimidin umfasst hauptsächlich 5-Fluorouracil (5-FU) und orale Fluoropyrimidinderivate wie Capecitabin und Tegafur. Das Hauptziel von 5-FU sind Enzyme, die mit dem Folatstoffwechsel in Verbindung stehen, die die DNA-Synthese hemmen und das Wachstum von Tumorgewebe verlangsamen. Unerwünschte Arzneimittelwirkungen schränken ihren Nutzen ein, wobei Durchfall, Mukositis, Myelosuppression und Hand-Fuß-Syndrom zu den häufigsten Nebenwirkungen gehören. Es wurde berichtet, dass das therapeutische Ansprechen und unerwünschte Arzneimittelwirkungen eng mit Faktoren im Folatstoffwechselweg zusammenhängen. Bemerkenswert ist, dass die homozygote Mutation von rs1801131 als Indikator für das Hand-Fuß-Syndrom identifiziert wurde (p = 4,1 x ^10-6, OR = 9,99, 95% CI: 3,84-27,8)⁴. Obwohl Fluoropyrimidine in großem Umfang in der Chemotherapie gegen Krebs eingesetzt werden, ist ihre Chemoresistenz ein häufiger Notfall, der zu einem therapeutischen Versagen bei der Behandlung von Magenkrebs führt. Zum Beispiel beträgt die Gesamtansprechrate nur 10%-15% bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs, die mit nur 5-FU behandelt^werden. Außerdem haben Fluoropyrimidine eine Toxizität, die nicht ignoriert werden kann. Zu den durch 5-FU induzierten Toxizitätsreaktionen gehören hauptsächlich Durchfall, Hand-Fuß-Syndrom, Stomatitis, Neutropenie, Thrombozytopenie, Neurotoxizität und sogar der Tod⁶. Eine schwere behandlungsbedingte Toxizität tritt bei 10 % bis 30 % der mit Fluoropyrimidinen behandelten Patienten auf, und eine tödliche Toxizität tritt bei 0,5 % bis 1 % dieser Patienten auf⁷.

Eine Studie zur Lebensqualität von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs ergab, dass die Ansprechrate bei Patienten, die eine 5-FU-basierte Chemotherapie erhielten, weniger als 50 % betrug⁸. Daher ist das Verständnis der Faktoren, die mit der Sensitivität einer 5-FU-basierten Chemotherapie zusammenhängen, besonders wichtig für eine präzise Behandlung, um die Ansprechrate und Wirksamkeit zu maximieren und gleichzeitig die Toxizität zu minimieren. In Anbetracht der Tatsache, dass 5-FU eng mit dem Folatstoffwechsel zusammenhängt, könnten die genetischen Varianten von Enzymen im Folatstoffwechselweg einer der Faktoren sein. Etwa 90 % der Variation der menschlichen Sequenz wird auf Einzelbasenmutationen in der DNA zurückgeführt, die als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) bekannt ^sind9. Wenn SNPs die Enzymeigenschaften des Folatstoffwechsels verändern, kann dies bei Magenkrebspatienten zu individuellen Unterschieden in der Wirksamkeit, Toxizität und Chemoresistenz gegenüber Fluorouracil führen.

Die Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) wird hauptsächlich zur Umwandlung von 5,10-Methylentetrahydrofolat (5,10-MTHF) in 5-Methyltetrahydrofolat verwendet. 5-FdUMP, ein Metabolit von 5-FU, bildet inaktive ternäre mit 5,10-MTHF und Thymidylatsynthase (TS), was die Aktivität von TS hemmt und zu einem Mangel an dTMP¹⁰ führt. Die Akkumulation von 5,10-MTHF kann die Hemmwirkung von 5-FU auf TS verstärken, die mit der Aktivität von MTHFR korreliert. MTHFR rs1801131 und rs1801133 sind die häufigsten Polymorphismen, die mit einer geringeren Enzymaktivität (eine Abnahme von 75% für rs1801133 und 30% für rs181131) und einer Akkumulation von 5,10-MTHF¹¹ zusammenhängen.

Die Dihydrofolatreduktase (DHFR) ist das Schlüsselenzym im Folatstoffwechsel und in der DNA-Synthese. DHFR reduziert Dihydrofolat unter Verwendung von NADPH zu Tetrahydrofolat (THF), das zum Transport einer Kohlenstoffeinheit verwendet wird. SNPs von DHFR können seine Expression beeinflussen, die Aktivität und Häufigkeit von THF verändern und den Folatstoffwechsel und die Empfindlichkeit von 5-FU weiter beeinflussen. Die Punktmutation DHFR rs1650697 tritt im Hauptpromotor des DHFR-Gens auf, wodurch die DHFR-Expression erhöht^{wird 12}. Eine Studie ergab, dass rs442767 mit der Wirksamkeit und Toxizität von Antifolat-Antitumormedikamenten wie Pemetrexed und Methotrexat verbunden ist. In Bezug auf den SNP rs442767 bedeutet ein GT-Genotyp die Vererbung eines G-Allels und eines T-Allels am selben Ort auf den homologen Chromosomen von jedem Elternteil. In ähnlicher Weise bezeichnen die Genotypen GG und TT die Vererbung von entweder zwei G-Allelen bzw. zwei T-Allelen. Im Vergleich zum Genotyp GT+TT ist GG mit einem verringerten ereignisfreien Überleben und einem erhöhten Risiko verbunden¹³. Dies deutet darauf hin, dass rs442767 zu einem gewissen potenziellen Einfluss auf 5-FU führen könnte.

Die Methioninsynthase (MTR) katalysiert die Remethylierung von Homocystein zu Methionin, das eine wichtige Rolle im Folatstoffwechsel spielt. MTR rs1805087 ist der häufigste Polymorphismus des MTR-Gens . MTR rs1805087 ersetzt Asparaginsäure durch Glycin an der potenziell funktionellen Stelle des Proteins, was die Aktivität von MTR verringern kann. Probanden mit dem G-Allel hatten einen erhöhten Plasma-Folat-Spiegel und einen verringerten Plasma-Homocystein-Spiegel^{von 14}. Im Gegenteil, eine Studie zeigte, dass rs1805087 keinen statistisch signifikanten Zusammenhang mit der Wirksamkeit von 5-FU hat. Aber diese Studie konzentrierte sich auf Darmkrebs und die Stichprobengröße war klein. Der Zusammenhang zwischen rs1805087 und der Wirksamkeit von 5-FU bei Magenkrebspatienten muss noch erforscht werden¹⁵.

Die Gamma-Glutamylhydrolase (GGH) ist ein lysosomales Enzym, das die intrazellulären Folatkonzentrationen reguliert. Pteroylglutaminsäure ist das Synonym für Folsäure, die sich aus Pterin, p-Aminomethylbenzoesäure und Glutaminsäure zusammensetzt. Es gibt zwei Formen von Folsäure in Organismen, Monoglutamatfolat und polyglutamiertes Folat. THF-Polyglutamat wird von GGH enzymatisch in monoglutaminisches Folat umgewandelt, wobei nacheinander entweder Monoglutamat (Mono-Glu) oder Di-Glutamat (di-Glu) freigesetzt ^wird16. Eine Studie über die GGH-Expression bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem Magenkrebs zeigte, dass eine hohe GGH-Expression 5,10-MTHF und TS reduzieren kann, was bedeutet, dass nur eine geringe Dosierung von 5-FU erforderlich ist, um die TS-hemmende Wirkung bei diesen Patienten zu erzielen¹⁷. GG ist ein prognostischer Biomarker bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem Magenkrebs, die mit einer postoperativen adjuvanten Chemotherapie mit S-1, einem Prodrug von 5-FU, behandelt werden, und spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostase von Folsäure¹⁸. GGH rs11545078 ist eine Missense-Variante und ändert Thr-127 in Ile-127. Eine Studie, die sich auf die Substratspezifität von GGH konzentriert, deutet darauf hin, dass rs11545078 im Vergleich zum Wildtyp zu einem höheren Km und einer geringeren katalytischen Effizienz für Methotrexat führt und die Struktur ähnlich wie bei Folsäure¹⁹ ist. Insgesamt ist die Erforschung des Zusammenhangs zwischen rs11545078 und den klinischen Ergebnissen von 5-FU eine vielversprechende Strategie, um die Arzneimittelresistenz zu verstehen.

Die gelöste Trägerfamilie 19 Mitglied 1 (SLC19A1), auch reduzierter Folattransporter genannt, ist ein typisches fazilitatives Transmembranprotein, das reduzierte Folate importiert, die Säugetierzellen nicht in der Lage sind, de novo zu synthetisieren, was bekanntermaßen die Reaktion des Tumors auf 5-FU²⁰ abschätzt. Es wurden jedoch nur wenige Studien zur Assoziation zwischen 5-FU und SLC19A1 Polymorphismus durchgeführt²¹. Bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die Pemetrexed, ein Folatanalogon, erhielten, trug das rs1051298 auf dem SLC19A1-Gen dazu bei, das Risiko für alle unerwünschten Arzneimittelwirkungen zu erhöhen und das Gesamtüberleben zu verringern^22,23. SLC19A1 rs1051298, eine 3'-untranslatierte Regionsvariante über den Folatstoffwechsel, könnte helfen, einige der individuellen Unterschiede bei der 5-FU-Therapie zu erklären. Hier geht es darum, den Zusammenhang zwischen rs1051298 und 5-FU-Resistenz bei Patienten mit Magenkrebs zu evaluieren.

Für den qualitativen Gennachweis in vitro wird ein auf Halbleitersequenzierung basierendes Kit verwendet (Abbildung 1), das 7 ausgewählte SNPs in 5 Genen nachweisen kann, die Mutationen rs1801131 und rs1801133 des MTHFR-Gens , die Mutationen rs1650697 und rs442767 des DHFR-Gens , die rs1805087 Mutation des MTR-Gens , die rs11545078 Mutation des GGH-Gens und rs1051298 des SLC19A1 Gen in Tumorgewebeproben von Magenkrebspatienten. Zunächst wurde die Nukleinsäure der Probe extrahiert und das Zielfragment mittels PCR spezifisch amplifiziert. An beiden Enden des DNA-Fragments wurde ein universeller Sequenzierungsadapter angebracht, um eine Bibliothek zu erstellen, die für die Sequenzierung verwendet werden kann. Anschließend wurde die Amplifikation der Sequenzierungsbibliothek durch PCR durchgeführt, um ein Sequenzierungstemplate zu bilden. Das positive Template wurde angereichert, um die Anforderungen an die Sequenzierung zu erfüllen. Verwendung des Halbleitersequenzierungssystems, indem der DNA-Strang in dem winzigen Loch des Halbleiterchips fixiert wird. Die DNA-Polymerase nimmt die einzelsträngige DNA als Matrize und synthetisiert den komplementären DNA-Strang nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung. Jedes Mal, wenn eine Base in einer DNA-Kette verlängert wird, wird ein Proton freigesetzt, was zu lokalen pH-Änderungen führt. Ein ionischer Sensor erkennt pH-Änderungen und wandelt chemische Signale in digitale Signale um, so dass Basen in Echtzeit interpretiert und schließlich die Basensequenz jedes DNA-Abschnitts erhalten werden kann. Bioinformatische Analysen wurden verwendet, um diese Sequenzen mit der Referenzkarte des menschlichen Genoms abzugleichen. Wenn Gene im Zusammenhang mit Magenkrebs mutieren, verändern sich die entsprechenden DNA-Basensequenzen, um die Mutationsinformationen verwandter Gene zu erhalten.

Das Ergebnis kann den Genmutationsstatus anzeigen und Ärzten als Referenz dienen, um geeignete Arten und Dosierungen von Chemotherapeutika auszuwählen und die Arzneimittelresistenz bei Magenkrebspatienten vorherzusagen. Die Testergebnisse dienen jedoch nur als klinische Referenz und werden nicht als einzige Grundlage für eine individualisierte Behandlung von Patienten empfohlen. Ärzte sollten ein umfassendes Urteil auf der Grundlage des Zustands des Patienten, der Arzneimittelindikationen, der Behandlungsreaktionen und anderer Labortestindikatoren fällen.

Protokoll

Alle Protokolle und die Gewebeproben von Magenkrebs (Schritt 1), die aus der Endoskopie oder Operation des oberen Gastrointestinaltrakts gewonnen wurden und in dieser Studie verwendet wurden, wurden am 24. Juli 2023 von der medizinischen Ethikkommission überprüft und genehmigt (NFEC-2023-298). Darüber hinaus ist dieses Protokoll ausschließlich dazu gedacht, den Nachweis mehrerer Gene bei Magenkrebs zu veranschaulichen, ohne sich an Kohortenvergleichen zu beteiligen, und stellt daher keine spezifischen Kriterien für den Ein- oder Ausschluss von Patienten auf. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie ab.

1. Präparation von eingebetteten Magenkrebsblöcken

1. Konfigurieren Sie das Gewebeeinbettungssystem, bestehend aus einem Paraffinreservoir und einem Spender sowie Warm- und Kaltplatten, gemäß den vorgeschriebenen Betriebsrichtlinien.
2. Entnehmen Sie das für die Einbettung vorbereitete Gewebe aus dem Dörrgerät und legen Sie es in den Aufbewahrungsschlitz des Einbettzentrums.
3. Wählen Sie die passenden Einbettungsformen basierend auf der Gewebegröße aus, gießen Sie eine ausreichende Menge geschmolzenes Paraffin, um das Gewebe zu bedecken, und positionieren Sie dann die Form auf der Warmplatte.
4. Entnehmen Sie das Gewebe aus den Kassetten und platzieren Sie die Magenschleimhaut senkrecht zur Basis der Einbettungsform, um sicherzustellen, dass die Querschnittsebene alle Gewebeschichten durchschneidet. Richten Sie das Tuch in der Form aus.
5. Setzen Sie die Kassette auf die Oberseite der Form, gefolgt von einem zweiten Einguss von Paraffin, um die Form zu füllen.
6. Legen Sie die eingebettete Form auf die Kühlplatte und brechen Sie nach der Erstarrung des Paraffins die eingebetteten Blöcke von den Formen ab.

2. Extraktion von Nukleinsäuren aus Proben

1. Verwenden Sie Nukleinsäure-Extraktions- und Aufreinigungskits, um Nukleinsäuren aus paraffineingebetteten Gewebeproben zu extrahieren.
2. Verwenden Sie einen Nukleinsäurequantifizierer, um die extrahierte Nukleinsäure zu quantifizieren. Es wird empfohlen, die Nukleinsäurekonzentration auf mehr als 2 ng/μl zu erhöhen.
   HINWEIS: Die hier verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle verfügbar.

3. Vorbereitung für die Sequenzierungsbibliothek

1. Vorbereitung vor dem Experiment
   1. Schalten Sie die UV-Lampe in der ultra-cleanen Werkbank ein und sterilisieren Sie sie 30 Minuten lang. Schalten Sie dann die UV-Lampe aus und den Lüfter ein, um 10 Minuten lang zu lüften.
   2. Nehmen Sie die Nukleinsäure aus dem -20 ± 5 °C-Kühlschrank, überprüfen und notieren Sie die Proben-ID, den Nukleinsäure-Barcode und die spezifische Etikettennummer, die der Probe zugewiesen ist. Legen Sie es zur Auflösung bei Raumtemperatur (RT) nach der Überprüfung auf das Gestell des Zentrifugenröhrchens und zentrifugieren Sie es 10 s lang mit einer festen Dosis von 2.500 x g für den Standby-Modus.
2. PCR-Amplifikation des Zielfragments
   1. Nehmen Sie die Fragment-Capture-Reaktionslösung, den Amplifikationsprimer für Magenkrebs und den Fusionsamplifikationsprimer aus dem speziell angefertigten Multi-Gen-Gelenknachweiskit für Magenkrebs und legen Sie sie zum Schmelzen auf Eis. Nach dem Schmelzen schütteln und mischen, 10 s zentrifugieren und nukleasefreies Wasser zubereiten. Detaillierte Informationen zum Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      HINWEIS: Das Kit ist noch nicht im Handel erhältlich, kontaktieren Sie authotrs für weitere Details.
   2. Bereiten Sie ein 0,2-ml-PCR-Reaktionsröhrchen vor, geben Sie nacheinander Reagenzien gemäß der ergänzenden Tabelle 1 in das Röhrchen, wirbeln Sie es und mischen Sie es 5 s lang und zentrifugieren Sie sofort 10 s lang mit festen 2.500 x g, so dass keine offensichtlichen Tropfen auf der Röhrchenwand und dem Deckel vorhanden sind. RNA-Proben sollen in cDNA reverse transkribiert und dann für den anschließenden Bibliotheksaufbau verwendet werden. cDNA-Produkte sind gemäß der Ergänzenden Tabelle 2 nacheinander in die Röhrchen zu geben.
   3. Setzen Sie jedes Reaktionsrohr auf den Thermocycler. Führen Sie für die DNA-Proben das Amplifikationsprogramm aus, wie in Tabelle 2 beschrieben. Führen Sie für cDNA-Produkte das Amplifikationsprogramm wie in Tabelle 3 beschrieben aus.
3. Aufschluss der Primersequenz
   1. Nehmen Sie das Primer-Verdauungsenzym heraus und legen Sie es zum Schmelzen auf Eis. Nehmen Sie nach der Amplifikation die obigen Reaktionsröhrchen heraus, geben Sie 2 μl Primeraufschlussenzym in jedes Röhrchen und stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 22 μl beträgt.
   2. Die Reaktionslösung im PCR-Röhrchen vortexen und mischen und sofort 10 s lang zentrifugieren, mit einem festen Wert von 2.500 x g.
   3. Setzen Sie jedes Reaktionsrohr auf den Thermocycler und führen Sie das Programm wie in Tabelle 4 beschrieben aus.
4. Ligatur des Adapters
   1. Legen Sie den Adapter, der die Reagenzien verbindet, zum Auflösen auf Eis. Bereiten Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, mischen Sie dann jede Komponente gemäß Tabelle 5 und markieren Sie sie als Adaptermischung X.
      HINWEIS: Zu den Adapterverbindungsreagenzien gehören P1-Adapter und spezifische Adapter X mit den Nummern 1 bis 48. Diese sind so konzipiert, dass sie verschiedene Proben eindeutig kennzeichnen. Wenn Sie einen bestimmten Adapter hinzufügen, öffnen Sie jeweils nur einen Schlauch, um eine Kreuzkontamination des spezifischen Adapters zu vermeiden. Die verdünnte spezifische Adaptermischung kann bei -20 ± 5 °C für den Standby-Modus gelagert werden. In Sequenzierungs-Workflows werden Proben nicht einzeln verarbeitet, sondern mehrere Proben, die jeweils mit einem bestimmten Adapter versehen sind, in einer einheitlichen Bibliothek für die Sequenzierung kombiniert. Diese Methode ermöglicht die nachträgliche Differenzierung von Proben anhand ihrer spezifischen Adaptersequenzen.
   2. Nehmen Sie das aufgeschlossene Primerprodukt (22 μl) aus dem Thermocycler. Die Reagenzien nacheinander gemäß Tabelle 6 in das Röhrchen geben, vortexen und 5 s lang mischen. Zentrifugieren Sie 10 s lang bei niedriger Geschwindigkeit mit festen 2.500 x g, so dass kein offensichtlicher Tropfen an der Wand und dem Deckel des Röhrchens entsteht.
   3. Setzen Sie das Reaktionsrohr auf den Thermocycler. Führen Sie für die DNA-Proben das Amplifikationsprogramm aus, wie in Tabelle 7 beschrieben. Führen Sie für cDNA-Produkte das Amplifikationsprogramm wie in Tabelle 8 beschrieben aus.
5. Reinigung des Ligationsprodukts und Amplifikation
   1. Nehmen Sie die magnetischen DNA-Aufreinigungskügelchen vorab aus dem 2-8 °C Kühlschrank, wirbeln Sie sie gleichmäßig und zentrifugieren Sie sie augenblicklich für 10 s, mit einem festen Wert von 2.500 x g. Äquilibrieren Sie die magnetischen Kügelchen bei RT für 30 min.
   2. Bereiten Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adsorption vor und übertragen Sie das Produkt der Ligationsreaktion in das entsprechende Röhrchen.
   3. Geben Sie 45 μl gereinigte DNA-Magnetkügelchen in jedes Röhrchen, wirbeln Sie es ein und mischen Sie es gut, zentrifugieren Sie es sofort für 10 s und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT.
   4. Legen Sie das Rohr für 3 Minuten auf ein Magnetgestell. Entsorgen Sie den Überstand und vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren.
   5. Füllen Sie 300 μl neu hergestelltes 75%iges Ethanol in das Mikrozentrifugenröhrchen um und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig 4x um 180°. Nachdem die Lösung klar ist, entsorgen Sie schnell den Überstand. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch 1x weiter.
   6. Nehmen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie kurz (10 s, mit festen 2.500 x g). Legen Sie die Röhrchen wieder in das Magnetgestell und pipettieren Sie die restliche Flüssigkeit heraus. Stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeitsreste an der Rohrwand befinden.
   7. Öffnen Sie die Kappe jedes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens und trocknen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang bei RT. Achten Sie auf den trocken-nassen Zustand der Perlen. Überprüfen Sie nach dem Trocknen der Magnetkügelchen, ob sich keine Wasserflecken auf der Oberfläche befinden. Verlängern Sie die Trocknungszeit entsprechend, wenn die Magnetkügelchen zu nass sind. Schließen Sie sofort den Deckel, wenn Risse an den Kügelchen auftreten, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, um die Bibliothek zu verstärken und zu reinigen.
6. Erweiterung und Reinigung der Bibliothek
   1. Legen Sie PCR-bezogene Reagenzien zur Auflösung im Voraus auf Eis, wirbeln Sie sie und zentrifugieren Sie sie 10 s lang. Nehmen Sie das 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell, pipettieren Sie die PCR-Regenten gemäß Tabelle 9 in das Röhrchen und schließen Sie die Kappe und den Wirbel für 5 Sekunden. Kurz zentrifugieren (10 s), um keinen offensichtlichen Flüssigkeitstropfen auf die Röhrchenwand und den Deckel zu bekommen.
   2. Übertragen Sie das obige Produkt in ein neues PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie die Probe auf einem Thermocycler. Führen Sie für die DNA-Proben das Amplifikationsprogramm aus, wie in Tabelle 10 beschrieben. Führen Sie für cDNA-Produkte das Amplifikationsprogramm wie in Tabelle 11 beschrieben aus.
   3. Bereiten Sie ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adsorption vor. Zentrifugieren Sie das PCR-Röhrchen nach der Inkubation 10 s lang. Übertragen Sie das Produkt aus dem PCR-Röhrchen in das EP-Röhrchen.
   4. Geben Sie 25 μl DNA-gereinigte magnetische Kügelchen in jedes Röhrchen. Vortexen und gut mischen, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren und 5 min bei RT inkubieren.
   5. Legen Sie die Röhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Den Überstand in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren.
   6. Geben Sie 60 μl aufgereinigte DNA-Magnetkügelchen in jedes Röhrchen. Vortexen und gut mischen, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren und 5 min bei RT inkubieren.
   7. Legen Sie die Röhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren.
   8. Füllen Sie 300 μL des neu hergestellten 75%igen Ethanols in die Röhrchen um und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig 4x um 180°. Nachdem die Lösung klar ist, pipettieren Sie schnell und entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang 1x.
   9. Nehmen Sie die 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie sie kurz (10 s). Setzen Sie die Röhrchen wieder in das Magnetgestell ein und pipettieren Sie die restliche Flüssigkeit heraus. Stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeitsreste an der Rohrwand befinden.
   10. Öffnen Sie die Verschlüsse der 1,5-ml-Röhrchen und trocknen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang bei RT. Achten Sie auf den trocken-nassen Zustand der Perlen. Nachdem die Magnetperlen getrocknet sind, gibt es keine Wasserflecken auf der Oberfläche. Verlängern Sie die Trocknungszeit entsprechend, wenn die Magnetkügelchen zu nass sind. Schließen Sie den Deckel sofort, wenn sich Risse an den Perlen bilden.
   11. 50 μl Eluent in die Röhrchen pipettieren, vortexen und gut mischen. Kurz zentrifugieren (5 s, mit festen 2.500 x g) und die Röhrchen für 5 min auf RT stellen.
   12. Legen Sie die Röhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig in ein neues Röhrchen und markieren Sie den Namen der Bibliothek.
   13. Lagern Sie die Bibliothek vorübergehend im Kühlschrank bei 2-8 °C und warten Sie auf die quantitative Bestimmung oder lagern Sie die Bibliothek zur Langzeitlagerung bei -20 ± 5 °C im Kühlschrank.

4. Quantifizierung der konstruierten Bibliothek

1. Verwenden Sie den Nukleinsäurequantifizierer, um die Bibliothek zu quantifizieren. Wenn die Bibliothekskonzentration ≥ 0,2 ng/μL beträgt, ist sie qualifiziert. Andernfalls erstellen Sie die Bibliothek neu.
2. Mischen Sie das gleiche Volumen an DNA (oder RNA) und quantifizieren Sie die Lösung. Je nach quantitativem Ergebnis verdünnen Sie die gemischte Lösung auf 100 pmol/l nach der folgenden Formel.
   
   HINWEIS: Eine Alternative besteht darin, die Bibliothek gemäß der Formel auf 100 pmol/l zu verdünnen und dann durch quantitative Fluoreszenz-PCR zu quantifizieren. Mischen Sie DNA(- oder RNA)-Bibliotheken gleichermaßen entsprechend den quantitativen Ergebnissen des PCR-Instruments.
3. Mischen Sie 100 pmol/L DNA-Bibliothek und RNA-Bibliothek im Verhältnis 4:1. Verwenden Sie die gemischte Lösung aus DNA- und RNA-Bibliothek für die Computersequenzierung.

5. Sequenzierung

1. Führen Sie die Sequenzierung durch, indem Sie sich auf das Handbuch des universellen Kits für die Sequenzierungsreaktion^{24, 25} (Halbleiter-Sequenzierungsmethode) beziehen.

6. Qualitätskontrolle der Proben

1. Positive Qualitätskontrolle der Magenkrebs-DNA: Nehmen Sie die DNA-Positivkontrolle von Magenkrebs und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Kits durch. Die Steuerung wird mit dem Kit mitgeliefert. Das Ergebnis zeigt, dass MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH- und SLC19A1-Genmutanten nachgewiesen werden können.
2. Negative Qualitätskontrolle der Magenkrebs-DNA: Nehmen Sie die DNA-Negativkontrolle von Magenkrebs und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Kits durch. Die Steuerung wird mit dem Kit mitgeliefert. Das Ergebnis zeigt, dass die Wildtypen der Gene MTHFR, DHFR, MTR, GGH und SLC19A1 nachgewiesen werden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kriterien in beiden Fällen erfüllt sind, andernfalls ist eine erneute Erkennung erforderlich.

7. Datenanalyse

1. Führen Sie das entsprechende Plug-In (die Software Variant Caller, Coverage Analysis und Ion Reporter) in der Torrent Suite-Software aus, um die Analyseergebnisse der Proben zu erhalten. Beurteilen Sie die Ergebnisse der Probenerkennung anhand der Analyseergebnisse des Plug-ins.

Ergebnisse

Die Ermittlung der Testergebnisse beruht auf dem positiven Beurteilungswert, der auch als Referenzintervall anerkannt wird. Verwenden Sie die Halbleiter-Sequenzierungsmethode, um die gesammelten klinischen Proben zu erkennen. Wenn der Mutationshäufigkeitswert der Gene MTHFR, DHFR, MTR, GGH und SLC19A1 ≥ 5% beträgt, ist das Nachweisergebnis die Mutante des entsprechenden Gens. Wenn der Wert der Mutationshäufigkeit < 5 % beträgt, ist das Nachweisergebnis der Wildtyp des entsprechenden Gens²⁶.

Anhand der folgenden Kriterien kann festgestellt werden, ob die Erkennungsergebnisse glaubwürdig sind. Erstens, wenn die durchschnittliche Abdeckung der DNA-Sequenzierungsergebnisse ≥ 500 beträgt und die kartierten Lesevorgänge der RNA-Sequenzierungsergebnisse ≥ 20000 liegen, sind die Testergebnisse glaubwürdig²⁷. Andernfalls wird empfohlen, den Test erneut durchzuführen. Zweitens beträgt die durchschnittliche Abdeckung der positiven DNA-Qualitätskontrolle von Magenkrebs ≥ 500, und das Testergebnis sollte mit den Mutationen rs1801131 und rs1801133 des MTHFR-Gens , den Mutationen rs1650697 und rs442767 des DHFR-Gens , der rs1805087-Mutation des MTR-Gens , der rs11545078-Mutation des GGH-Gens und der rs1051298-Mutation des SLC19A1 übereinstimmen Gen als positiv. Andernfalls wird empfohlen, den Test erneut durchzuführen. Drittens beträgt die durchschnittliche Abdeckung der negativen DNA-Qualitätskontrolle von Magenkrebs ≥ 500, und die Nachweisergebnisse sollten zeigen, dass es sich bei allen Stellen innerhalb des Nachweisbereichs dieses Kits um Wildtyp-Stellen handelt. Andernfalls wird empfohlen, den Test erneut durchzuführen. Schließlich liegt die Bibliothekskonzentration unter 0,2 ng/μl, was auf den Abbau von DNA oder RNA in der Probe oder auf das Versäumnis zurückzuführen sein kann, den experimentellen Prozess strikt zu befolgen oder abgelaufene Reagenzien während des Experiments zu verwenden. Die oben genannten Bedingungen können dazu führen, dass die Sequenzierungsqualität abnimmt oder fehlschlägt. Es wird empfohlen, die Bibliothek neu zu erstellen.

Mit diesem Kit werden eine Reihe von Schritten befolgt, um eine Sequenzierungsbibliothek aus klinischen Proben aufzubauen. Die Bibliothek wird dann auf einer Ionenhalbleiter-Sequenzierungsplattform sequenziert, wobei ANNOVAR für die Annotation der Ergebnisse verwendet wird. Nach der Sequenzierung wird ein Dokument verwendet, um die Mutantentypen für jede Probe zusammenzufassen. Das Fehlen eines mutierten Typs deutete darauf hin, dass die Probe diese spezifische Mutation nicht aufwies. Die ergänzendeTabelle 3 ist ein typisches Beispiel dafür. Tabelle 12 enthält grundlegende Informationen über die hier nachgewiesenen SNPs. Analyse jedes SNPs mit filterbasierter Annotation in verschiedenen Datenbanken, wie z. B. 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabelle 13) und das Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabelle 14) kann zeigen, dass unterschiedliche SNPs in verschiedenen Populationen signifikant vorhanden sind.

Abbildung 1: Flussdiagramm für das Protokoll. Flussdiagramm des Multigennachweises für Magenkrebs mit Hilfe der Halbleiter-Sequenzierungsmethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Chromosom	Ort	Intervall für das Primer-Design		Linke Grundierung	Richtige Grundierung
chr1	11854475	chr1:11854175-11854775		ACAGGATGGG GAAGTCACAG	AAACCGGAAT GGTCACAAAG
	11856377	Chr1:11856077-11856677		CTTCAGGTCA GCCTCAAAGC	TCCCTGTGGT CTCTTCATCC
Chr5	79950780	chr5:79950480-79951080		CGCCGCACAT AGTAGGTTCT	CTTCCTCCTC CAGCCCTATC
	79951495	chr5:79951195-79951795		CTTGGGTCAC CTGCACAGTA	ATTTTGAAGC ACCCAAGCTG
chr1	237048499	chr1:237048199-237048799		GTCAAAGGCC AGTCCCTTCT	CTCCCTTCAC CAACTGTGCT
Chr8	63938763	chr8:63938463-63939063		CAGTGAAGTT CAGCGGCAT	TATTTTCCTGT GTGGGGCAC
Chr21	46934825	Chr21:46934525-46935125		CCAACCTGAG ATGGCTTTTC	TCCTTGGTGC TCTTGCTTTT

Tabelle 1: Primer, die für die sieben ausgewählten SNPs in fünf Genen verwendet wurden. Dieses Blatt enthält Informationen über die Position der Primer von SNPs, die mit einer 5-FU-Resistenz bei Magenkrebs assoziiert sind.

Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
99 °C	2 Minuten	1 Zyklus
99 °C	15 Sek.	22 Zyklen
60 °C	4 Minuten
10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 2: Thermisches Zyklusprogramm für die DNA-Amplifikation. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

Schritt	Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
Enzyme aktivieren	99 °C	2 Minuten	1 Zyklus
Vergällen	99 °C	15 Sek.	30 Zyklen
Glühen und Verlängern	60 °C	4 Minuten
Erhalten	10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 3: Thermisches Zyklusprogramm für die cDNA-Amplifikation. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
50 °C	10 Minuten	1 Zyklus
55 °C	10 Minuten	1 Zyklus
60 °C	ca. 20 Minuten	1 Zyklus
10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 4: Programm des thermischen Zyklus für den Aufschluss der Primersequenz. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

Bestandteil	Volumen
P1-Adapter	1,5 μl
Spezifischer Adapter X	1,5 μl
Nukleasefreies Wasser	3 μL
Gesamtvolumen des Reaktionssystems	6 μL
X: Gibt die spezifische Adapternummer an

Tabelle 5: Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien zur Herstellung der Adaptermischung. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen.

Bestandteil	Volumen
Puffer anschließen	4 μL
Adapter Mischung X	2 μL
DNA-Ligase	2 μL
Gesamtvolumen des Reaktionssystems	30 μL

Tabelle 6: Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien zur Herstellung des aufgeschlossenen Primers. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen.

Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
22 °C	30 Minuten	1 Zyklus
72 °C	10 Minuten	1 Zyklus
10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 7: Programm des thermischen Zyklus für den Anschluss des Adapters an die DNA. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
22 °C	30 Minuten	1 Zyklus
68 °C	5 Minuten	1 Zyklus
72 °C	5 Minuten	1 Zyklus
10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 8: Programm des thermischen Zyklus für den Anschluss des Adapters an die cDNA. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

Bestandteil	Volumen
Reaktionslösung der Bibliotheksamplifikation	50 μL
Mischung aus Bibliotheks-Primer	2 μL
Gesamtvolumen des Reaktionssystems	52 μL

Tabelle 9: Reihenfolge der Zugabe von Amplifikationsreagenzien. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen.

Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
98 °C	2 Minuten	1 Zyklus
98 °C	15 Sek.	5 Zyklen
60 °C	1 min
10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 10: Programm für den thermischen Zyklus zur Amplifikation der DNA-Bibliothek. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

Temperatur	Zeit	Nein. Anzahl der Zyklen
98 °C	2 Minuten	1 Zyklus
98 °C	15 Sek.	5 Zyklen
64 °C	1 min
10 °C	Halten	1 Zyklus

Tabelle 11: Programm für den thermischen Zyklus zur Amplifikation der cDNA-Bibliothek. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.

	Nr. RS1801131	Nr.: rs1801133	Nr.: rs1650697	Nr. RS442767	Nr. RS1805087	Nr.: rs11545078	Nr.: rs1051298
Schiri	T	G	Ein	G	Ein	G	G
Alt	G	Ein	G	T	G	Ein	Ein
Func.ref GeneWithVer	Exonisch	Exonisch	UTR5 (Englisch)	stromaufwärts	Exonisch	Exonisch	UTR3 (Englisch)
Gene.ref GeneWithVer	MTHFR	MTHFR	DHFR	DHFR	MTR	GGH	SLC19A1
GeneDetail .refGeneWithVer	.	.	NG_023304.1: g.5020T>G	.	.	.	NM_001205206.1: c.*64C>T; NM_001205207.1: c.*746C>T; NM_194255.2:c. *746C>T
ExonicFunc .refGeneWithVer	nicht synonym; SNV	nicht synonym; SNV	.	.	nicht synonym; SNV	nicht synonym; SNV	.
AAChange.ref GeneWithVer	MTHFR:NM_00 1330358.1:exo n8:c.A1409C:p. Nr. E470A; MTHFR: NM_005957.4: exon8:c.A1286 Nr.: P.E429A	MTHFR:NM_00 1330358.1:exo n5:c.C788T:p. Nr. A263V; MTHFR:N M_005957.4:e xon5:c.C665T: p.A222V	.	.	MTR:NM_0012 91939.1:exon2 5:c.A2603G:p. Nr. D868G; MTR:N M_001291940. 1:exon25:c.A1 535G: p.D512G; MTR:NM_0002 54.2:exon26:c. A2756G:p.D91 9G	GGH:NM_003878 .2:exon5:c.C452T: S.T151I	Jin
ZytoBand	1p36.22	1p36.22	5Q14.1	5Q14.1	1Q43	8Q12.3	21Q22.3

Tabelle 12: Relevante Informationen zu den SNPs. Annotation der Proben mit ANNOVAR.

		MTHFR		DHFR		MTR	GGH	SLC19A1
		Nr. RS1801131	Nr.: rs1801133	Nr.: rs1650697	Nr. RS442767	Nr. RS1805087	Nr.: rs11545078	Nr.: rs1051298
1000g2015aug_all		0.249401	0.245407	0.76857	0.290136	0.218251	0.085463	0.524361
1000g2015aug_afr		0.1513	0.09	0.9349	0.0318	0.2844	0.056	0.5772
1000g2015aug_amr		0.1513	0.4741	0.755	0.3991	0.1772	0.0403	0.4323
1000g2015aug_eas		0.2192	0.2956	0.6607	0.5853	0.1052	0.0873	0.5635
1000g2015aug_eur		0.3131	0.3648	0.7555	0.3191	0.173	0.0924	0.4493
1000g2015aug_sas		0.4172	0.1186	0.6779	0.228	0.3211	0.1483	0.5552

Tabelle 13: Filterbasierte Annotation von SNPs im 1000 Genomes Project.

	MTHFR		DHFR		MTR	GGH	SLC19A1
	Nr. RS1801131	Nr.: rs1801133	Nr.: rs1650697	Nr. RS442767	Nr. RS1805087	Nr.: rs11545078	Nr.: rs1051298
ExAC_ALL	0.295	0.3037	.	.	0.2091	0.0936	.
ExAC_AFR	0.1588	0.1124	.	.	0.2666	0.0545	.
ExAC_AMR	0.1555	0.5141	.	.	0.1864	0.0361	.
ExAC_EAS	0.2148	0.3052	.	.	0.1132	0.0824	.
ExAC_FIN	0.3128	0.2227	.	.	0.1892	0.0581	.
ExAC_NFE	0.3191	0.345	.	.	0.1919	0.0969	.
ExAC_OTH	0.304	0.3062	.	.	0.2108	0.0973	.
ExAC_SAS	0.4153	0.1409	.	.	0.316	0.165	.

Tabelle 14: Filterbasierte Annotation von SNPs im Exome Aggregation Consortium.

Ergänzende Tabelle 1: Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien für die DNA-Amplifikation. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Sequenz der Zugabe von Reagenzien für die cDNA-Amplifikation. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Beispiel für Ergebnisse der klinischen Probensequenzierung. Nur Mutationen, die in den Proben vorhanden sind, werden in den Dokumenten festgehalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Klinische Experten sind sich einig, dass Patienten auch mit der gleichen Art und dem gleichen Stadium von Magenkrebs deutlich unterschiedlich auf einen identischen Behandlungsansatz ansprechen können. Jahrelange Forschung hat den Wissenschaftlern gezeigt, dass die individuellen Variationen hauptsächlich auf die Natur des Magenkrebses als heterogene, polymorphe und vielfältig differenzierte Zellpopulation zurückzuführen sind, was zu erheblichen individuellen Unterschieden im Ansprechen auf die Behandlung führt²⁸. Folglich ermöglicht die Gewinnung von Magenkrebsproben durch eine Endoskopie des oberen Gastrointestinaltrakts oder eine Operation und Blutproben, gekoppelt mit einer Hochdurchsatzsequenzierung für die genetische Analyse, eine personalisierte Magenkrebsbehandlung. Diese Strategie zielt darauf ab, die Wirksamkeit der klinischen Behandlung zu verbessern und das Risiko schwerer toxischer Nebenwirkungen zu verringern. Die Fortschritte in der Ionen-Halbleiter-Sequenzierungstechnologie haben die personalisierte Behandlung in die Praxis umgesetzt²⁹.

Hier sind einige Einschränkungen dieser Testmethode. Das hier verwendete Kit ist in erster Linie für die In-vitro-Diagnostik bestimmt, daher beschränkt es sich auf den Nachweis der Mutation von rs1801131 und rs1801133 des MTHFR-Gens , rs1650697 und rs442767 des DHFR-Gens , rs1805087 des MTR-Gens , rs11545078 des GGH-Gens und rs1051298 von SLC19A1. Mutationen in anderen Abschnitten können nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der signifikanten Heterogenität des Tumorgewebes können unterschiedliche Probenahmeorte die Nachweisergebnisse beeinflussen. Bei in Paraffin eingebetteten Gewebeproben, die länger gelagert werden, können DNA und RNA bis zu einem gewissen Grad abgebaut werden, was sich auf die Testergebnisse auswirkt. Eine unangemessene Probenentnahme, ein unangemessener Transport und eine unangemessene Verarbeitung von Proben sowie ein unsachgemäßer Versuchsbetrieb und eine unsachgemäße Versuchsumgebung können zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen. Das Nachweisergebnis kann nicht garantiert werden, wenn die Nukleinsäurekonzentration unter 2 ng/μl liegt. Die Testergebnisse des Kits dienen nur als klinische Referenz. Die Auswahl einer personalisierten Behandlung für Patienten sollte in Kombination mit ihren Symptomen/Anzeichen, ihrer Krankengeschichte, anderen Labortests und Behandlungsreaktionen in Betracht gezogen werden. Negative Ergebnisse können das Vorhandensein einer Zielgenmutation nicht vollständig ausschließen. Negative Ergebnisse können auch durch zu wenige Tumorzellen in der Probe, einen übermäßigen Abbau der Nukleinsäure oder die Konzentration des Zielgens im Amplifikationsreaktionssystem unterhalb der Nachweisgrenze verursacht werden.

Einige Leistungsindizes des verwendeten Kits sind wie beschrieben. Analytische Sensitivität: Bei DNA-Proben beträgt die minimal nachweisbare Menge der gesamten Nukleinsäure in diesem Kit 10 ng, und es kann eine Mutationsrate von 5 % nachgewiesen werden. Für RNA-Proben beträgt die minimal nachweisbare Menge der gesamten Nukleinsäure in diesem Kit 10 ng. Positive und negative Koinzidenzrate: Die positive und negative Koinzidenzrate erreicht 100%. Nachweisgrenze (LOD): Insgesamt können 14 LOD-Referenzen mit den Nummern L1-L14 verwendet werden. L1-L11 sind LOD-Referenzen von MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH - und SLC19A1 Genen, und ihre Nachweisergebnisse sollten sein, dass die Mutationstypen der entsprechenden Genstellen positiv sind und die Koinzidenzraten 100% betragen. Wiederholgenauigkeit: Es können insgesamt fünf sich wiederholende Referenzmaterialien mit den Nummern R1-R5 verwendet werden. R1 ist ein stark positives, repetitives Referenzmaterial (rs67376798 Mutation des DPYD-Gens ). R2, das diese Mutation in geringerer Anzahl enthält, ist ein schwach positives repetitives Referenzmaterial (rs67376798 Mutation des DPYD-Gens ), R3 ist ein negatives repetitives Referenzmaterial (6 Stellen der Gene DPYD, MTHFR und ABCB1 werden als Wildtyp nachgewiesen). Jede Referenzprobe muss 10 Mal getestet werden, wobei sicherzustellen ist, dass die Ergebnisse dieser wiederholten Bewertungen mit den vordefinierten Klassifizierungen übereinstimmen. Datenvolumen: Das effektive Datenvolumen von DNA- und RNA-Proben sollte über 0,05 M kontrolliert werden. Die Sequenzierungstiefe von DNA-Proben ist oberhalb von 500 zu kontrollieren, und die Mapped Reads von RNA-Proben sind über 20000 zu kontrollieren. Interferenztest: Dieses Kit wird nicht durch endogene Störstoffe (Triglyceride und Albumin) und exogene Störstoffe (Formalin und dehydrierter Alkohol) beeinflusst.

Während des Versuchs müssen einige Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Das hier verwendete Kit kann nur für In-vitro-Tests verwendet werden. Bitte lesen Sie diese Anleitung vor dem Experiment sorgfältig durch und verwenden Sie sie innerhalb der Gültigkeitsdauer. Komponenten des Kits in verschiedenen Chargen können nicht austauschbar verwendet werden. Es wird empfohlen, für dieses Kit Einweg-Verbrauchsmaterialien zu verwenden, um eine Kontamination zu vermeiden. Während der Verwendung dieses Kits wird empfohlen, einen Saugkopf mit einem Filterelement zu verwenden. Um mögliche biologische Gefahren in der Probe zu vermeiden, sollte die Probe als infektiöse Substanz betrachtet werden, um den Kontakt mit Haut und Schleimhaut zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Proben in einer Biosicherheitswerkbank zu behandeln, die den Austritt von Aerosolen verhindern kann. Reagenzgläser und Saugnäpfe, die bei der Operation verwendet werden, sollten sterilisiert werden, bevor sie verworfen werden. Der Betrieb und die Entsorgung der Proben müssen den Anforderungen der einschlägigen Gesetze und Vorschriften entsprechen: Allgemeine Richtlinien für die biologische Sicherheit mikrobieller biomedizinischer Laboratorien und Vorschriften für die Entsorgung medizinischer Abfälle des Gesundheitsministeriums^30,31. Das Versuchspersonal muss eine professionelle Ausbildung erhalten, streng nach den Anweisungen arbeiten und die Bereiche entsprechend dem Versuchsprozess strikt voneinander trennen. In jeder Phase des Versuchsbetriebs sind spezielle Instrumente und Ausrüstungen zu verwenden, und die Gegenstände in jeder Phase jedes Bereichs dürfen nicht austauschbar verwendet werden. Das Versuchspersonal muss die Bereiche entsprechend dem Versuchsablauf strikt voneinander trennen. In jeder Phase des Versuchsbetriebs sind spezielle Instrumente und Ausrüstungen zu verwenden. Ergreifen Sie bei Bedarf Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Arbeitskleidung usw. Bei der Abfallentsorgung sind die einschlägigen nationalen Vorschriften einzuhalten.

Obwohl der Schwerpunkt dieses Artikels auf den sieben SNPs innerhalb von fünf Genen liegt, die mit Magenkrebs in Verbindung stehen, ist die Sequenzierung in der praktischen Anwendung nicht nur auf diese fünf Gene beschränkt. Diese Arbeit stellt definitiv eine signifikante Korrelation zwischen den sieben SNPs und der Sensitivität gegenüber 5-FU-Chemotherapie bei Magenkrebs her.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL DNA LoBind Röhrchen	Eppendorf	30108051
50 mL Röhrchen	Greiner Bio-One	227261
Amplifikationsprimer von Magenkrebs	Thermo Fisher		Die Primer werden von Thermo Fshier entsprechend der Sequenz in Tabelle 1 synthetisiert.
Entparaffinierung	Qiagen	19093
DNA-Aufreinigung magnetische	Bechkman	A63881
Ethylalkohol	Guangzhou Chemisches Reagenz Fabrik Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermo Fisher	4480441
nukleasefreie	Wasserlebensdauer Technologies	AM9932
PCR-Röhrchen	Axygen	PCR-02D-C
PCR-Röhrchen	Axygen	PCR-02D-C
Pipettenspitzen	Hochwertige wissenschaftliche Produkte		https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini-Säulen	Thermo Fisher	A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit	Thermo Fisher	AM1975
Tisch-Minizentrifuge	SCILOGES	S1010E
Thermocycler	Life Technologies	4375786
Ultramikro-Nukleinsäure-Analysator	BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGIEENTWICKLUNG GMBH	BD-1000