Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung eines Box-Cavity-Defekts in Femurdiaphysegewebe von Ratten vor. Dieses Modell kann die Leistung von Biomaterialien unter biomechanischer Belastung bewerten und Mechanismen der Knochenregeneration im Zusammenhang mit der intramembranösen Osteogenese untersuchen.
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Methodenartikel
Erstellung eines Modells eines Box-Cavity-Defekts im kortikalen Knochen von Femora der Ratte
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Schwere Knochendefekte oder komplexe Frakturen können zu schwerwiegenden Komplikationen wie Pseudarthrose oder unzureichender Knochenheilung führen. Das Tissue Engineering, bei dem Zellen, Gerüste und Zytokine eingesetzt werden, gilt als vielversprechende Lösung für die Knochenregeneration. Daher spielen verschiedene Tiermodelle, die Knochendefekte simulieren, eine entscheidende Rolle bei der Erforschung des therapeutischen Potenzials von Tissue Engineering für die Knochenheilung. In dieser Studie haben wir ein kastenförmiges kortikales Knochendefektmodell im mittleren Oberschenkelknochen von Ratten etabliert, das als ideales Modell für die Beurteilung der Funktion von Biomaterialien bei der Förderung der Knochenheilung dienen könnte. Dieser kastenförmige kortikale Knochendefekt wurde mit einem oralen Handstück mit niedriger Geschwindigkeit gebohrt und mit einer Drehnadel geformt. Sofort wurde eine postoperative Mikro-CT-Analyse durchgeführt, um die erfolgreiche Etablierung des kortikalen Knochendefekts in der Box-Cavity zu bestätigen. Die Femure auf der operierten Seite der Ratten wurden dann zu mehreren Zeitpunkten nach der Operation entnommen (0 Tage, 2 Wochen, 4 Wochen und 6 Wochen). Der Heilungsprozess des Defektbereichs jeder Probe wurde mittels Mikro-CT, Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Masson-Trichrom-Färbung bewertet. Diese Ergebnisse zeigten ein Heilungsmuster, das mit der intramembranösen Ossifikation übereinstimmte, wobei die Heilung im Wesentlichen nach 6 Wochen abgeschlossen war. Die Kategorisierung des Heilungsprozesses dieses Tiermodells bietet eine effektive in vivo-Methode zur Untersuchung neuartiger Biomaterialien und Medikamente, die auf die intramembranöse Ossifikation während der Heilung von Knochengewebedefekten abzielen.
Einleitung
Frakturen und defekte Knochen resultieren häufig aus Traumata, Tumoren, Entzündungen und angeborenen Fehlbildungen 1,2. Obwohl das Knochengewebe bei jungen, gesunden Menschen in der Regel über robuste regenerative Fähigkeiten verfügt3, können Defekte, die eine kritische Größe überschreiten, oder Heilungshindernisse aufgrund systemischer Erkrankungen (z. B. Diabetes, Osteoporose und Infektionen) immer noch zu Komplikationen wie Knochendiskontinuität oder Heilungsstörungenführen 4. Um dieser klinischen Herausforderung zu begegnen, werden häufig Knochentransplantationen oder Biomaterialien verwendet, um stark defekten Knochen zu ersetzen oder große Knochensegmente zu rekonstruieren. Diese Behandlungen haben jedoch Einschränkungen. Obwohl beispielsweise die autologe Knochentransplantation als Goldstandard gilt, leidet sie unter einer eingeschränkten Spenderversorgung und potenziellen Komplikationen an der Spenderstelle 5,6. Allotransplantate bergen auch gewisse Risiken, wie z. B. eine immunvermittelte Abstoßung, eine mögliche Übertragung von Krankheiten und negative Auswirkungen auf die biomechanischen und biologischen Eigenschaften des Transplantats7.
In den letzten Jahren hat die Forschung, die sich auf die Heilungsmechanismen von Knochendefekten konzentriert, stark zugenommen. Die Verwendung alternativer Biomaterialien und Fortschritte im Tissue Engineering haben sich als prominente Themen im Bereich der Knochenregeneration herauskristallisiert8. Bevor diese Biomaterialien in der Humantherapie eingesetzt werden können, müssen sie in vitro und in vivo getestet werden, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu gewährleisten. Die reduzierte Komplexität von In-vitro-Umgebungen und das Fehlen von Immun- und Entzündungsreaktionen schränken jedoch die Bewertung verschiedener Biomaterialien in vitro ein. Folglich ist die Etablierung von Tiermodellen für verschiedene Arten von Knochengewebedefekten erforderlich9. Tiermodelle ermöglichen die Bewertung von Biomaterialien unter verschiedenen Belastungsbedingungen, erleichtern das Verständnis artspezifischer Knocheneigenschaften und geben Aufschluss über die Ähnlichkeit zwischen Tiermodellen und klinischen Situationen beim Menschen. Diese Vorteile sind essentiell für die Untersuchung von Knochen-Gerüst-Wechselwirkungen und die Translation von Forschungsergebnissen in die klinische Praxis 9,10.
Derzeit werden Tiermodelle für mechanische Knochendefekte häufig verwendet, um die Leistungsfähigkeit von Biomaterialien zu validieren, wobei kraniale Knochendefektmodelle und segmentale Knochendefektmodelle die am häufigsten verwendeten Methoden sind11. Segmentale Knochendefektmodelle, die häufig zur Nachahmung schwerer Schämmungen des langen Knochens oder des Schienbeins verwendet werden, die mit einer Pseudarthrose des Knochens enden, sind aufgrund ihrer einheitlichen Abmessungen und definierten anatomischen Positionen von Vorteil und vereinfachen die radiologische oder histologische Beurteilung der Knochenneubildung und Revaskularisation. Diese Modelle erfordern jedoch Metallimplantate zur Stabilisierung bilateraler Fraktursegmente und erfordern einen komplexen Heilungsprozess, der sowohl endochondrale als auch intramembranöse Ossifikation umfasst12. Auf der anderen Seite sind Modelle von Schädelknochendefekten aufgrund ihrer standardisierten Defektdurchmesser, des bequemen chirurgischen Zugangs und der unterstützenden Funktion von Dura mater und Weichgewebe zu einem primären Screening-Instrument für die Bewertung von Biomaterialien geworden13. Obwohl sie häufig zur Modellierung der intramembranösen Knochenbildung in klinisch relevanten Szenarien verwendet werden, sind sie für die Bewertung der Knochenheilung unter biomechanischen Belastungsbedingungen ungeeignet, da sie während des Heilungsprozesses nicht belastend sind14.
Um diese Einschränkungen zu beheben, etablierten wir ein Modell für kortikale Knochendefekte in der Box-Cavity im femoralen Diaphysengewebe von Ratten. Mit Hilfe von Mikrocomputertomographie (CT), dreidimensionaler (3D) Rekonstruktion und histopathologischer Färbung (Hämatoxylin und Eosin [HE] und Masson) analysierten wir den Heilungsprozess dieses Modells unter Blutstillungsbedingungen. Unser Ziel ist es, neue Erkenntnisse für die Bewertung der Leistungsfähigkeit von Biomaterialien unter biomechanischen Belastungsbedingungen und für die Untersuchung des Bioengineerings und des Mechanismus der Knochenregeneration im Vergleich zur intramembranösen Ossifikation zu liefern.
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Protokoll
Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan überprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2021-597). Für die vorliegende Studie wurden Sprague-Dawley-Ratten (männlich, Körpergewicht 300 g) verwendet.
1. Präoperative Vorbereitung
- Vorbereitung des Instruments
- In Abbildung 1A finden Sie die in dieser Studie verwendeten chirurgischen Instrumente: Elektrorasierer, Gewebeschere, Augenschere, Augenzange, Einwegskalpell, Periostseparator, orales Handstück mit niedriger Geschwindigkeit, orale Sonde, Einweg-Spülvakuum, Nadelhalter, Naht 3.0.
- Bereiten Sie eine orale Sonde vor und markieren Sie das große gebogene Ende der Sonde mit einem Markierungsstift entsprechend dem Durchmesser des Defekts (Abbildung 1B). Verwenden Sie dies, um die Größe des Defekts während der Operation zu bestimmen.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Materialien und Instrumente, die zur Durchführung des Eingriffs verwendet werden, vor dem Gebrauch. Verpacken Sie die gewünschten Materialien in gefaltetes Tuch oder Geschenkpapier und verschließen Sie diese mit Autoklavenband für die Dampfsterilisation (125-135°C für 20-25 min).
- Vorbereitung des Operationsbereichs: Desinfizieren Sie den Operationstisch und die Umgebung des Tisches durch Besprühen mit 75%igem Alkohol. Schaffen Sie einen ca. 60 cm x 90 cm großen sterilen Bereich mit autoklavierten Abdecktüchern auf dem OP-Tisch.
- Vorbereitung auf die Anästhesie
- Betäuben Sie die Ratten intraperitoneal mit 10% Ketaminhydrochlorid (50-100 mg/kg) und 2% Xylazin 2 mg/kg). Verwenden Sie die subkutane Injektion von Carprofen (5 mg/kg) zur präoperativen und intraoperativen Analgesie. Untersuchen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Zehenkneiftest. Tragen Sie nach der Anästhesie eine sterile Augensalbe auf die Augen auf, um trockene Augen und Hornhautverletzungen zu vermeiden.
2. Chirurgischer Eingriff
- Bringen Sie die Ratte in eine seitliche Liegeposition auf den sterilen Operationstisch und entfernen Sie die Haare der unteren Gliedmaßen mit einem Elektrorasierer.
- Verwenden Sie 5% ige Jodophorlösung und 75% Alkohol, um das Hautgewebe im Operationsbereich zu desinfizieren.
- Lokalisieren Sie den proximalen und distalen Femur und machen Sie einen 2,5 cm langen Schnitt entlang der Längsachse des Femurs, um das Hautgewebe der Ratte zu durchschneiden.
- Trennen Sie die Hautschicht mit einer Augenzange und einer Gewebeschere von der Faszie und legen Sie den lateralen Zugang zum Oberschenkelknochen durch den Bizeps und die seitlichen Oberschenkelmuskulatur frei.
- Lokalisieren Sie den Schnittpunkt der beiden Muskelsepten (eine weiße Gewebelinie) und trennen Sie ihn vorsichtig mit einer chirurgischen Einwegklinge entlang der Muskelgrenze, bis die Femurfläche erreicht ist.
HINWEIS: Wenn Sie eine Einwegklinge verwenden, um den Muskel zu trennen, ist es wichtig, entlang des Muskelseptums zu trennen und darauf zu achten, dass es zu Gefäßverletzungen im Weichgewebe kommt. Anfänger und diejenigen, die mit der Anatomie nicht vertraut sind, müssen eine Augenzange und Periostseparatoren in einer stumpfen Dissektion zwischen den beiden Muskelmassen verwenden.
- Wenden Sie einen Periostseparator an, um die Oberschenkeloberflächenmuskulatur stumpf zu trennen und die Mitte der Femurdiaphyse freizulegen.
- Verwenden Sie einen sterilen Markierungsstift, um den Bereich der Defektstelle auf der Mittelfläche der Femurdiaphyse zu markieren, die sich am oberen Rand des lateralen 1/3 schrägen Kamms des Femurkopfes befindet.
- Bohren Sie mit dem oralen Low-Speed-Handstück mit einem Zeitlupen-Kugelbohrer mit einem Durchmesser von 1,2 mm ein kleines Loch senkrecht zur Knochenoberfläche an der markierten Stelle, wodurch das Periost und die Knochenrinde mit einer Tiefe zerstört werden, die tief genug ist, um die Knochenmarkhöhle zu erreichen. Erweitern Sie bei dieser Bohrtiefe die Größe des Lochs parallel zu dieser Tiefe in alle Richtungen und trimmen Sie, um eine Kastenhohlraumform zu erhalten.
- Verwenden Sie eine beschriftete orale Sonde parallel zum Rand des Defekts, um den Defektdurchmesser und die Morphologie während und nach der Präparation zu bestimmen.
- Verschließen Sie die Muskel- bzw. Hautschichten mit 3-0 monofilen resorbierbaren Nähten und desinfizieren Sie das Operationsgebiet mit 5% Jodophor von innen nach außen.
3. Nachsorge
- Nach der Operation ist Carprofen (5 mg/kg) subkutan zu verabreichen und die Ratte auf ein Heizkissen mit konstanter Temperatur zu legen, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Wenn die Ratte wieder zu sich kommt, bringen Sie sie vorsichtig in einen Käfig mit trockener, autoklavierter Einstreu.
- Setzen Sie die Analgesie für 24 Stunden und die postoperative Überwachung für 1 Woche nach der Operation fort.
4. Probenentnahme und -analyse
- Die Ratte nach der Operation durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium 100-200 mg/kg einschläfern. Trennen Sie vorsichtig das Muskel- und Fasziengewebe an der Oberfläche des Oberschenkelknochens und entfernen Sie den Oberschenkelknochen auf der operierten Seite vollständig. Entnehmen Sie die Proben 0 Tage (Abbildung 2A, B), 2 Wochen, 4 Wochen und 6 Wochen postoperativ.
- Fixieren Sie die Femurproben für 24 h in 4% Paraformaldehyd. Analysieren Sie die Struktur der Oberschenkelknochen mit Hilfe der Mikro-Computertomographie. Stellen Sie die Scanparameter wie folgt ein: Röntgenröhrenpotential, 70 kVp; Filter, AL 0,5 mm; Röntgenintensität, 0,2 mA; Voxelgröße, 17 μm; und Integrationszeit von 1 × 300 ms. Rekonstruieren Sie 3D-Modellbilder mithilfe von Bitmap-Daten.
- Entkalken Sie die Proben 8 Wochen lang in 10 % EDTA, bevor Sie die Femurproben in einer abgestuften Reihe von Ethanolverdünnungen dehydrieren. Dann betten Sie die Proben in Paraffinwachs15 ein.
- Schneiden Sie die eingebetteten Proben in 5 μm Paraffinabschnitte aus der Sagittalebene.
- Färbeschnitte sowohl mit einem Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbekit als auch mit einem Masson-Färbekit. Beobachten Sie die histopathologische Heilung des Defektbereichs.
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Ergebnisse
In diesem Protokoll ist es uns gelungen, durch Bohren ein Modell eines Femurbox-Hohlraumdefekts der Ratte mit Abmessungen von 4,5 mm x 1,5 mm zu etablieren. Um den Heilungsprozess zu analysieren, sammelten wir das Femurgewebe auf der operierten Seite 0 Tage, 2 Wochen, 4 Wochen und 6 Wochen nach der Operation, was die Schlüsselzeitpunkte der endochondralen Ossifikation, der intramembranösen Ossifikation und des Knochenumbaus während des Heilungsprozesses des Femurtraumas bei Ratten
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Diskussion
Präklinische Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung, um die Knochenheilung und den Einfluss von Biomaterialien auf die Knochenregeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll veranschaulicht ein Modell eines femoralen Box-Cavity-Defekts, das den intramembranösen Knochenbildungsprozess im Zusammenhang mit der klinischen Knochenregeneration repliziert. Der Defektbereich wurde intraoperativ mit einer vormarkierten oralen Sonde standardisiert. Die Ergebnisse der Mikro-CT und der histopathologischen Färbung zeigten eine f...
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Offenlegungen
Alle Originaldaten und Bilder sind in diesem Artikel enthalten. Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) und 82100982 (F. L.) finanziert und vom Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,2 mm Kugelbohrer mit langsamer Geschwindigkeit | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | Zur Vorbereitung von Defekten der Kastenkavität |
| 3.0 Naht | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Keine | Zum Nähen von Wunden |
| 4% Paraformaldehyd | Biosharp | BL539A | Zum Fixieren der Femurproben |
| Wattebällchen | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | Für die Hautsterilisation und Reinigung von |
| Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | Zur Hautdesinfektion | |
| Zahntechniker-Schleifmaschine | Marathon | N3-140232 | Zur Vorbereitung von Defekten der Kastenkavität |
| Einweg-Skalpell | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | Zur Erstellung von Hautschnitten sowie zur scharfen Trennung von Muskelgewebe |
| Elektrorasierer | JASE | BM320210 | Entfernung von Haargewebe aus dem Operationsbereich |
| Hämatoxylin- und Eosin-Fleckenset | Biosharp | C1005 | Für die histologische Analyse der Proben |
| Masson' s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | Für die histologische Analyse der Proben |
| Micro CT | Scanco medical ag | µ CT 45 | Zur Analyse der Heilung von Defekten in Femurproben |
| Nadelhalter | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Keine | Für Nahtnadeln |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | Zur Analyse der Ergebnisse der HE-Färbung und der Masson-Färbung |
| Ophthalmische Zange | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Keine | Zum Einklemmen von Haut, Muskelgewebe |
| Ophthalmic Schere | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Keine Für | die Bildung eines Hautschnittansatzes |
| Orales Handstück mit niedriger Geschwindigkeit | Marathon | Y221101003 | Zur Vorbereitung von Defekten der Kastenkavität |
| Orale Sonde | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | Zur Messung des Durchmessers von Defekten |
| Periostabscheider | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Keine Zur | stumpfen Trennung von Muskelgewebe |
| Sprague– Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | Keine | Für die Feststellung des Oberschenkelknochens kastenförmiger Kavitärdefekt |
| Gewebeschere | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Keine | Für die Bildung eines Hautschnittansatzes |
Referenzen
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