Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System

Summary

Da CRISPR-bezogene Protokolle immer nützlicher und zugänglicher werden, können unter bestimmten experimentellen Bedingungen immer noch Komplikationen und Hindernisse auftreten. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-Zelllinie unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und hebt mögliche Herausforderungen hervor, die während dieses Prozesses auftreten.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ausschaltung des RIP1-Gens mittels CRISPR/Cas9 in der humanen Monozyten-Zelllinie U937. Die Methode verwendet designierte Guide-RNA-Plasmide und lentivirale Verpackungsplasmide, um einen RIP1-Gen-Knockout zu erreichen. Das Protokoll befasst sich mit Herausforderungen und Verbesserungen traditioneller CRISPR-Methoden und ermöglicht deren Replikation für zukünftige Zelltodstudien. Die so entstandenen mutierten Zellen können verwendet werden, um mechanistische Veränderungen des Zelltods zu untersuchen, bei denen sonst funktionelle RIP1-Proteine eine Rolle spielen würden. Viabilitätsassays zeigten eine signifikante Verringerung des Zelltods in Knockout-Zellen nach Nekroptose-Induktion. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte unter gleichen Bedingungen eine deutliche Abnahme der mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Knockout-Zellen. Zusammen bestätigen diese funktionellen Assays den Verlust des RIP1-Proteins. Dieses Verfahren ist für die Verwendung mit humanen U937-Monozyten optimiert und kann auch so angepasst werden, dass es auf andere wichtige Zelltodregulatoren abzielt, wodurch funktionelle, nicht-letale Mutanten entstehen. Potenzielle Fallstricke werden durchgehend angesprochen, um Einblicke in die Herausforderungen zu geben, die bei der Mutantengenerierung auftreten können.

Introduction

Der Einsatz der CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Technologie hat sich seit ihrer Entdeckung rasant weiterentwickelt ^1,2,3. Die Fähigkeit, Gene in Zelllinien oder Bakterien einzu- oder auszuknocken, ist von unschätzbarem Wert für die Förderung der Forschung und das Verständnis intrazellulärer Mechanismen 1,2,3,4,5,6. Das CRISPR-Cas9-System verbessert frühere Gen-Editing-Methoden, wie z. B. die Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornuklease (TALEN), indem es die Entwicklung der Genspezifität vereinfacht. Dieses Verfahren umfasst zwei grundlegende Komponenten: die Guide-RNA (gRNA), die zur Lokalisierung des beabsichtigten Genziels verwendet wird, und Cas9, eine Endonuklease, die die vorgesehene Genomposition mit einem doppelsträngigen DNA-Bruch modifiziert ^3,4. Die gRNA dient als Leitfaden für die Cas9-Endonuklease, um den Doppelstrangbruch an der beabsichtigten genetischen Sequenz durch Watson-Crick-Basenpaarung zu lokalisieren und zu initiieren. Der gesamte Prozess der Genom-Editierung durch das CRISPR/Cas9-System umfasst die zelluläre Maschinerie, die diese doppelsträngigen Brüche in der DNA durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder homologe Rekombination repariert ^3,7. Es ist wahrscheinlicher, dass NHEJ auftritt und effektiv eine Mutation im Genom erzeugt, die zu einem Expressionsverlust für das Zielgen ^3,4 führt.

Kommerzielle Quellen waren in der Lage, Bibliotheken von gRNA-Zielen zu erstellen, die durch Bakterienwachstum und -isolierung exprimiert werden können, was ihre Benutzerfreundlichkeit erheblich verbessert. Die Haupteinschränkung des CRISPR/Cas9-Systems ist jedoch die Schwierigkeit, die gRNA und den Cas9-Komplex in die Zielzelllinien zu bringen. Diese Einschränkungen treten bei Suspensionszelllinien auf, da sie allgemein als schwer zu transfizieren⁸ bezeichnet werden. Typische Transfektionsmethoden sind in der Regel nicht effizient bei der Verabreichung des CRISPR/Cas9-Systems in Suspensionszellen, weshalb virale Verabreichungsmethoden wie die lentivirale Transfektion und Transduktion für diese Art von Zelllinie besser geeignet sind ^8,9.

Diese Art der Transfektion erfordert einen lentiviralen Vektor, der für die gRNA und die Cas9-Endonuklease kodiert, zusammen mit hinzugefügten lentiviralen Verpackungsplasmiden, die in eine Zelllinie transfiziert werden, die in der Lage ist, lentivirale Partikel herzustellen. Eine typischerweise gewählte Zelllinie für diesen Prozess sind HEK293T Zellen, da sie leichter zu transfizieren sind und sehr effizient beim Assemblieren von gRNA und Cas9^{arbeiten 9,10}. Diese Partikel werden dann als Lentiviren in den Überstand freigesetzt, mit dem die gRNA und Cas9 in die vorgesehene Suspensionszelllinie, wie z. B. U937 menschliche Monozyten, transduziert werden können. Daher weist das hier beschriebene Verfahren im Vergleich zu etablierten Methoden die folgenden Änderungen auf: (1) Alternative Transfektionsmethode für schwer zu transfizierende Zelllinien; (2) Es ist nicht erforderlich, CRISPR-Plasmid-DNA zu konzentrieren oder Ultrazentrifuge zu verwenden; und (3) Es macht die Klonierung einzelner Zellen überflüssig.

Der direkte Fokus dieses Artikels lag auf dem Knockout des RIP1-Gens in menschlichen U937-Monozyten. Die kanonische Form des hochinflammatorischen Zelltodwegs Nekroptose wird durch RIP1 kontrolliert, das als zentrales Ziel für Zelltodstudien dient. 11,12,13,14 Wenn RIP1 durch Autophosphorylierung aktiv wird, rekrutiert es die direkte Phosphorylierung und Aktivierung der Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3/RIP3) und der gemischten Kinase-Domänen-ähnlichen (MLKL) Pseudokinase, um das Nekrosom zu bilden. Nach dieser Bildung kann sich das Nekrosom frei in der Zelle bewegen, um mit Organellen wie den Mitochondrien zu interagieren ^12,13. In den Mitochondrien potenziert RIP1 eine positive Rückkopplungsschleife mit dem Zellstoffwechsel, die sich direkt auf die Produktion von mitochondrialen ROS auswirkt, was wiederum die weitere Autophosphorylierung von RIP1, die Bildung von Nekrosomen und die nachgeschaltete Ausführung der Nekroptose^fördert 11,12,13,14.

Während der Fokus der aktuellen Forschungsgruppe auf der Rolle von RIP1 beim Zelltod liegt, sind andere Gründe, RIP1 zu untersuchen, seine Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Nach der Aktivierung durch Todesrezeptoren wie TNF-Rezeptoren fördert RIP1 die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs, der die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen und anderen Molekülen auslöst, die für die Rekrutierung von Immunzellen und die Verstärkung der Entzündungsreaktion essentiell sind¹⁵. Neben der NF-κB-Aktivierung kann RIPK1 auch MAPK-Signalwege aktivieren, was die Entzündung weiter verstärkt^15,16. In Bezug auf seine Rolle bei der Reaktion auf eine Infektion fungiert RIP1 als zentraler Mediator der Entzündungsreaktion des Wirts, insbesondere als Reaktion auf pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), die von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie Toll-like-Rezeptoren (TLRs)¹⁷ erkannt werden. Darüber hinaus wird RIP1 während der Sepsis durch Signalübertragung über Todesrezeptoren wie den TNF-Rezeptor aktiviert, was zur Initiierung von proinflammatorischen Kaskaden führt. RIPK1 vermittelt die Aktivierung des NF-κB- und des MAPK-Signalwegs und fördert die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-1β und IL-6, die Schlüsselfaktoren für die systemische Entzündungsreaktion sind, die für Sepsis^{charakteristisch ist 18}.

Protocol

Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Leit-RNA (gRNA) und die Zielsequenz sind in Tabelle 1 angegeben. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ernte eines RIP1-targetingden CRISPR gRNA lentiviralen Expressionsvektors, der Cas9-Endonuklease und Puromycin-Resistenz aus Escherichia coli enthält

1. Quadrantenstreifen-E. coli, die lentivirale Vektor-gRNAauf LB-Agarplatten beherbergen, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
2. Inkubieren Sie die Platten bei 37°C für 1-2 Tage, bis einzelne Kolonien im am stärksten verdünnten Bereich der Platte sichtbar sind.
3. Wählen Sie eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Schleife aus und geben Sie jede Kolonie einzeln zu 5 ml LB-Bouillon, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass Sie nach dem Hinzufügen der einzelnen Kolonie gründlich auf und ab pipettieren, um eine Homogenisierung zu gewährleisten.
4. Entlüften und kleben Sie die Kappe des konischen 50-ml-Röhrchens ab und inkubieren Sie es 8 Stunden lang bei 37 °C und 225 U/min in einem Orbitalschüttler.
5. Während der 8-stündigen Inkubation bei 37 °C werden 40 ml LB-Bouillon, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, in jedes der vier separaten konischen 50-ml-Röhrchen gegeben.
6. Nach der 8-stündigen Inkubation bei 37°C werden 40 μl gezüchtetes E entnommen.coli-Kultur und geben Sie es in alle vier konischen 50-ml-Röhrchen.
7. Entlüften und kleben Sie die Kappen der konischen 50-ml-Röhrchen ab und inkubieren Sie sie in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 225 U/min für 12-16 Stunden.
8. Nach dieser Inkubation bei 37°C werden alle Röhrchen bei 3220 x g in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 Minuten heruntergeschleudert, um die gezüchteten E. coli-Bakterien zu pelletieren.
9. Überstände in ein Abfallbecherglas umfüllen, dann alle vier Pellets in 10 ml LB-Bouillon mit 100 μg/ml Ampicillin mischen.
10. Schleudern Sie die kombinierten Pellets erneut mit maximaler Drehzahl in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 Minuten, um ein einzelnes Pellet zu erhalten.
11. Entsorgen Sie so viel Überstände wie möglich in das Abfallbecherglas und fahren Sie mit einer der folgenden Optionen fort: (1) Nasses Granulat bei -80° bis zu 1 Monat einfrieren. (2) Fahren Sie mit der Reinigung des lentiviralen Vektorplasmids fort.
    HINWEIS: Wenn Option 1 gewählt wird, kann das Protokoll hier pausiert werden.

2. Transfektion von HEK293T Zellen mit aufgereinigtem lentiviralem CRISPR-gRNA-Expressionsvektor, der auf RIP1 abzielt

1. Zellen HEK293T über Nacht in einer Konzentration von 3 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ Zellen in eine 10 cm dicke Platte säen, die DMEM mit 4,5 g/l D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/l Natriumpyruvat und 10 % hitzeinaktiviertem FBS enthält.
2. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Platten eine Konfluenz von etwa 70 % bis 90 % aufweisen, und fahren Sie dann mit dem Protokoll fort.
3. Richten Sie die Transfektion der Zellen mit einem Verhältnis von 1:1:1:1 von Plasmiden (experimentelles CRISPR-Plasmid: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) unter Verwendung des Transfektionsreagenzes im Verhältnis 3:1 (3 Teile Reagenz: 1 Teil Plasmid-DNA) zusammen mit reduziertem Serummedium ein.
   HINWEIS: Der pLP1: pLP2: pLP/VSVG-Anteil des Verhältnisses ist eine lentivirale Verpackungsmischung.
   1. Das Transfektionsreagenz, das reduzierte Serummedium, die CRISPR-Plasmid-DNA und die lentivirale Verpackungsmischung vor dem Aufbau der Transfektion auf Raumtemperatur äquilibrieren.
   2. Mischen Sie 75 μl des Transfektionsreagenzes, 2500 μl reduziertes Serummedium und 25 μg Gesamt-DNA (Berechnung basierend auf der Spektrophotometeranalyse für CRISPR-Plasmid-DNA und einem Verhältnis von 1:1:1:1 mit lentiviraler Verpackungsmischung).
   3. Lassen Sie diese Mischung 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Pipettieren Sie vorsichtig das gesamte Volumen dieser Mischung auf die konfluente HEK293T Zellplatte direkt in das Medium (kein Medienwechsel erforderlich).
4. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine ausreichende Homogenisierung der Transfektionsmischung und des Plattenmediums zu gewährleisten. Die Platte bei 37 °C 48 h inkubieren.

3. Lentivirale Transduktion von U937-Zellen oder Zielzellen

1. Sobald die 48-stündige Inkubation bei 37 ^°C abgeschlossen ist, überführen Sie das Medium vom Produzenten HEK293T der Zellplatte in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
2. Das Volumen wird bei 800 x g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die verbleibenden HEK293T Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie alle virushaltigen Überstände, achten Sie darauf, die pelletierten HEK293T Zellen nicht zu stören, und bewahren Sie sie in einem separaten konischen 15-ml-Röhrchen auf. Dekontaminieren Sie dann das pellethaltige Rohr und entsorgen Sie es in den entsprechenden Behälter für biologisch gefährliche Abfälle.
   HINWEIS: HIV-basierte Lentivirus-Überstände können bei -80 °C gelagert werden; Dies birgt jedoch das Risiko eines Verlusts der Virusstabilität von bis zu 55 % nach dem ersten Frost-/Auftauzyklus¹⁹.
3. Ein Pellet von 2 × 10⁶ U937-Zellen wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen gezählt und erhalten, indem ein geeignetes Volumen bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand dekantiert wird, wobei das Küvettenpellet im Röhrchen verbleibt.
4. Resuspendieren Sie das U937-Zellpellet mit dem gesamten virushaltigen Überstand und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann bei 290 x g für 60 min.
5. Nach der Zentrifugation wird das Pellet mit einer Pipette wieder suspendiert, wobei sich der virushaltige Überstand bereits im Röhrchen befindet.
6. Legen Sie das Rohr für 60 Minuten auf einen End-over-End-Rotator (oder eine ähnliche rotierende Vorrichtung).
   1. Nach dieser Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
   2. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Medienmischung im Verhältnis 1:1 aus virushaltigen Überständen und vollständigem RPMI-1640-Medium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS ergänzt wird.
7. Die Zellmischung auf eine 10 cm große Gewebekulturplatte umfüllen und 48 h bei 37°C inkubieren.
8. Nach dieser Inkubation werden die U937-Zellen 10 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
   1. Resuspendieren Sie das Pellet mit vollständigem RPMI-1640-Medium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 5 μg/ml Puromycin ergänzt ist, und überführen Sie die Zellen in einen T25-Kolben.
   2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C 2-3 Wochen lang unberührt und stellen Sie sicher, dass sie alle 1-2 Tage auf Anzeichen von Zellwachstum überprüft werden.
      HINWEIS: Sobald die Zellen konfluent werden und nach einer ersten Passage eine gesunde Umsatzzeit haben, können sie auf die Wirksamkeit des abgeschlossenen Protokolls getestet werden.

4. Prüfung der Wirksamkeit des abgeschlossenen Protokolls bei der Herstellung von RIP1-CRISPR-Mutantenzellen mittels Western-Blot-Analyse

1. Erzeugung zellulärer Proteinlysate von Wildtyp-(WT) U937-Monozyten, Non-Targeting-Kontroll-CRISPR-Zellen (NTC) und den RIP1-CRISPR-Mutantenzellen 11,12,13.
2. Führen Sie diese Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel durch und fahren Sie mit der Western-Blot-Analyse^{fort 14}.
   1. Normalisieren Sie die Proben zuerst auf ein Haushaltsprotein.
   2. Nach der Normalisierung sind die Proben auf RIP1-Proteinexpressionsniveaus zu analysieren, um den Erfolg der Erzeugung einer RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie angemessen zu bestimmen¹⁴.
3. Nach der Konformation der Western-Blot-Analyse können die Zellen für Experimentierzwecke verwendet werden.

Results

Nach der Produktion einer konfluenten Population von RIP1-CRISPR-mutierten U937-Zellen wurden SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die erfolgreiche Bildung einer RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie zu bestimmen, indem der Verlust der RIP1-Proteinexpressionsniveaus bewertet wurde. Diese Bestimmung erfolgte auf der Grundlage des Vergleichsergebnisses von WT U937-Monozyten und NTC-Zellen. In Abbildung 2 wurde die Expression v...

Discussion

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Anleitung und Analyse potenzieller Fallstricke in der Effizienz und Zuverlässigkeit der lentiviralen Transfektion und Transduktion zur Schaffung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie bereitzustellen. Obwohl diese Methode der Transfektion und Transduktion arbeits- und zeitintensiv ist, wird sie im Allgemeinen als effiziente Methode angesehen, um die ausgewählte gRNA und Cas9-Endonuklease in schwer zu transfizierende Zelllinien einz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angepasstes DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	Nr. A1593
BisBenzimid Hoechst 33342 Trihydrochlorid	Sigma	Nr. B2261
Komplett RPMI-1640 Medium	Sigma	Nr. R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Stamm	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Stamm	transOMIC	TEVH-1162203
Ende-über-Ende-Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluoreszenzmikroskop	Lebenstechnologien
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper, (H+L) HRP Konjugat	Sigma	AP307P
HEK293T Zellen	ATCC
Schüttler für Inkubator	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Brühe	BD	244610
LV-MAX Lentiviraler Verpackungsmix	Gibco	Nr. A43237
MitoSOX Rot	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spektralphotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	Nr. P7255
Kaninchen Anti-Human-RIP1 mAb	Zell-Signaltechnik	3493
SDS-PAGE und Western-Blot-Geräte	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Humane Monozyten	ATCC
WST-1 Assay-System für Zellproliferation	Takara	MK400
X-tremeGENE 9 Reagenz für DNA-Transfektion	Roche Diagnostik	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	Nr. A1902