Da CRISPR-bezogene Protokolle immer nützlicher und zugänglicher werden, können unter bestimmten experimentellen Bedingungen immer noch Komplikationen und Hindernisse auftreten. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-Zelllinie unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und hebt mögliche Herausforderungen hervor, die während dieses Prozesses auftreten.
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Methodenartikel
Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ausschaltung des RIP1-Gens mittels CRISPR/Cas9 in der humanen Monozyten-Zelllinie U937. Die Methode verwendet designierte Guide-RNA-Plasmide und lentivirale Verpackungsplasmide, um einen RIP1-Gen-Knockout zu erreichen. Das Protokoll befasst sich mit Herausforderungen und Verbesserungen traditioneller CRISPR-Methoden und ermöglicht deren Replikation für zukünftige Zelltodstudien. Die so entstandenen mutierten Zellen können verwendet werden, um mechanistische Veränderungen des Zelltods zu untersuchen, bei denen sonst funktionelle RIP1-Proteine eine Rolle spielen würden. Viabilitätsassays zeigten eine signifikante Verringerung des Zelltods in Knockout-Zellen nach Nekroptose-Induktion. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte unter gleichen Bedingungen eine deutliche Abnahme der mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Knockout-Zellen. Zusammen bestätigen diese funktionellen Assays den Verlust des RIP1-Proteins. Dieses Verfahren ist für die Verwendung mit humanen U937-Monozyten optimiert und kann auch so angepasst werden, dass es auf andere wichtige Zelltodregulatoren abzielt, wodurch funktionelle, nicht-letale Mutanten entstehen. Potenzielle Fallstricke werden durchgehend angesprochen, um Einblicke in die Herausforderungen zu geben, die bei der Mutantengenerierung auftreten können.
Einleitung
Der Einsatz der CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Technologie hat sich seit ihrer Entdeckung rasant weiterentwickelt 1,2,3. Die Fähigkeit, Gene in Zelllinien oder Bakterien einzu- oder auszuknocken, ist von unschätzbarem Wert für die Förderung der Forschung und das Verständnis intrazellulärer Mechanismen 1,2,3,4,5,6. Das CRISPR-Cas9-System verbessert früher....
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Protokoll
Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Leit-RNA (gRNA) und die Zielsequenz sind in Tabelle 1 angegeben. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Ernte eines RIP1-targetingden CRISPR gRNA lentiviralen Expressionsvektors, der Cas9-Endonuklease und Puromycin-Resistenz aus Escherichia coli enthält
- Quadrantenstreifen-E. coli, die lentivirale Vektor-gRNAauf LB-Agarplatten beherbergen, ergänzt mit 100 μg/ml ....
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Ergebnisse
Nach der Produktion einer konfluenten Population von RIP1-CRISPR-mutierten U937-Zellen wurden SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die erfolgreiche Bildung einer RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie zu bestimmen, indem der Verlust der RIP1-Proteinexpressionsniveaus bewertet wurde. Diese Bestimmung erfolgte auf der Grundlage des Vergleichsergebnisses von WT U937-Monozyten und NTC-Zellen. In Abbildung 2 wurde die Expression v.......
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Diskussion
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Anleitung und Analyse potenzieller Fallstricke in der Effizienz und Zuverlässigkeit der lentiviralen Transfektion und Transduktion zur Schaffung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie bereitzustellen. Obwohl diese Methode der Transfektion und Transduktion arbeits- und zeitintensiv ist, wird sie im Allgemeinen als effiziente Methode angesehen, um die ausgewählte gRNA und Cas9-Endonuklease in schwer zu transfizierende Zelllinien einz.......
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Danksagungen
Diese Forschung wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) der National Institutes of Health (NIH) unter der Fördernummer NIH 2R15-HL135675-02 an T.J.L. finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Angepasstes DMEM Medium | Gibco | 11995-040 | |
| Ampicillin | Sigma | Nr. A1593 | |
| BisBenzimid Hoechst 33342 Trihydrochlorid | Sigma | Nr. B2261 | |
| Komplett RPMI-1640 Medium | Sigma | Nr. R6504 | |
| CRISPR NTC gRNA E.coli Stamm | transOMIC | TELA1011 | |
| CRISPR RIP1 gRNA E.coli Stamm | transOMIC | TEVH-1162203 | |
| Ende-über-Ende-Rotator | Thermo Scientific | ||
| EVOS FL Fluoreszenzmikroskop | Lebenstechnologien | ||
| GenElute Plasmid Maxiprep Kit | Sigma | PLX15 | |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper, (H+L) HRP Konjugat | Sigma | AP307P | |
| HEK293T Zellen | ATCC | ||
| Schüttler für Inkubator | New Brunswick Scientific | ||
| LB Agar | BD | 244520 | |
| LB Brühe | BD | 244610 | |
| LV-MAX Lentiviraler Verpackungsmix | Gibco | Nr. A43237 | |
| MitoSOX Rot | MedChemExpress | HY-D1055 | |
| NanoDrop Spektralphotometer | Thermo Scientific | ||
| Necrostatin-1 | MedChemExpress | HY-14622A | |
| OPTI-MEM | Gibco | 31985-062 | |
| Puromycin | Sigma | Nr. P7255 | |
| Kaninchen Anti-Human-RIP1 mAb | Zell-Signaltechnik | 3493 | |
| SDS-PAGE und Western-Blot-Geräte | BioRad | ||
| TNF-α | MedChemExpress | HY-P7058 | |
| U937 Humane Monozyten | ATCC | ||
| WST-1 Assay-System für Zellproliferation | Takara | MK400 | |
| X-tremeGENE 9 Reagenz für DNA-Transfektion | Roche Diagnostik | 6365779001 | |
| z-VAD-FMK | APExBIO | Nr. A1902 |
Referenzen
- Gostimskaya, I. CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing. Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).
- Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
