Methodenartikel

Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie und selbst etablierte Datenbankanalyse von Bestandteilen der chinesischen Pflanzenheilkunde

DOI:

10.3791/66091

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3. November 2023

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1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, 2General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein allgemeines Protokoll und ein systematisches Design, das angewendet werden könnte, um komplexe Komponenten im alpinen Schafgarbenkraut Achillea millefolium L., einem chinesischen pflanzlichen Arzneimittel, zu trennen und zu erkennen.

Zusammenfassung

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Die chinesische Kräutermedizin ist komplex und enthält zahlreiche unbekannte Verbindungen, was qualitative Forschung entscheidend macht. Die Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS) ist die am weitesten verbreitete Methode zur qualitativen Analyse von Verbindungen. Die Methode umfasst standardisierte und programmierte Protokolle für die Probenvorbehandlung, MS-Tune, MS-Erfassung und Datenverarbeitung. Die Probenvorbehandlungen umfassen Sammlung, Pulverisierung, Lösungsmittelextraktion, Ultraschall, Zentrifugation und Filtration. Die Datennachbearbeitung wurde ausführlich beschrieben und umfasst den Datenimport, den selbst erstellten Datenbankaufbau, die Methodeneinrichtung, die Datenverarbeitung und andere manuelle Operationen. Der oberirdische Teil des Alpenschafgarbenkrauts, Achillea millefolium L., wird zur Behandlung von Entzündungen, Magen-Darm-Störungen und Schmerzen eingesetzt, und seine 3-Oxa-Guaianolide könnten nützliche Hinweise für die Entwicklung entzündungshemmender Medikamente sein. Es wurden drei repräsentative Verbindungen bei AML identifiziert, die TOF-MS mit einer selbst etablierten Datenbank kombinieren. Darüber hinaus wurden die Unterschiede zur vorhandenen Literatur, die Optimierung der Flüssigphasenparameter, die Auswahl des Scan-Modus, die Eignung der Ionenquelle, die Anpassung der Kollisionsenergie, das Isomerenscreening, die Methodenbegrenzung und mögliche Lösungen diskutiert. Diese standardisierte Analysemethode ist universell einsetzbar und kann zur Identifizierung komplexer Verbindungen in der chinesischen Kräutermedizin angewendet werden.

Einleitung

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Die chinesische Medizin hat das reichste empirische Wissen der Welt angesammelt1. Die qualitative Analyse chemischer Bestandteile in der traditionellen chinesischen Kräutermedizin ist zu einem zentralen Thema in der Forschung geworden2. Die Unterscheidung chemischer Unterschiede in der chinesischen Kräutermedizin ist aufgrund der Komplexität der Kategorien und der Diversifizierung der Herkunft schwierig3. Zu den wichtigsten Verbindungstypen in der chinesischen Kräutermedizin gehören Alkaloide, Saponine, Flavonoide, Anthrachinonen, Terpenoide, Cumarine, Lignane, Polysaccharide, Polypeptide und Proteine1. Die Trennung von Verbindungen und die Identifizierung von Isomeren behindern jedoch die Entwicklung der qualitativen Forschung zur chinesischen Kräutermedizin.

Die Kombination von Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC) mit geeigneten Chromatographiesäulen bietet eine starke Unterstützung für die Trennung komplexer Verbindungen in der chinesischen Kräutermedizin4. In den letzten Jahren hat die hochauflösende Massenspektrometrie in der qualitativen Analyse der chinesischen Kräutermedizin immer mehr an Popularität gewonnen. Zu den häufig verwendeten hochauflösenden Massenspektrometriemethoden gehören die Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (Q-TOF-MS)5, die Orbitrap-Massenspektrometrie (Orbitrap-MS)6 und die Fourier-Transformations-Ionenzyklotron-Massenspektrometrie (FT-ICR-MS)7. FT-ICR-MS hat die höchste Auflösung, ist aber mit kostspieligen Betriebs- und Wartungskosten verbunden8. Orbitrap-MS hat Vorteile beim Nachweis kleinmolekularer Verbindungen, insbesondere bei Molekulargewichten unter 500 Da9. Die Q-TOF-MS ist die am weitesten verbreitete Methode in der qualitativen Analyse der Pharmakochemie des Serums10,11. Im Vergleich zur traditionellen Netzwerkdatenbank oder kommerziellen Datenbank hat sich die gemeinsame Analyse mit einer selbst etablierten Datenbank zur Datenverarbeitung immer mehr durchgesetzt.

Alpenschafgarbenkraut, Achillea millefolium L. (AML), eine Art chinesisches Kräuterheilmittel, wächst hauptsächlich in Xinjiang, in der Inneren Mongolei und in den nordöstlichen Gebieten Chinas12. Der oberirdische Teil der AML wird häufig zur Behandlung von Entzündungen, Magen-Darm-Störungen und Schmerzen eingesetzt, einschließlich Rheumatalgie, Zahnschmerzen und Bauchschmerzen13. Die 3-Oxa-Guaianolide aus AML bieten großes Potenzial als Leitstrukturen für die Entwicklung entzündungshemmender Medikamente14. Aktuelle Studien zu chemischen Komponenten bei AML konzentrieren sich auf Sesquiterpene, Monoterpene, Flavonoide und phenolische Verbindungen15. Für die Identifizierung von Verbindungen bei AML steht jedoch kein systematisches qualitatives Induktionsschema zur Verfügung, das für andere chinesische pflanzliche Arzneimittel verwendet werden könnte. Ziel dieser Studie ist es, durch die Kombination von Q-TOF-MS und selbst etablierter Datenbankanalyse eine standardisierte Identifizierung chemischer Komponenten in der chinesischen Kräutermedizin zu ermöglichen.

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Protokoll

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1. Vorbehandlung der Proben

  1. Sammlung der chinesischen Kräutermedizin AML
    1. Pflanzen Sie im Februar die Samen des Alpenschafgarbenkrauts, Achillea millefolium L. (AML) in die Erde. Sammeln Sie den oberirdischen Teil der AML im Juli desselben Jahres (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die in dieser Arbeit verwendete AML wurde in einem bergigen Gebiet in einer Höhe von 400 m in Mianyang, Sichuan, China, gesammelt.
  2. Trocknungsbehandlung
    1. Waschen Sie alle gesammelten AML in reinem Wasser, um Sedimente und Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie die AML 24 h lang bei 50 °C im Ofen (Abbildung 1B).
  3. Zubereitung von Pulver
    1. Nach dem Trocknen wird AML mit einem Hochgeschwindigkeits-Multifunktionsbrecher zu einem groben Pulver zerkleinert. Das Pulver durch ein 50-Mesh-Sieb passieren (Abbildung 1C).
  4. Extraktion mit Lösungsmitteln
    1. 1 g der genau gewogenen AML-Probe wird in einen ermächtigten Kolben mit 30 ml einer 75%igen Ethanol-Wasser-Lösung gegeben (Abbildung 2A).
    2. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 25 °C in einem Ultraschallbad-Ultraschallgerät extrahiert (Abbildung 2B).
    3. Zentrifugieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei 14.000 × g (Abbildung 2C).
    4. Setzen Sie eine Injektionsspritze mit einem mikroporösen Membranfilter (0,22 μm, nur organisch) ein und filtrieren Sie den Überstand in eine 2-ml-Probenflasche (Abbildung 2D).

2. MS-Optimierung

  1. Starten Sie die LC-MS-Steuerungssoftware (Abbildung 3A). Öffnen Sie das MS tune-Modul und spülen Sie die 1 ng/μl Leucin-Enzephalin (LE)-Lösung zweimal.
  2. Stellen Sie im LockSpray Flow Control Panel eine Durchflussrate von 50 μl/min ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Flow , um die LE-Lösung in das Massenspektrometer gelangen zu lassen (Abbildung 3B).
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche LockSpray Source Setup , um die MS-Optimierung im positiven Modus abzuschließen (Abbildung 3C). Klicken Sie auf das negative Symbol , um den Ionenmodus zu wechseln. Klicken Sie auf die Schaltfläche LockSpray Source Setup , um die MS-Optimierung im Negativmodus abzuschließen.

3. MS-Erwerb

  1. Legen Sie eine Sequenztabelle fest, die den Dateinamen, die MS-Methode, die Einlassdatei, das Fläschchen und das Volumen enthält. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Sequenztabelle aufzuzeichnen.
  2. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Ausführen und Starten (Abbildung 3D). Wählen Sie die Option Nur Beispieldaten erfassen . Klicken Sie auf die Schaltfläche OK , um die Datenerfassung zu starten.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Chromatogramm , um das Echtzeit-Fenster für das Gesamtionenchromatogramm (TIC) zu öffnen (Abbildung 3E). Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Anzeige und TIC . Wählen Sie die Option BPI-Chromatogramm und klicken Sie dann auf die Schaltfläche OK , um das Fenster für das Basis-Peak-Chromatogramm (BPI) anzuzeigen (Abbildung 3F).

4. Datenverarbeitung

  1. Starten Sie die Datenanalysesoftware.
  2. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen "Meine Arbeit " und dann auf die Schaltfläche "MassLynx-Daten importieren ", um das untergeordnete Fenster aufzurufen (Abbildung 4A). Wählen Sie die Rohdatendateien aus, geben Sie den Namen des Sample-Sets ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche UNIFI Sample-Set erstellen , um die Rohdaten der MS-Spektren zu importieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die positiven und negativen Rohdaten separat importiert werden.
  3. Aufbau einer Datenbank
    1. Klicken Sie im ersten Fenster auf die Schaltfläche Administration (Abbildung 4B). Klicken Sie auf die Schaltfläche Bibliothekselemente importieren . Wählen Sie die Datenbankvorlagendatei in .xlsx Format mit allen getrennten zusammengesetzten Strukturen im .mol-Format im selben Ordner aus.
    2. Geben Sie einen Namen für die Datenbank ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Überprüfen , um sicherzustellen, dass alle Verbindungen angezeigt werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Importieren , um den Aufbau einer selbst erstellten Datenbank abzuschließen.
      HINWEIS: Alle Verbindungen in unabhängigen Dateien im .mol-Format, die in die Datenbank importiert werden müssen, werden auf der Grundlage der Literaturhinweise erstellt. Zusammengesetzte Strukturdateien werden von einem selbst mit Hilfe einer Zeichensoftware gezeichnet.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysemethode erstellen , um ein untergeordnetes Fenster zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Nur Prozessmethode generieren , um eine Datenverarbeitungsmethode einzurichten.
  5. Datenanalyse
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse erstellen , um ein untergeordnetes Fenster zu öffnen.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse aus vorhandenen Daten erstellen und wählen Sie dann die importierten Daten und die etablierte Methode aus.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verarbeiten , um eine Berechnung langer Daten zu starten (Abbildung 4D).
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Untersuchen , um zum TIC-Fenster zu wechseln.
    5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ablaufverfolgungen auswählen und wählen Sie den TOF MSE BPI AUS. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle ersetzen , um den BPI anzuzeigen.
  6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Option Spalte hinzufügen | Zeigen Sie Verbindungsinformationen an, einschließlich des Verbindungsnamens, der natürlichen Masse, der beobachteten m/z, des Massenfehlers, der beobachteten Retentionszeit (RT), der Detektoranzahl, der Antwort, der Addukte, alternativer Zuordnungen und der Gesamtzahl der gefundenen Fragmente (Abbildung 4E).
  7. Wählen Sie die Option Hochenergetische Fragmente , um die Fragmente des sekundären Massenspektrums der ausgewählten Verbindung anzuzeigen (Abbildung 4F).
  8. Zeichnen Sie die molekularen Spaltungspfade manuell für jedes Sekundärfragment (Abbildung 4G).
    HINWEIS: Beispiele werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" ausführlich beschrieben.

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Ergebnisse

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Als Vorbild diente das Alpenschafgarbenkraut, um das repräsentative Ergebnis darzustellen. Wie in Abbildung 4G gezeigt, wurde Quercetin-3'-O-Glucosid mit m/z = 463,08935 durch Verlust eines Hexose-Moleküls während der Hydrolysereaktion in ein Zwischenprodukt mit m/z = 300,02828 umgewandelt. In einem anderen Weg führte der Bruch der C-C-Bindung im Flavonoid-Strukturskelett zur Bildung eines Zwischenprodukts mit m/z = 223,06232, bei dem Hydroxymethyl und benachbartes Hydroxy in der Hexose-Einh...

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Diskussion

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Die hochauflösende Massenspektrometrie in Kombination mit einer selbst etablierten Datenbank bietet eine systematische qualitative Technologie zur Identifizierung chemischer Bestandteile in der chinesischen Kräutermedizin. Im Gegensatz zu einer kommerziellen Datenbank, die gängige traditionelle chinesische Medizin enthält, bietet eine selbst erstellte Datenbank, die in der Literatur berichtete Verbindungen verwendet, eine höhere Genauigkeit bei der Analyse seltener oder ethnischer Medizi...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde finanziert von der China Postdoctoral Science Foundation (2022MD713780), dem Inheritance and Innovation Team of TCM Treatment of Immune Diseases, dem Chongqing Medical Scientific Research Project (Joint project of Chongqing Health Commission and Science and Technology Bureau) (2022DBXM007) und der Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2018jcyjAX0370). Ein spezielles Projekt für Leistungsanreize und Beratung des Chongqing Scientific Research Institute (cstc2022jxjl120005, cstc2021jxjl130021).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ChloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
EthylacetatChuandongChemicalCAS 141-78-6
FlüssigkeitschromatographWasserACQUITY Klasse 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS Steuerungssoftware
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-ButylalkoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
PetroletherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupol-Flugzeit-MassenspektrometrieWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersSoftware zur Datenanalyse

Referenzen

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  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733(2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -J., Liao, X., Kuang, H. -M., Li, J. -Y., Zhang, S. -H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360(2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

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