Method Article

Quantifizierung der elastischen Eigenschaften von Umweltbiofilmen mittels optischer Kohärenzelastographie

DOI:

10.3791/66118

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March 1st, 2024

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1Theoretical and Applied Mechanics Program, Northwestern University, 2Civil and Environmental Engineering Department, Northwestern University, 3Mechanical Engineering Department, Northwestern University, 4Black & Veatch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel hebt die Wirksamkeit der optischen Kohärenz-Elastographie (OCE) bei der schnellen und zerstörungsfreien Charakterisierung der elastischen Eigenschaften von Biofilmen hervor. Wir erläutern kritische OCE-Implementierungsverfahren für genaue Messungen und präsentieren Youngs Modulwerte für zwei granulare Biofilme.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilme sind komplexe Biomaterialien, die aus einem gut organisierten Netzwerk mikrobieller Zellen bestehen, die von selbst produzierten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) umhüllt sind. In diesem Artikel wird eine detaillierte Darstellung der Implementierung von optischen Kohärenzelastographie-Messungen (OCE) vorgestellt, die auf die elastische Charakterisierung von Biofilmen zugeschnitten sind. OCE ist ein zerstörungsfreies optisches Verfahren, das die lokale Abbildung der Mikrostruktur, Morphologie und viskoelastischen Eigenschaften von teiltransparenten weichen Materialien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. Wir bieten einen umfassenden Leitfaden, der die wesentlichen Verfahren für die korrekte Implementierung dieser Technik beschreibt, zusammen mit einer Methodik zur Schätzung des Elastizitätsmoduls von granularen Biofilmen aus den gesammelten Messungen. Diese bestehen aus dem Systemaufbau, der Datenerfassung und der Nachbearbeitung. In der Diskussion tauchen wir in die zugrunde liegende Physik der in OCE verwendeten Sensoren ein und untersuchen die grundlegenden Einschränkungen hinsichtlich der räumlichen und zeitlichen Skalen von OCE-Messungen. Wir schließen mit möglichen zukünftigen Richtungen für die Weiterentwicklung der OCE-Technik, um elastische Messungen von Umweltbiofilmen zu erleichtern.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der Abwasserbehandlung und Wasserressourcenrückgewinnung werden zunehmend nützliche Biofilme in angeschlossenen Wachstumsreaktoren eingesetzt, um Mikroben in die Lage zu versetzen, unerwünschte Schadstoffe wie organische Stoffe, Stickstoff und Phosphat in stabilisierte Formen umzuwandeln, die leicht aus dem Wasser entfernt werden können1. In diesen Systemen ist die emergente Funktion des Biofilms, nämlich biochemische Transformationen, eng mit der Vielfalt der darin lebenden Mikroben und den Nährstoffen, die diese Mikroben erhalten, verbunden2. Dementsprechend kann das anhaltende Biofilmwachstum eine Herausforderung für die Aufrechterhaltung einer konsistenten Reaktorfunktionalität darstellen, da das neue Biofilmwachstum die gesamten Stoffwechselprozesse, die Stofftransfereigenschaften und die Zusammensetzung der Gemeinschaft des Biofilms verändern kann. Eine möglichst weitgehende Stabilisierung der Biofilmumgebung kann vor solchen Veränderungen schützen3. Dazu gehört, einen gleichmäßigen Nährstofffluss zu gewährleisten und die Struktur des Biofilms mit einer gleichmäßigen Dicke stabilzu halten 4. Die Überwachung der Steifigkeit und der physikalischen Struktur des Biofilms würde es den Forschern ermöglichen, Einblicke in den allgemeinen Zustand und die Funktion des Biofilms zu gewinnen.

Biofilme weisen viskoelastische Eigenschaftenauf 5,6,7. Diese viskoelastische Natur führt zu einer Kombination aus einer momentanen und einer langsamen, zeitabhängigen Verformung als Reaktion auf äußere mechanische Kräfte. Eine Besonderheit von Biofilmen ist, dass sie bei starker Verformung wie zähflüssige Flüssigkeiten reagieren. Umgekehrt ist ihre Reaktion bei geringfügiger Verformung vergleichbar mit Festkörpern5. Darüber hinaus gibt es innerhalb dieses kleinen Verformungsbereichs einen Verformungsbereich, in dem Biofilme eine lineare Kraft-Weg-Beziehung aufweisen 5,6,7. Verformungen innerhalb dieses linearen Bereichs sind optimal für die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen, da diese reproduzierbare Messungen liefern. Mehrere Techniken können die elastische Reaktion innerhalb dieses Bereichs quantifizieren. Die optische Kohärenzelastographie (OCE) ist eine aufstrebende Technik, die für die Analyse von Biofilmen in diesem linearen Bereich (Stämme in der Größenordnung von 10-4-10-5) angepasst wird8,9.

Die bisher etablierteste Anwendung von OCE liegt im biomedizinischen Bereich, wo die Technik zur Charakterisierung biologischer Gewebe angewendet wurde, die nur einen oberflächlichen optischen Zugang erfordern. Zum Beispiel verwendeten Li et al. OCE, um die elastischen Eigenschaften von Hautgewebe zu charakterisieren10. Andere Autoren charakterisierten die anisotropen elastischen Eigenschaften von Schweine- und menschlichem Hornhautgewebe und wie sie durch den Augeninnendruck beeinflusst werden 11,12,13,14,15,16. Einige Vorteile der OCE-Methode zur Untersuchung von Biofilmen sind, dass sie zerstörungsfrei ist und eine mesoskalige räumliche Auflösung bietet, keine Probenvorbereitung erfordert und die Methode selbst schnell ist; Es bietet co-registrierte Messungen der physikalischen Struktur und der elastischen Eigenschaften (z. B. Porosität, Oberflächenrauheit und Morphologie)8,9,17,18.

Die OCE-Methode misst die lokale Verschiebung von sich ausbreitenden elastischen Wellen in einer Probe mittels phasensensitiver optischer Kohärenztomographie (OCT). OCT ist ein optisches Interferometer mit niedriger Kohärenz, das lokale Änderungen der Probenverschiebung in eine Intensitätsänderung umwandelt, die mit einem optischen Spektrometer aufgezeichnet wird. Die OCT-Technik wurde auch in der Biofilmforschung zur Charakterisierung der mesoskaligen Struktur, der Porositätsverteilung in drei Dimensionen und der Biofilmverformung eingesetzt 17,19,20,21. Darüber hinaus schätzten Picioreanu et al. die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen unter Verwendung der inversen Modellierung von OCT-Querschnittsdeformationsbildern22.

Andererseits liefern OCE-Messungen, gekoppelt mit inverser elastodynamischer Wellenmodellierung, die Wellengeschwindigkeit elastischer Wellen in der Probe, was die Charakterisierung der elastischen und viskoelastischen Eigenschaften der Probe ermöglicht. Unsere Gruppe adaptierte die OCE-Technik für die quantitative Messung der elastischen und viskoelastischen Eigenschaften von Biofilmen 8,9,18 und validierte die Technik gegen Scherrheometriemessungen in Agarose-Gelplattenproben18. Der OCE-Ansatz liefert präzise und zuverlässige Schätzungen der Biofilmeigenschaften, da die gemessene elastische Wellengeschwindigkeit mit den elastischen Eigenschaften der Probe korreliert. Darüber hinaus kann der räumliche Abfall der elastischen Wellenamplitude aufgrund viskoser Effekte im Material direkt mit den viskoelastischen Eigenschaften korreliert werden. Wir haben OCE-Messungen der viskoelastischen Eigenschaften von bakteriellen Biofilmen aus Mischkulturen, die auf Coupons in einem rotierenden Ringreaktor (RAR) gezüchtet wurden, und granularen Biofilmen mit komplexen Geometrien unter Verwendung elastodynamischer Wellenmodelle18 berichtet.

Die OCE-Technik ist auch eine leistungsstarke Alternative zur herkömmlichen Rheometrie18, die zur viskoelastischen Charakterisierung verwendet wird. Rheometriemethoden eignen sich am besten für Proben mit planarer Geometrie. Daher können körnige Biofilme, die beliebige Formen und Oberflächenmorphologien aufweisen, mit einem Rheometer nicht genau charakterisiert werden 8,23. Darüber hinaus kann es im Gegensatz zu OCE schwierig sein, Rheometriemethoden für Echtzeitmessungen anzupassen, z. B. während des Biofilmwachstums in Flusszellen 24,25.

In dieser Arbeit zeigen wir, dass OCE-Messungen der frequenzunabhängigen Wellengeschwindigkeit von Oberflächenwellen verwendet werden können, um die elastischen Eigenschaften des Biofilms zu charakterisieren, ohne dass komplizierte Modelle erforderlich sind. Diese Entwicklung wird den OCE-Ansatz für die breitere Biofilm-Community zugänglicher machen, um die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen zu untersuchen.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des in dieser Studie verwendeten OCT-Systems. Das System umfasst mehrere Instrumente, darunter ein kommerzielles phasenempfindliches OCT-System im Spektralbereich, einen Verzögerungsgenerator, einen Funktionsgenerator und einen piezoelektrischen Wandler. Das OCT-System arbeitet nach dem Prinzip der Interferometrie mit einer breitbandigen Lichtquelle mit einer Mittenwellenlänge von 930 nm. Die gesammelte Lichtintensität, die mit komplizierten strukturellen Details in der Probe korreliert, wird in der Nachbearbeitungseinheit analysiert und dann in ein Querschnittsbild der Probe umgewandelt - allgemein als OCT-Bild bezeichnet. Die OCT-Bildgebungstiefe hängt von der Schwere der optischen Streuung in der Probe ab, die auf lokale Variationen des Brechungsindex zurückzuführen ist und in biologischen Geweben und Biofilmen auf 1-3 mm begrenzt ist. Da die optische Phase in der Probe und die Interferenzintensität durch Bewegung moduliert werden, kann das OCT zur Detektion der lokalen Probenverschiebung verwendet werden. Wir nutzen die Verschiebungsempfindlichkeit des OCT in der OCE-Methode, um das stationäre Verschiebungsfeld elastischer Wellen in der Probe zu verfolgen. Konkret gibt der Funktionsgenerator eine sinusförmige Spannung aus, um den piezoelektrischen Wandler anzutreiben. Der Wandler wiederum dehnt und zieht sich mit einem oszillierenden Zeitverlauf zusammen. Die oszillatorische Verschiebung des Wandlers überträgt durch eine 3D-gedruckte Keilspitze an der Spitze des Wandlers eine sinusförmige Kraft auf die Probenoberfläche, die zur Erzeugung harmonischer elastischer Wellen in der Probe führt. Die Keilspitze hat leichten Kontakt mit der Probe, so dass die Probe intakt bleibt, nachdem der Aktuator von der Probenoberfläche zurückgezogen wurde. Um die lokale Verschiebung in der Probe aufzuzeichnen, werden an jedem Pixel in der Probe benachbarte Tiefenscan aufgenommen, die durch eine feste Zeitverzögerung getrennt sind. Die optische Phasendifferenz zwischen aufeinanderfolgenden Scans an jedem Pixelpunkt ist proportional zur lokalen vertikalen Verschiebung am selben Punkt. Die Synchronisation zwischen der Verschiebung des Wandlers und der Abtastoptik im OCT-System wird durch einen Triggerimpuls erreicht, der vom Funktionsgenerator ausgeht und im Verzögerungsgenerator verzögert wird. Dieser Synchronisationsschritt ermöglicht die Aufnahme konsistenter Querschnittsbilder der lokalen optischen Phasenverteilung in der Probe. Diese Bilder sind direkt proportional zur lokalen vertikalen harmonischen Verschiebung in der Probe und werden als OCE-Bild bezeichnet. OCE-Bilder werden bei unterschiedlichen Betätigungsfrequenzen des Wandlers aufgenommen, um die elastische Wellenlänge und Wellengeschwindigkeit als Funktion der Frequenz zu erhalten. Die gemessenen Wellengeschwindigkeiten werden mit einem elastodynamischen Modell analysiert, um die elastischen Eigenschaften der Probe zu bestimmen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Systemeinrichtung

  1. Sammeln Sie die Systemkomponenten, zu denen das kommerzielle OCT-System (Basiseinheit, Stativ, Bildkopf und Computer), Signalgenerator, Wandler, Verzögerungs-/Impulsgenerator, ein Schalter mit BNC-Anschlüssen, BNC-Kabel und -Adapter, optische Stifte und Klemmen gehören.
  2. Schließen Sie das Sync-Signal vom Funktionsgenerator an einen Schalter an. Verbinden Sie den anderen Port des Switches mit dem Verzögerungsgenerator.
  3. Verbinden Sie den Ausgang des Funktionsgenerators mit den Wandlerleitungen.
  4. Verbinden Sie die Ausgänge des Delay-Generators mit dem Trigger-Kanal auf der Rückseite der OCT-Basiseinheit. Das Ausgangssignal des Verzögerungsgenerators ist ein Triggerimpuls, um die Bewegung der Abtastoptik im OCT-System zu initiieren.
  5. Schalten Sie die Systemkomponenten (OCT-Basisgerät, Computer, Funktionsgenerator und Verzögerungsgenerator) ein und starten Sie die OCT-Software.
  6. Konfigurieren Sie den Verzögerungsgenerator so, dass er ein Transistor-Transistor-Logik-Triggersignal an die OCT-Basiseinheit sendet. Informationen zu den Anforderungen an das Triggersignal finden Sie im Handbuch des OCT-Systems.
  7. Positionieren Sie den Schallkopf unter der OCT-Linse. Der Wandler hat eine 3D-gedruckte Keilspitze, die an einem seiner Enden aufgeklebt ist und als Linienquelle für elastische Wellen dient.

2. Bilderfassung

  1. Wählen Sie in der OCT-Software den Doppler-Erfassungsmodus und aktivieren Sie den externen Auslöser.
  2. Legen Sie den körnigen Biofilm unter die Linse in einen Probenhalter und bewegen Sie ihn mit einem Translationstisch in Richtung der Spitze des Schallkopfs. Stellen Sie sicher, dass der Schallkopf einen sanften Kontakt mit der Probenoberfläche hat, wie in Abbildung 2 gezeigt. Wir verwendeten zwei körnige Biofilme (auch bekannt als körniger Schlamm) mit unterschiedlichen Nenndurchmessern (4,3 mm und 3,3 mm). Diese Auswahl wurde getroffen, um den Einfluss der Biofilmgröße auf seine mechanischen Eigenschaften zu untersuchen. Diese wurden kommerziell erworben.
    HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete Probenhalter besteht aus einer 3D-gedruckten Kunststoffplatte mit mehreren halbkugelförmigen Vertiefungen. Dieser Halter ermöglicht keine Messungen unter nativen Bedingungen. Daher haben wir während der Messungen Wasser aus der natürlichen Umgebung eingeführt, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
  3. Geben Sie den Scanbereich an, indem Sie im Fenster des Beispielmonitors auf Start und Endpunkte der Interessenlinie (Wellenausbreitungspfad) klicken. Zentrieren Sie diese Linie in Bezug auf die Wandlerspitze und stellen Sie sicher, dass sie senkrecht zum Rand der Spitze steht.
  4. Geben Sie die Anzahl der Pixel entlang des Scanbereichs und die Tiefe der Probe an und erhöhen Sie die Anzahl der aufzunehmenden B-Bilder (2D-Querschnittsbilder), um das Signal-Rausch-Verhältnis der OCE-Bilder zu verbessern. Die vorgestellten Ergebnisse wurden mit 1523 Pixeln entlang des Scanpfades und 1024 Pixeln entlang der Tiefe erzielt. Insgesamt wurden 50 B-Scans gemacht.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen und schalten Sie den Schalter ein. Die OCT- und OCE-Bilder sollten auf dem Bildschirm angezeigt werden. Aktivieren Sie den Schalter innerhalb der Trigger-Timeout-Zeit und der Scan-Vorbereitungszeit.
  6. Stellen Sie sicher, dass die Referenzintensität im optimalen Bereich liegt, und positionieren Sie die Probe im Brennbereich des OCT-Mikroskopobjektivs. Ein richtig fokussiertes Sample sollte seine Oberkante nahe am oberen Rand des Bildes haben.
  7. Passen Sie die Phasenkontur im OCE-Bild in der Symbolleiste an, indem Sie den höheren Wert des Farbbalkens auf der linken Seite erhöhen und den niedrigeren Wert des Farbbalkens auf der rechten Seite verringern. Dadurch wird der Farbsaumkontrast erhöht.
  8. Konfigurieren Sie den Funktionsgenerator so, dass er eine einfrequente sinusförmige Spannung erzeugt, indem Sie die Sinustaste auf der Vorderseite drücken, und geben Sie die Starterregerfrequenz für die Messungen an. Die Messungen in dieser Studie beginnen bei 4 kHz und enden bei 9,6 kHz. Aktivieren Sie den Ausgabeanschluss, indem Sie die Ausgabetaste drücken.
  9. Stellen Sie eine akzeptable Spannung für die Messung ein. Dieser Wert sollte die Sichtbarkeit der Farbsäume maximieren, aber auch Phasenumbruch vermeiden. Für die Biofilme in dieser Studie und den Frequenzbereich der Messungen ergibt eine Spannung zwischen 5 und 10 V typischerweise eine Phasenkarte mit gutem Kontrast.
  10. Rufen Sie die OCT- und OCE-Images ab, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken.
  11. Wiederholen Sie die Messungen bei verschiedenen Frequenzen, um Querschnittsbilder des elastischen Wellenfeldes mit unterschiedlichen Wellenlängen (oder Streifenperioden) zu erhalten.

3. Bildanalyse

  1. Ermitteln Sie die physische Größe der Pixel. Die physikalische Pixelgröße in x erhält man, indem man das Sichtfeld in x-Richtung durch die Bildgröße in x-Richtung dividiert und dann mit dem Faktor zwei multipliziert. Die physikalische Pixelgröße in z erhält man, indem das Sichtfeld in z-Richtung durch die Bildgröße in z-Richtung geteilt wird. Die Werte für das Sichtfeld und die Bildgröße werden im Struktur-Array mit den Bildinformationen gespeichert, auf die mit der OCTFileOpen-Funktion zugegriffen werden kann, die im MATLAB SDK im ThorImageOCT-Paket bereitgestellt wird.
  2. Rufen Sie die OCT- und OCE-Matrizen mit den Funktionen OCTFileGetIntensity bzw. OCTFileGetPhase ab und nehmen Sie den Durchschnitt der aufgezeichneten Frames. Diese Funktionen werden im MATLAB SDK im ThorImageOCT-Paket bereitgestellt.
  3. Ermitteln Sie die Pixelpositionen am oberen Rand des Beispiels, indem Sie das Bild binarisieren und die weißen Pixel für jede Spalte von oben nach unten erkennen.
  4. Extrahieren Sie die Phasenverteilung des OCE-Bildes entlang dieser Kante mit der Funktion improfile und berechnen Sie die kumulative Bogenlänge in realen Dimensionen. Berechnen Sie die Bogenlänge, indem Sie die kumulative Summe der Norm der skalierten Differenzen zwischen aufeinanderfolgenden Punkten in x- und z-Richtung nehmen.
  5. Berechnen Sie die räumliche schnelle Fourier-Transformation der gemessenen OCT-Phasenverteilung (d. h. aus den OCE-Bildern) in Bezug auf die kumulative Bogenlänge mit der plomb-Funktion.
  6. Bestimmen Sie die Position des Peaks im Spektrum. Diese Position stellt die Ortsfrequenz der Welle dar. Berechnen Sie die Wellengeschwindigkeit (oder Phasengeschwindigkeit) aus dem Verhältnis der Anregungsfrequenz des Wandlers (Einheiten von Hz) und der Ortsfrequenz (Einheit der inversen Länge).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie verwendeten wir körnige Biofilme (auch bekannt als körniger Schlamm), die kommerziell gewonnen wurden. Granulate sind kugelförmige Biofilme, die sich durch Selbstaggregation bilden, was bedeutet, dass sie keinen Träger oder eine Oberfläche benötigen, auf der sie wachsenkönnen 26. Abbildung 3A zeigt ein repräsentatives Querschnittsbild der OCT, das durch die räumliche Variation des lokalen Brechungsindex in einem granulären Biofilm entsteht. Der Biofilm hat einen Nenndurchmesser von 3 mm. Einige der inneren Merkmale, einschließlich Poren und Hohlräume, die sich nahe der Probenoberfläche befinden, sind auf dem Bild zu sehen. Eine erhöhte optische Streuung entlang der Probentiefe verhindert, dass die OCT-Lichtquelle die Mitte der Probe erreicht, wodurch der zentrale Bereich keine erkennbaren Informationen mehr enthält. Abbildung 3B zeigt das OCE-Querschnittsbild der Probe für eine Wandleranregungsfrequenz von 5,1 kHz. Der lokale Kontrast im Bild korreliert mit der lokalen vertikalen Verschiebung, die durch die sich ausbreitende elastische Welle in der Probe induziert wird. Der physikalische Abstand der Streifen entlang des Ausbreitungspfades entspricht der Wellenlänge der elastischen Oberflächenwelle. Die Oberflächenwelle breitet sich in der Nähe der Probenoberfläche aus und hat eine Eindringtiefe, die nahe an der Wellenlänge liegt. Die räumliche Ausdehnung der Oberflächenwellenverschiebung ist im Bild aufgrund der begrenzten optischen Durchdringung der OCT-Lichtquelle in der Probe nicht zu sehen. Die optische Phasenverteilung entlang des elastischen Wellenausbreitungspfades (Abbildung 4A) wird verwendet, um die Ortsfrequenz der Oberflächenwelle zu bestimmen. Die Ortsfrequenz wird durch die schnelle Fourier-Transformation (FFT; Abbildung 4B) der Daten und Auswahl der Frequenz, bei der die Größe des FFT-Spektrums am größten ist.

Es ist entscheidend, eine Funktionsgeneratorspannung von ausreichender Größe zu wählen, um ein Streifenmuster zu erzeugen, das einen optimalen Kontrast im OCE-Bild aufweist. Zu hohe Spannungen sollten jedoch vermieden werden, da dies zu einer Phasenwicklung im OCE-Bild führen kann, wie in Abbildung 5A dargestellt. Phasenwicklung entsteht, weil die optische Phasendifferenz in der Messung auf das Intervall zwischen -π und π beschränkt ist. Wenn die Phase eine dieser Grenzen überschreitet, wird sie auf die entgegengesetzte Grenze gefaltet, wodurch eine diskontinuierliche Phasenverteilung entsteht. Folglich entsteht die Notwendigkeit eines Phasen-Unwrappings, was Herausforderungen mit sich bringt und potenzielle Ungenauigkeiten mit sich bringen kann. Ein weiterer Faktor, der für genaue Wellenmessungen zu berücksichtigen ist, ist die Anzahl der im OCE-Bild vorhandenen Streifen. Bei niedrigen Wandlerfrequenzen, die in Abbildung 5B dargestellt sind, kann ein vollständiger Schwingungszyklus der Oberflächenwelle aufgrund der geringen Größe des Granulats nicht vollständig erfasst werden, und das FFT-Spektrum kann fehlerhafte Schätzungen für die Ortsfrequenz (oder inverse Wellenlänge) liefern. Eine weitere Fehlerquelle bei der Schätzung der Ortsfrequenz ist das Vorhandensein von räumlich überlappenden elastischen Wellenmoden, wie Oberflächenwellen und Bulk-Scherwellen, im OCT-Bild. Diese Wellenmoden vermischen sich und erzeugen komplizierte Interferenzmuster, die möglicherweise schwer zu analysieren sind. Das Vorhandensein verschiedener Wellenmoden jenseits von Oberflächenwellen kann Interferenzeffekte in der Nähe des Wandlers einführen, abhängig von der spezifischen Probe, der Anregungsfrequenz und der Amplitude. Abbildung 6 ist ein Beispiel für ein OCE-Bild, das mit einer Anregungsfrequenz von 5,5 kHz aufgenommen wurde, in dem eine Scherwelle in der Nähe des lokalen Anregungspunkts das Oberflächenwellenfeld stört. Abbildung 7A zeigt eine Phasenverteilung, die von dem in Abbildung 4A beobachteten abklingenden Sinuswellenmuster abweicht, das auf die Kombination von Wellenmoden zurückzuführen ist. Folglich weist die resultierende FFT einen breiteren Peak auf, wie in Abbildung 7B dargestellt. Das gleiche Phänomen kann in der Nähe von Defekten wie Hohlräumen oder Bereichen mit deutlichen Variationen der elastischen/viskoelastischen Eigenschaften auftreten. In diesen Bereichen wird das lokale Verschiebungsfeld durch Interferenz der einfallenden oder Oberflächenwelle und der Streuwellen des Defekts modifiziert.

Wir berechneten die Wellengeschwindigkeit für die Oberflächenwelle bei Frequenzen zwischen 4,0 und 9,6 kHz für zwei körnige Biofilme mit unterschiedlichen Nenndurchmessern (4,3 mm und 3,3 mm). Die Wellengeschwindigkeitsdiagramme werden als Dispersionskurven bezeichnet. Bei den verwendeten Einstellungen dauerte jede Ausbreitungsmessung ca. 15 min. Innerhalb des gewählten Frequenzintervalls sind mehrere Zyklen des sinusförmigen Verschiebungsprofils in den OCE-Bildern vorhanden, was eine präzise Bestimmung der Ortsfrequenz neben einem bemerkenswerten Phasenkontrast ermöglicht. Abbildung 8 zeigt die erhaltenen Dispersionskurven. Diese Kurven stellen die durchschnittlichen Dispersionskurven für drei Stellen innerhalb jeder Probe dar. Die Oberflächenwellengeschwindigkeiten nähern sich einem konstanten Wert, der als Rayleigh-Wellengeschwindigkeit cR bezeichnet wird und durch die Beziehung mit dem Schermodul der Probe zusammenhängt.

cR = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2

wobei G der Schubmodul, r die Massendichte und ν die Poissonzahl27,28 ist. Sie ist konstant, weil die Eindringtiefe der elastischen Welle kürzer ist als der Durchmesser der Probe. Im Wesentlichen bewegt sich die elastische Welle nahe der Oberfläche der Probe mit einer Wellengeschwindigkeit, die direkt proportional zum Quadrat des Elastizitätsmoduls28 ist. Aufgrund des Messrauschens ist die Wellengeschwindigkeit in diesem Frequenzbereich jedoch nicht ganz konstant. Wir nehmen den Durchschnitt der Wellengeschwindigkeiten für Frequenzen zwischen 6,0 und 9,6 kHz für die kleinere Probe und zwischen 4,0 und 9,6 kHz für die größere Probe. Diese durchschnittliche Wellengeschwindigkeit wird dann zur Schätzung des Elastizitätsmoduls der Probe verwendet.

Wir gehen davon aus, dass die Probe aufgrund ihres hohen Wassergehalts inkompressibel ist. Somit ist ν = 0,5. Somit steht cR in direktem Zusammenhang mit E = 3G für einen inkompressiblen Festkörper, wobei E der Elastizitätsmodul der Probe27,28 ist. Die gestrichelten Linien in Abbildung 8 stellen die Rayleigh-Wellengeschwindigkeiten für die verschiedenen Proben dar. Wir gehen von einer Biofilmzusammensetzung aus, die hauptsächlich aus Wasser besteht und eine Dichte von 1000 kg/m3 ergibt. Folglich beträgt der berechnete Elastizitätsmodul der granularen Biofilme 85 kPa und 205 kPa für die granularen Biofilme mit Nenndurchmessern von 4,3 mm bzw. 3,3 mm. Diese Messung bestätigt die Fähigkeit der Technik, mechanische Eigenschaftsunterschiede zwischen den Biofilmen zu erkennen.

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Abbildung 1: Optischer Kohärenz-Elastographie-Aufbau. Das Schema des hier verwendeten Systems ist in der Abbildung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Montierte Probe. Der körnige Biofilm wird auf dem Probenhalter positioniert, während der Schallkopf sanften Kontakt mit ihm aufnimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: OCT- und OCT-Bilder eines körnigen Biofilms. (A) OCT-Bild. (B) OCE-Bild für eine Oberflächenwelle, die sich mit 5,1 kHz ausbreitet und einen guten Streifenkontrast zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Phasenverteilung und FFT. Für das in Abbildung 3B gezeigte Bild (A) Phasendifferenzverteilung entlang der Oberkante der Probe und (B) FFT der Phasendifferenzverteilung mit einem schmalen Peak. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: OCT- und OCT-Bilder eines granulären Biofilms. (A) OCE-Bild für eine Oberflächenwelle, die sich mit 5,1 kHz ausbreitet und Phasenwicklung zeigt. (B) OCE-Bild für eine Oberflächenwelle, die sich mit 1,3 kHz ohne vollständigen Zyklus ausbreitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: OCE-Bild, das eine Kombination von Modi zeigt. Dieses Bild stammt von einer anderen Stelle der Probe und zeigt die Kombination von Moden für eine Welle, die sich mit 5,5 kHz ausbreitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Phasenverteilung und FFT. Für das in Abbildung 6 gezeigte Bild (A) Phasendifferenzverteilung entlang der Oberkante der Probe und (B) FFT der Phasendifferenzverteilung mit einem breiteren Peak. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Dispersionskurven. Die Wellengeschwindigkeit in zwei Proben unterschiedlicher Größe wird bei unterschiedlichen Frequenzen mit Standardabweichungsbalken angezeigt. Die entsprechende Rayleigh-Wellengeschwindigkeit für den flachen Teil der Kurven ist oben aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die erreichbare Abbildungstiefe im OCT-System wird durch den Grad der Lichtdurchdringung von der Lichtquelle bestimmt, der von der Wellenlänge der Quelle abhängt. Darüber hinaus bestimmt die Wellenlänge die axiale Auflösung. Längere Wellenlängen können tiefer in die Probe eindringen, jedoch auf Kosten einer geringeren axialen Auflösung im Vergleich zu kürzeren Wellenlängen. Die transversale Auflösung hingegen hängt sowohl von der numerischen Apertur des Systems als auch von der Wellenlänge ab, wobei kürzere Wellenlängen eine höhere Auflösung liefern. Die Erhöhung der numerischen Apertur führt zu einem Kompromiss durch die Begrenzung der Schärfentiefe29. Die räumliche Auflösung ist auf die kürzeste elastische Wellenlänge beschränkt, die mit einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis detektiert werden kann. Die aktuelle OCE-Methodik ist auf 0,5 mmbegrenzt 9,30. Obwohl diese Technik durch die Größe der Probe begrenzt ist, sollte sie auf verschiedene Biofilmtypen anwendbar sein. Die Form des Biofilms, körnig oder flach, hemmt die Technik nicht. Auch die Transparenz der Probe spielt eine Rolle bei der Bestimmung der Eindringtiefe. Materialien mit hoher Transparenz lassen Licht durch die gesamte Probe hindurch, so dass sie für die Beobachtung nicht wahrnehmbar ist, während undurchsichtige Proben das Eindringen von Licht behindern und minimale Details über ihre innere Struktur liefern 9,28. Im Rahmen dieser Studie reicht eine Eindringtiefe im Millimeterbereich aus.

Ein weiteres mögliches Problem für diese Messungen besteht darin, dass bei größeren Proben, bei denen die Größe die Anzahl der elastischen Wellenzyklen nicht begrenzt, das Sichtfeld (FOV) des OCT-Mikroskops der begrenzende Faktor für die Anzahl der gemessenen Zyklen sein kann. Für Messungen hier ist das Sichtfeld auf 9 mm x 9 mm begrenzt; daher können elastische Wellenlängen von mehr als 9 mm in diesem OCT-Mikroskop nicht aufgelöst werden. Die Verwendung eines Objektivs mit einem breiteren Sichtfeld würde die Abbildung größerer Proben ermöglichen, was bei diesen niedrigeren Frequenzen mehr Farbsäume ergibt. Herausforderungen treten auch bei höheren Frequenzen auf. Bei den Abtastungen in dieser Studie erfährt die Welle jenseits von 10 kHz eine signifikante Dämpfung, wodurch die Größe der Phasendifferenzverteilung verringert und die Bestimmung der Ortsfrequenz erschwert wird. Dieses Problem kann durch Erhöhen der Spannung des Funktionsgenerators gemildert werden, wodurch die Verschiebung des Wandlers erhöht wird. Das Erhöhen der Verschiebung ist jedoch nur bis zu einem bestimmten Punkt sinnvoll, da dies schließlich in PhaseWrapping 9 endet. Alternativ kann die Erhöhung der Empfindlichkeit des Systems durch die Implementierung einer Lichtquelle mit höherer Leistung der durch größere Verschiebungen verursachten Phasenwicklung entgegenwirken und die Erkennung der dynamischen Reaktion auf kleinere Anregungen erleichtern. Eine höhere Empfindlichkeit erleichtert die Implementierung akustischer OCE-Methoden, die den Vorteil einer berührungslosen Belastung bieten, aber durch die hohe Dämpfung stärker beeinträchtigt werden31.

Bei der Durchführung dieser Messungen an Biofilmen ist es entscheidend, die Proben hydratisiert zu halten. Die Trocknung führt zu einer unerwünschten Erhöhung der Steifigkeit, was irrelevant ist, da der Schwerpunkt auf der Beurteilung der Eigenschaften der Probe in ihrer natürlichen Umgebung liegt. Wir haben die beleuchtungsinduzierte Trocknung nicht untersucht. Wir stellen jedoch fest, dass während der Messung regelmäßig Wasser aus der natürlichen Umgebung hinzugefügt wurde, und während dieser Zeit wurde die Probenmorphologie durch die OCT-Bilder überwacht, und es wurden keine erkennbaren Veränderungen in der Morphologie beobachtet. Darüber hinaus ist es bei der Positionierung des Schallkopfs und der Aufnahme von OCE-Bildern wichtig, die im OCT-Bild erkannten Merkmale zu berücksichtigen. Heterogenitäten entlang des Wellenausbreitungspfades haben das Potenzial, das Wellenfeld zu verzerren und sollten daher vermieden werden9. Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung eines sanften Kontakts mit dem Biofilm von entscheidender Bedeutung, da ein übermäßiger Druck auf die Probe nicht nur ihre mechanischen Eigenschaften verändern kann, sondern auch zu einer Verzerrung des Wellenfeldes führen kann. Schließlich muss der Scanbereich senkrecht zu den Wellenfronten stehen, um sicherzustellen, dass die Ortsfrequenz der harmonischen Welle aus der Messung genau bestimmt wird.

Für einige Frequenzen wurden in beiden Proben signifikante Variationen der Wellengeschwindigkeiten beobachtet, die auf ihre inhärente Heterogenität, das Wellenfeld bei dieser spezifischen Frequenz und die Morphologie der Ausbreitungspfade zurückzuführen sind. Wir haben bereits gezeigt, dass das gemessene Wellengeschwindigkeitsprofil über einen geschnittenen granulären Biofilm aufgrund der heterogenen Mikrostruktur9 ungleichmäßig ist. Folglich ist es bei der Anwendung dieser Technik auf granularen Biofilmen unerlässlich, Messungen an mehreren Stellen in der Probe durchzuführen, um eine gemittelte Darstellung abzuleiten.

Eine wichtige Beobachtung in Bezug auf die Dispersionskurven ist, dass sie für verschiedene Probengrößen unterschiedliche Verhaltensweisen aufweisen. Bei der größeren Stichprobe bleibt die Kurve über den gemessenen Bereich relativ konstant. Für die kleinere Stichprobe gibt es jedoch einen Aufwärtstrend der Wellengeschwindigkeit mit zunehmender Frequenz, insbesondere im unteren Teil des Bereichs. Dieses Phänomen kann auf das Vorhandensein viskoelastischer Effekte bei niedrigeren Frequenzen und die Erzeugung elastischer Wellenleitermoden zurückgeführt werden. Wir haben diese Effekte in unserer früheren Arbeit mit ausgefeilteren inversen Modellenberücksichtigt 8,9,18.

Es ist wichtig zu beachten, dass in aeroben Granulatsystemen die Biomasse nicht gleichmäßig über die Höhe des Reaktors verteilt ist. Während der Phasen ohne Belüftung neigen größere Granulate dazu, sich am Boden des Reaktors abzusetzen. Diese ungleichmäßige Verteilung führt dazu, dass Aggregate unterschiedlicher Größe Zugang zu unterschiedlichen Mengen an Substrat haben. Infolgedessen weisen Aggregate unterschiedlicher Größe eine unterschiedliche Zusammensetzung der Gemeinschaft auf. Da überschüssiger Schlamm selektiv entfernt wird, bleiben größere Granulate in der Regel länger im Reaktor zurück, während kleinere leichter entfernt werdenkönnen 32. Der auffällige Unterschied im Elastizitätsmodul deutet auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Biofilmzusammensetzung, Alter und mechanischen Eigenschaften hin.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Methode der optischen Kohärenzelastographie (OCE) eine schnelle und zerstörungsfreie Möglichkeit bietet, die elastische Wellengeschwindigkeit in Biofilmen zu bestimmen. Diese Methode überwindet die Einschränkungen rheologischer Messungen und weist im Vergleich zu alternativen Elastographietechniken verbesserte Eigenschaften auf 8,18. Darüber hinaus geht seine Anwendbarkeit über granulare Biofilme hinaus und umfasst jede teilweise transparente Probe mit geeigneter optischer Eindringtiefe und Größe, die groß genug ist, um vom System aufgelöst zu werden, einschließlich Beispielen wie Hydrogelen33, Hornhaut34 und Haut35. Die zukünftigen Fortschritte der Methode umfassen mehrere Schlüsselaspekte. Erstens wird die Erhöhung der Frequenz harmonischer elastischer Wellen in den Bereich von Hunderten von kHz Wellenlängen von wenigen Mikrometern ermöglichen und damit eine räumliche Auflösung in einer ähnlichen Größenordnung erreichen. Zweitens wird das Signal-Rausch-Verhältnis des optischen Detektionssystems verbessert, indem die optische Leistung des OCT-Systems von 2 mW (Strom) auf 20 mW erhöht wird. Schließlich ersetzen wir den Kontaktharmonischen durch eine berührungslose Schallabstrahlungsdruckquelle. Diese Ergänzung wird einen nicht-invasiven und zerstörungsfreien Betrieb erleichtern und die Abfrage von Biofilmproben in ihrer natürlichen Umgebung ermöglichen.

Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Rockford, IL, USA) für die Bereitstellung der in dieser Arbeit untersuchten granularen Biofilme. Die Autoren würdigen auch die Unterstützung der National Science Foundation durch die Awards #210047 und #193729.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3D-gedruckter Probenhalter
3D-gedruckte Keilspitze3 mm breite
BNC-KabelJede Marke
VerzögerungsgeneratorStanford Research SystemsDG535DG535 Digitaler Verzögerungs-/Impulsgenerator
FunktionsgeneratorAgilent Technologies33250A 80 MHz Funktions- / Arbiträrsignalgenerator
Granulärer BiofilmAqua-Aerobic SystemeGewonnen aus einem aeroben Granulatschlammreaktor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLABMathWorksRelease 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelektrischer WandlerThorlabsPK2JUP1Diskreter Piezo-Stack, 75 V, 30,0 & Mikro; m Displacement
SD-OCT SystemThorlabsGanymed II, LSM03 Scanobjektiv
ThorImageOCTThorlabsVersion: 5.5.5

References

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