Differenzierung der Abstammungslinien des enterischen Nervensystems von humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Die Ableitung von Abstammungslinien des enterischen Nervensystems (ENS) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) bietet eine skalierbare Zellquelle zur Untersuchung der ENS-Entwicklung und -Krankheit sowie zur Verwendung in der regenerativen Medizin. Hier wird ein detailliertes in vitro Protokoll zur Gewinnung enterischer Neuronen aus hPSCs unter chemisch definierten Kulturbedingungen vorgestellt.

Zusammenfassung

Das menschliche enterische Nervensystem (ENS) ist ein großes Netzwerk von glialen und neuronalen Zelltypen mit einer bemerkenswerten Vielfalt an Neurotransmittern. Das ENS steuert die Darmmotilität, die Enzymsekretion und die Nährstoffaufnahme und interagiert mit dem Immunsystem und dem Darmmikrobiom. Folglich sind entwicklungsbedingte und erworbene Defekte des ENS für viele menschliche Krankheiten verantwortlich und können zu Symptomen der Parkinson-Krankheit beitragen. Einschränkungen bei Tiermodellsystemen und beim Zugang zu primärem Gewebe stellen bei Studien des humanen ENS eine erhebliche experimentelle Herausforderung dar. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für eine effektive in vitro Gewinnung der ENS-Linien aus humanen pluripotenten Stammzellen, hPSC, unter definierten Kulturbedingungen vorgestellt. Unser Protokoll beginnt mit der gerichteten Differenzierung von hPSCs zu enterischen Neuralleistenzellen innerhalb von 15 Tagen und liefert innerhalb von 30 Tagen verschiedene Subtypen von funktionellen enterischen Neuronen. Diese Plattform bietet eine skalierbare Ressource für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung, Wirkstoffforschung und regenerative Anwendungen.

Einleitung

Das enterische Nervensystem (ENS) ist der größte Bestandteil des peripheren Nervensystems. Das ENS enthält mehr als 400 Millionen Neuronen, die sich im Magen-Darm-Trakt befinden und fast alle Funktionen des Darms steuern¹. Das molekulare Verständnis der Entwicklung und Funktion des ENS und seiner Defekte bei enterischen Neuropathien erfordert den Zugang zu einer zuverlässigen und authentischen Quelle für enterische Neuronen. Der Zugang zu menschlichem Primärgewebe ist begrenzt, und Tiermodelle können die wichtigsten Krankheitsphänotypen bei vielen enterischen Neuropathien nicht rekapitulieren. Die Technologie der humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich als äußerst vorteilhaft erwiesen, da sie eine unbegrenzte Quelle für die gewünschten Zelltypen bietet, insbesondere für solche, die nur schwer aus Primärquellen isoliert werden können 2,3,4,5,6,7. Im Folgenden stellen wir Ihnen eine schrittweise und robuste In-vitro-Methode zur Gewinnung von ENS-Kulturen aus hPS-Zellen vor. Diese skalierbaren hPSC-abgeleiteten Kulturen eröffnen Wege für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und können transplantierbare Zellen für die regenerative Medizin bereitstellen.

Die enterischen Neuronenlinien stammen von Neuralleistenzellen (NC) ab, die während der Embryogenese dem ENS-Entwicklungspfad folgen. In Embryonen entstehen NC-Zellen entlang der Ränder der gefalteten Neuralplatte. Sie vermehren sich, wandern und führen zu vielen verschiedenen Zelltypen, darunter sensorische Neuronen, Schwann-Zellen, Melanozyten, kraniofaziale Skelett- und enterische Neuronen sowie Gliazellen ^8,9,10. Die Entscheidung über das Zellschicksal hängt von der unterschiedlichen Region entlang der anterior-posterioren Achse ab, aus der die NC-Zellen hervorgehen, d.h. kraniale NC, vagale NC, Rumpf-NC und sakrale NC. Das ENS entwickelt sich aus vagalen und sakralen NC-Zellen, wobei erstere aufgrund der ausgedehnten Wanderung entlang des Darms und der Besiedlung des Darms die Population der enterischen Neuronen dominieren¹¹.

Die Ableitung von NC-Zellen aus PSCs beinhaltet üblicherweise eine Kombination aus dualer SMAD-Hemmung und Aktivierung des WNT-Signalwegs^12,13. Bis vor kurzem wurden bei allen NC-Induktionsprotokollen Serum und andere tierische Produktzusätze unter den Kulturbedingungen verwendet. Chemisch undefinierte Medien verringern nicht nur die Reproduzierbarkeit der NC-Induktion, sondern stellen auch eine Herausforderung für mechanistische Entwicklungsstudien dar. Um diese Herausforderungen zu meistern, entwickelten Barber et al.¹⁴ ein NC-Induktionsprotokoll unter chemisch definierten Kulturbedingungen und waren daher gegenüber alternativen Methoden, die auf Serumersatzfaktoren (z. B. KSR) basieren, ^{vorteilhaft13,14}. Dies wurde durch den Ersatz von Basalmedien und die Optimierung eines ursprünglich von Fattahi et al. vorgestellten Protokolls zur Ableitung enterischer NC-Zellen aus hPSCs erreicht. Dieses verbesserte System ist die Grundlage des hier vorgestellten hPSC-Differenzierungsprotokolls. Sie beginnt mit der Induktion von enterischen Neuralleistenzellen (ENC) in einem Zeitraum von 15 Tagen durch präzise Modulation der BMP-, FGF-, WNT- und TGFβ-Signalwege zusätzlich zu Retinsäure (RA). Anschließend leiten wir die ENS-Linien ab, indem wir Zellen mit dem von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) behandeln. Alle Medienzusammensetzungen sind chemisch definiert und liefern innerhalb von 30-40 Tagen robuste enterische neuronale Kulturen.

Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Monolayer-Zellkultursystem wurden alternative NC-Induktionsansätze entwickelt, die frei schwebende Embryoidkörper verwenden^15,16. Es wurde gezeigt, dass wandernde Zellen in diesen Kulturen NC-Marker exprimieren, wobei eine Untergruppe die vagale NC repräsentiert. Co-Kulturen mit primärem Darmgewebe wurden verwendet, um enterische NC-Vorläufer in diesen Kulturen anzureichern. Die Medienzusammensetzungen in diesen Studien enthalten eine Kombination verschiedener Faktoren wie Nervenwachstumsfaktor, NT3 und vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor. Zu diesem Zeitpunkt ist noch nicht vollständig klar, wie sich diese Faktoren auf die Bindungsidentitäten der enterischen Neuronen auswirken könnten. Für einen effizienten Vergleich der enterischen NC-Induktion in der Monoschicht und den Embryoidkörper-basierten Kulturen sind weitere Daten erforderlich. Angesichts der unterschiedlichen Kulturlayouts in diesen Strategien sollte der Einsatz jeder Methode in Betracht gezogen und entsprechend der spezifischen Anwendung optimiert werden.

Das hier vorgestellte Protokoll ist reproduzierbar und wurde von uns und anderen erfolgreich mit verschiedenen hPSC-Linien (induziert und embryonal) getestet ^8,14,16.

Protokoll

1. Vorbereitung der Medien

HINWEIS: Bei den im Protokoll genannten Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen der Medienkomponenten. Bereiten Sie alle Medien unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube vor und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln. Innerhalb von 2 Wochen verbrauchen.

1. hPSC-Erhaltungsmedium: Mischen Sie das zuführfreie hPSC-Erhaltungsmedium (20 μl/ml) mit dem Basismedium.
2. Medium A: Geben Sie das knochenmorphogenetische Protein 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) und CHIR99021 (600 nM) zum Differenzierungsbasismedium.
3. Medium B: Fügen Sie SB431542 (10 μM) und CHIR99021 (1,5 μM) zum Differenzierungsbasismedium hinzu.
4. Medium C: Fügen Sie SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) und RA (1 μM) zum Differenzierungsbasismedium hinzu.
5. Neuralleiste vollständig (NCC) Medium: FGF2 (10 ng/ml), CHIR99021 (3 μM), N2-Supplement (10 μl/ml), B27-Supplement (20 μl/ml), L-Glutamin-Supplement (10 μl/ml) und MEM NEAAs (10 μl/mL) zum neurobasalen Medium hinzufügen.
6. ENC-Medium: Geben Sie GDNF (10 ng/ml), Ascorbinsäure (100 μM), N2-Supplement (10 μL/ml), B27-Supplement (20 μL/mL), L-Glutamin-Supplement (10 μL/ml) und MEM NEAAs (10 μL/ml) zum neurobasalen Medium.
7. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1x: 500 mM EDTA (1000x) auf eine Endkonzentration von 500 μM in PBS verdünnen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Ca²⁺ und^{Mg 2+} freies PBS in diesem Protokoll, sofern nicht anders angegeben.

2. Beschichtung von Kulturplatten

1. Mit Basalmembranmatrix beschichtete Platten: Tauen Sie ein 500 μl gefrorenes Aliquot der Basalmembranmatrix schnell auf und verdünnen Sie es in 50 ml gekühltem DMEM:F12, indem Sie es mit einer serologischen 50-ml-Pipette kräftig pipettieren. Die Vertiefungen werden mit der verdünnten Basalmembran-Matrixlösung (100 μl pro cm² Vertiefungsfläche) bestreicht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Saugen Sie das Beschichtungsmedium vor der Verwendung an. Um eine Verkleisterung der Basalmembranmatrix zu verhindern, führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch und verwenden Sie kaltes DMEM:F12 zum Auflösen des gefrorenen Aliquots.
   HINWEIS: Die Temperatur der Basalmembranmatrix sollte während des Auftauens (auf Eis) und des Aliquotierens (Röhren auf Eis) kalt gehalten werden, um eine Koagulation zu verhindern.
2. PO/FN/Laminin-beschichtete Platten: Bereiten Sie eine 15 μg/ml Polyornithin (PO)-Lösung in PBS vor, indem Sie einen 1000-fachen Stoff verdünnen. Die Vertiefungen werden mit 100 μl PO/PBS-Lösung pro cm² Vertiefungsoberfläche bestreicht und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wird PO/PBS aspiriert und die Vertiefungen mit 100 μl pro^cm2 Well-Oberfläche mit frisch hergestellter FN/Laminin/PBS-Lösung bestrichen, die 2 μg/mL Fibronektin (FN) und 2 μg/mL Laminin enthält. Die Platten können nach einer minimalen Inkubation von 2 Stunden bei 37 °C verwendet werden. FN/Laminin/PBS vor Gebrauch aspirieren.

3. Aufrechterhaltung der hPSC-Kultur

HINWEIS: Alle Zellinkubationsschritte erfolgen bei 5 % CO₂ und bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator.

1. Aspirieren Sie hPSC-Medium aus der hPSC-Kultur und fügen Sie jeden zweiten Tag frisches Medium (200 μl pro^cm2 Well-Oberfläche) hinzu, bis die Kolonien ~80% konfluiert sind.
2. Zum Durchgang aspirieren Sie das hPSC-Medium und waschen die Zellen mit 100 μl PBS pro^cm2 Well-Oberfläche.
   HINWEIS: Es ist wichtig, Ca²⁺ und Mg²⁺ freies PBS zu verwenden, um die Zellen zu waschen.
3. Fügen Sie 500 μM EDTA (100 μl pro^cm2 Well-Oberfläche) hinzu. Setze den Deckel der Platte wieder auf. Beobachten Sie durch ein inverses Mikroskop und überwachen Sie die Zellen auf Ablösung der Kolonieränder (2-4 min).
4. Verwenden Sie eine serologische Pipette von 5 oder 10 ml, um das gleiche Volumen an hPSC-Medium in jede Vertiefung zu übertragen, und entnehmen Sie die Zellen mechanisch, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Die optimale EDTA-Inkubationszeit hängt von der iPSC-Linie ab. Vermeiden Sie heftiges Pipettieren, um Kolonien abzulösen, da dies zu übermäßiger Koloniedissoziation und Zelltod führen kann. Bei der Passage zum Starten einer Differenzierungsplatte inkubieren Sie die Zellen 1-2 min länger mit EDTA.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Zellen schleudern (2 min, 290 x g, 20-25 °C) und den Überstand vorsichtig entsorgen.
6. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen hPSC-Medium und überführen Sie sie in die Vertiefungen einer neuen, mit Basalmembranmatrix beschichteten Platte.
   HINWEIS: Für die regelmäßige hPSC-Wartung verwenden Sie ein Passageverhältnis von 1:18 - 1:24 (1:18 bedeutet, dass ein Drittel der aus einer einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte dissoziierten Zellen in eine vollständige neue Platte übertragen wird). Um eine Differenzierungsplatte zu starten, folgen Sie einem Passageverhältnis von 5:6.
7. Inkubieren Sie bei 5 % CO₂ und 37 °C.

4. Induktion der Neuralleiste

HINWEIS: Dieser Schritt ist in Abbildung 1A schematisch dargestellt. Beginnen Sie mit der NC-Differenzierung, wenn die Zellen zu etwa 80 % konfluiert sind. Dies wird innerhalb von 1-2 Tagen erreicht, wenn die Zellen im Verhältnis 5:6 durchgelassen werden (siehe oben). Beginnen Sie die NC-Differenzierung am Tag 0 mit pluripotenten und völlig undifferenzierten hPSC-Zellen. Für eine hohe Effizienz sollten die Koloniegrenzen minimale differenzierende Zellen aufweisen. Passage und Platten-hPSC zur Differenzierung, wenn die Kolonien groß sind oder das Zentrum der Kolonie bei der Überwachung mit einem inversen Mikroskop zu verdicken/dunkeln beginnt. Die Konfluenz und Morphologie ist tendenziell zuverlässiger als die Anzahl der plattierten Zellen, da diese je nach Zelllinie variieren kann und zwischen 50.000 und 200.000 pro cm² variieren kann.

1. Ersetzen Sie an Tag 0 das hPSC-Erhaltungsmedium durch Medium A mit 1 ng/ml BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μl Medium pro cm² Well-Oberfläche).
2. An Tag 2 sollten die Zellen zu 100 % konfluent sein. Aspirieren Sie verbrauchtes Medium A schonend und füttern Sie Zellen mit Medium B mit 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μl Medium pro cm² Well-Oberfläche).
   HINWEIS: Wenn Kulturen während der NC-Induktion wachsen, können sich Zellen von der darunter liegenden Monoschicht lösen. Vermeiden Sie übermäßigen Zellverlust, indem Sie alte Medien vorsichtig entfernen und frische Medien an der Seite der Vertiefung hinzufügen.
3. Füttern Sie die Zellen an Tag 4 erneut mit Medium B (200 μl Medium pro cm² Well-Oberfläche).
4. Ersetzen Sie an Tag 6 Medium B durch Medium C mit 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 und 1 μM Retinsäure (400 μl Medium pro^cm2 Well-Oberfläche).
5. An den Tagen 8 und 10 wie an Tag 6 füttern.

5. ENC-Sphäroidbildung

HINWEIS: Dieser Schritt ist in Abbildung 1B schematisch dargestellt.

1. An Tag 12 wird Medium C vorsichtig aspiriert und die Zellen mit 100 μl PBS pro^cm2 Well-Oberfläche gewaschen. Das gleiche Volumen der Zellablösungslösung zugeben und 30 min bei 5 % CO_{2 und} 37 °C inkubieren.
2. Verdünnen Sie die Zellablösungslösung durch Zugabe des gleichen Volumens NCC-Mediums, das 10 ng/ml FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μl/ml N2-Supplement, 20 μl/mL B27-Supplement, 10 μl/mL L-Glutamin-Supplement und 10 μl/mL MEM NEAA enthält. Entnehmen Sie mit einer serologischen Pipette die Einzelzellsuspension und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
3. Die Zellen schleudern (2 min, 290 x g, 20-25 °C) und den Überstand vorsichtig entsorgen.
4. Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette 12 ml (für eine volle 6-Well-Platte) NCC-Medium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen vollständig, indem Sie 1-2 Mal mechanisch auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Platte mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad.
   HINWEIS: Etwa 10 cm² ENC-Monolayer-Zellen werden in 2 ml NCC-Medium resuspendiert und in eine Vertiefung einer Platte mit extrem niedrigem Attachment übertragen. Dies entspricht einer vollständigen 6-Well-NC-Induktionsplatte, die in eine vollständige 6-Well-Aufsatzplatte mit extrem niedrigem Aufsatz übertragen wird.
5. Schwenken Sie die Platten an Tag 14 vorsichtig, bis sich kleine Sphäroide in der Mitte jeder Vertiefung angesammelt haben. Aspirieren Sie mit einer P1000-Mikropipette und in langsamen kreisenden Bewegungen das verbrauchte NCC-Medium um den Umfang jeder Vertiefung. Versuchen Sie zu vermeiden, die frei schwebenden Sphäroide zu entfernen.
6. Füttern Sie die Zellen mit dem ursprünglichen Volumen des NCC-Mediums.

6. DE Induktion

HINWEIS: Dieser Schritt ist in Abbildung 1B schematisch dargestellt.

1. Wenden Sie an Tag 15 die gleiche Technik wie an Tag 14 an, um das Medium vorsichtig zu entfernen und die Sphäroide mit PBS zu waschen. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich und vermeiden Sie die Sphäroide.
2. Geben Sie eine Zellablösungslösung (100 μl pro^cm2 Well-Oberfläche) hinzu und dissoziieren Sie die Sphäroide in einzelne Zellen, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 5 % CO_{2 und} 37 °C inkubieren.
3. Geben Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette ein gleiches Volumen ENC-Medium (enthält 10 ng/ml GDNF, 100 μM Ascorbinsäure, 10 μl/ml N2-Supplement, 20 μl/mL B27-Supplement, 10 μl/mL L-Glutamin-Supplement und 10 μL/mL MEM NEAA in neurobasalem Medium) in jede Vertiefung und brechen Sie die verbleibenden Sphäroide durch 2-3 Runden mechanisches Pipettieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Scherbelastung und Zelltod, die durch erzwungenes Pipettieren oder die Verwendung von Pipetten mit kleinerer Spitzenöffnung auftreten können.
4. Die Zellen schleudern (2 min, 290 x g, 20-25 °C) und den Überstand vorsichtig entsorgen. Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette ~ 5-10 mL ENC-Medium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen vollständig, indem Sie 1-2 Mal auf und ab pipettieren.
5. Zählen Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen mit Trypanblau und einer Zellzählmethode wie einem Hämozytometer.
   ACHTUNG: Trypanblau steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Vorsichtig behandeln, sachgerecht entsorgen.
6. Es wird ein ausreichendes Volumen des ENC-Mediums hinzugefügt, um etwa 300.000 bis 400.000 lebensfähige Zellen pro^cm2 Oberfläche bei einer Dichte von etwa ~ 1.000.000 Zellen pro ml zu plattieren. FN/Laminin/PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte aspirieren.
   HINWEIS: Wählen Sie das Plattenformat entsprechend den Assays, die für die EN-Kulturen geplant sind, da diese Phase den letzten Re-Plattierungsschritt des Protokolls markiert. Vorläuferzellen von enterischen Neuronen können am Tag 15 eingefroren werden. Nach der Disssoziation der Kügelchen mit der Zellablösungslösung resuspendieren Sie die Vorläuferzellen bei etwa 5 x 10⁶ Zellen/ml in Gefriermedium wie 10 % DMSO oder Stem-cellbanker. Bei Bedarf in warmen ENC-Medien mit 5 μM Y-27632 ROCK-Inhibitor auftauen. Plattenzellen im gewünschten Plattenformat. Ersetzen Sie das Medium nach einigen Stunden durch eine frische ENC.
7. Geben Sie die Zellen vorsichtig in die mit PO/FN/Laminin beschichteten Vertiefungen. Vermeiden Sie, dass Blasen unter der Zellsuspension eingeschlossen werden, um die Anhaftung der Zellen an die PO/FN/Laminin-Beschichtung zu verhindern, insbesondere bei der Verwendung von Platten mit kleinerer Well-Größe, wie z. B. 384-Well-Platten. Dies könnte zum Zelltod führen.
8. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit ENC-Medium (200 μl pro cm² Well-Oberfläche) bis zum Tag 30-40, danach reduzieren Sie die Fütterungshäufigkeit (auf ein- oder zweimal pro Woche), verdoppeln Sie jedoch das Fütterungsvolumen (auf 400 μl Medium pro cm² Well-Oberfläche).
   HINWEIS: Dies ist wichtig, da übermäßiges Entfernen und Hinzufügen von Medien die Ablösung der neuronalen Kultur von der Oberfläche der Vertiefungen erleichtern kann. Um eine Ablösung prospektiv zu verhindern, insbesondere bei längerfristigen Kulturen, ergänzen Sie ENC einmal pro Woche mit FN (2 μg/ml) und Laminin (2 μg/ml).

Ergebnisse

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Ableitung der enterischen Neuralleiste und enterischer Neuronen aus hPSCs unter Verwendung chemisch definierter Kulturbedingungen (Abbildung 1A-B). Die Erzeugung hochwertiger Neuronen hängt von einem effizienten Induktionsschritt der enterischen Neuralleiste ab. Dies kann visuell beurteilt werden, indem die Morphologie der frei schwebenden Kugeln überprüft wird, die mit glatten Oberflächen mit einer Größe von etwa 0,1 - 0,4 mm rund aussehen sollten, wie in Abbildung 1C zu sehen ist. Diese Sphäroide sollten auch den Neuralleistenmarker SRY-Box Transkriptionsfaktor 10 (SOX10)^17,18 exprimieren, wie in Abbildung 1D zu sehen ist. Während der Induktionsphase der enterischen Neuronen können Neuriten bereits am 25. bis 30. Tag sichtbar werden (Abbildung 1E). Dies kann jedoch bei Differenzierungen mit geringerer Effizienz verzögert werden, da unerwünschte mesenchymale Zellkontaminationen eingedämmt werden. Das menschliche enterische Nervensystem ist eine Ansammlung verschiedener Neuronen, die unterschiedliche Neurotransmitter exprimieren. Diese Heterogenität wird in dem bereitgestellten In-vitro-Protokoll rekapituliert, und die Expression von Schlüsselmarkern kann durch Zellfärbemethoden wie Immunfluoreszenzbildgebung und Durchflusszytometrie gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen 13,14,19,20,21 (Abbildung 1F,G) beurteilt werden.

Abbildung 1: Ableitung von humanen ENC-Zellen und enterischen Neuronen-Subtypen aus hPSCs. (A) Induktion der enterischen Neuralleiste (ENC) aus hPSC. Protokoll (Tage 0-12) mit Medienzusammensetzungen für die Gewinnung von ENC-Zellen aus hPSCs. (B) ENC-Sphäroidbildung und enterische Neuroneninduktion aus ENC. Protokoll (Tage 12-15), das die Zusammensetzung des Mediums für die ENC-Sphäroidbildung zeigt. Anschließend werden enterische Neuronen erzeugt und durch Behandlung mit einem Medium, das GDNF und AA enthält, gereift. (C) Repräsentative Phasenkontrastbilder von differenzierenden hPSCs zu verschiedenen Zeitpunkten des Protokolls. Maßstabsbalken: 1000 μM. (D) SOX10::GFP exprimiert H9 iPSC-abgeleitete ENC-Sphäroide an Tag 14. Maßstabsbalken: 1000 μm. (E) Phasenkontraktionsbild von Neuronen am Tag 33. Maßstabsbalken: 400 μm. (F-G) Immunfluoreszenzbildgebung (F) und Durchflusszytometrie (G) von Neurotransmittermarkern in Neuronen am Tag 40. Maßstab: 50 μm. Abkürzungen: BMP4 = rekombinantes humanes BMP4-Protein; RA = Retinsäure; FGF2 = rekombinante humane FGF basisch; GDNF = rekombinanter neurotropher Faktor aus humanen Gliazelllinien; AA = Ascorbinsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine robuste in vitro-Methode, um enterische Neuronen aus hPSCs innerhalb von 30-40 Tagen (Abbildung 1E) und enterische Gliazellen, die das saure Gliaprotein, GFAP und SOX10 exprimieren, in älteren Kulturen zu erhalten (> Tag 55)13,14,19,22. Diese Neuronen und Gliazellen werden durch schrittweise Differenzierung von hPSCs in vagale und enterische Neuralleistenzellen induziert, gefolgt von enterischen Neuronen und Glia-Vorläuferzellen ^13,14. Die Neuralleistenzellen exprimieren die Neuralleistenmarker, den Transkriptionsfaktor AP-2 alpha und beta, TFAP2A bzw. TFAP2B²¹. Wir haben bereits gezeigt, dass CD49 als Marker verwendet werden kann, um die Effizienz von hPSC-abgeleiteten Neuralleistenzellen anzuzeigen¹⁴. Die Effizienz und der Erfolg dieser Methode hängen von einer Kombination von Faktoren ab. Zunächst ist es wichtig, alle Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen. Die Untersuchung von hPSC-Kulturen auf Mykoplasmenkontamination ist wichtig, da sie das Stammzellwachstum beeinträchtigen können und visuell nicht nachweisbar sind. Zweitens verringert die Verwendung von gleichmäßig und ordnungsgemäß beschichteten Platten die Wahrscheinlichkeit eines fleckigen Wachstums der hPSC-Kultur und der Ablösung von NC-Kulturen und älteren Neuronen von der Oberfläche der Wells. Drittens ist es für eine hohe Effizienz bei der Differenzierung unerlässlich, mit pluripotenten und völlig undifferenzierten hPSC-Zellen zu beginnen. hPS-Kolonien sollten an den Koloniegrenzen nur minimale differenzierende Zellen aufweisen. hPSCs sollten zur Differenzierung passageiert oder plattiert werden, wenn die Kolonien groß sind oder das Zentrum der Kolonie beginnt, sich zu verdicken/dunkler zu färben, wie durch ein Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Unerwünschte differenzierte Zellen (in der Regel mesenchymale Zellen) verringern nicht nur die Gesamteffizienz der Differenzierung, sondern können auch zu einer Ablösung von Neuronen von der Oberfläche des Brunnens führen, wenn die Kulturen älter werden. Es wird daher empfohlen, die ENC-Kulturen in den ersten 15 Tagen sorgfältig zu überwachen. Unter effizienten Differenzierungsbedingungen erscheinen dunkle Scheiben auf der Oberfläche der Kultur ~Tag 6, was auf eine effiziente Sphäroidbildung an den Tagen 12-15 hinweist. Darüber hinaus sollten frei schwebende Kugeln in der Sphäroidphase (Tag 12-15) glatte Oberflächen aufweisen (Abbildung 1D). Die Beibehaltung der 3D-Sphäroidphase an den Tagen 12-15 ist im Allgemeinen ausreichend, um die Reinheit der ENCs für die nachgelagerte Differenzierung der Kulturen in ENS-Linien zu verbessern. Für Studien, die frühe und reine ENC-Vorläuferzellpopulationen erfordern, wird jedoch FACS mit CD49D empfohlen. CD49D ist ein spezifischer Oberflächenmarker für SOX10:hPSC-abgeleitete NC-Linien und wurde erfolgreich in Zelllinien^{eingesetzt 13,14}. Weitere Informationen zur Isolierung von CD49D+-Zellen mittels FACS und Empfehlungen zu Gating-Strategien finden Sie in der Arbeit von Barber et al., Abbildung 2D, Kasten 1 und ergänzende Abbildung 6¹⁴. Viertens, um die Effizienz zu maximieren, sollte die Differenzierung beginnen, wenn hPSC-Kulturen monoschichtig und ~80% konfluent sind. Das bedeutet, dass wir an Tag 2 eine vollständig konfluente Kultur haben müssen. Eine geringere Konfluenz wirkt sich negativ auf die Effizienz aus, und sehr dichte Kulturen neigen dazu, eine höhere Zelltodrate zu haben und können möglicherweise zur Entstehung unerwünschter differenzierter Zellen führen.

Die erneute Beschichtung der Zellen an Tag 15 ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll. Dies ist der letzte Zelltransferschritt für eine monoschichtige neuronale Kultur, daher sollte das Plattenlayout entsprechend den geplanten Assays gewählt werden. Die Anzahl der Zellen, die in jede Vertiefung übertragen werden, kann die neuronale Vielfalt und ältere Neuronen, die an der Oberfläche der Vertiefungen haften, erheblich beeinflussen. Im Allgemeinen ist eine Zelldichte im Bereich von 250.000 bis 350.000 Zellen pro^cm2 (etwa 75.000 bis 100.000 Zellen pro Vertiefung einer 96-Well-Platte oder 500.000 bis 700.000 pro Vertiefung einer 24-Well-Platte) wünschenswert. Ab dem 30. bis 40. Tag kann die Zugabe von Fibronektin und Laminin zum Fütterungsmedium (nicht mehr als einmal pro Woche) in Betracht gezogen werden, um die Ablösung von Neuronen zu verhindern, insbesondere bei Zellen, die für längere Neuronenkulturen geplant sind. Zu diesem Zeitpunkt wird empfohlen, die Fütterungshäufigkeit auf einmal alle 5-7 Tage zu reduzieren und etwas Medium in jeder Vertiefung zu belassen, bevor Sie zusätzliches frisches Medium hinzufügen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die neuronalen Projektionen unnötig physisch belastet werden. Unter Berücksichtigung der Verdampfung des Mediums (insbesondere bei Vertiefungen am Rand der Platte) kann man 75 μl entfernen und 100 μl frisches Medium in jede Vertiefung geben. Erfahrungsgemäß neigen Kulturen, die auf Polymer-Deckglas-Boden-Speicherfolien gezüchtet wurden, dazu, länger an der Oberfläche des Bohrlochs zu leben und zu bleiben. Daher wird empfohlen, die Polymer-Deckglas-Boden-Speicherfolien für Experimente in Betracht zu ziehen, die sehr alte neuronale Kulturen, wie z. B. Co-Kulturen mit anderen Zelltypen, erfordern. Obwohl luftgetrocknete PO/FN/Laminin-beschichtete Platten immer noch eine effiziente Differenzierung ermöglichen können, wurde dies für die Zwecke dieses Protokolls nicht systematisch getestet. Daher wird die Verwendung von frisch beschichteten Platten empfohlen.

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll von Barber et al.¹⁴. Im Vergleich zu älteren ENC-Induktionsmethoden, die Medien verwenden, die Serumersatzfaktoren (z. B. KSR)^13,14 enthalten, sind die aktuellen Protokollmedienbedingungen chemisch definiert. Dies ist vorteilhaft für konsistentere Differenzierungen und ermöglicht genauere Entwicklungsstudien durch Manipulation der Kulturbedingungen. Dieses robuste Protokoll erzeugt reproduzierbar Kulturen von enterischen Neuronen aus unabhängigen induzierten und embryonalen Stammzelllinien, die getestet wurden, wie z. B. H9, UCSF4 und WTC11. Ein leistungsfähiger Aspekt des vorgestellten Protokolls ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von neuronalen ENS-Subtypen zu erzeugen, die denen des menschlichen ENS ähneln. So kann beispielsweise die Expression spezifischer Marker für verschiedene neurochemische ENS-Identitäten durch Durchflusszytometrie und Fluoreszenzbildgebung überprüft werden (Abbildung 1F,G). Der typische Bereich von hPSC-abgeleiteten enterischen neuronalen Populationen, die positiv für Stickstoffmonoxid-Synthase 1 (NOS1) sind, liegt bei 5 % bis 20 %; Cholin-O-Acetyltransferase (CHAT) beträgt 40%-60%; Gamma-Aminobuttersäure (GABA) beträgt 15%-30% und Serotonin (5-HT) 15%-30%. Das Ausmaß, in dem die strukturelle und funktionelle Konnektivität zwischen diesen Subtypen in vitro die zellulären Netzwerke in vivo genau modelliert, erfordert jedoch weitere Studien. Darüber hinaus würden Einzelzellanalysen zur Erweiterung des transkriptionellen Profilings einzelner Subtypen nicht nur dazu beitragen, die in vivo und in vitro zellulären Identitäten besser vergleichen zu können, sondern auch Entwicklungs- und molekulare Studien sowie zukünftige Protokolloptimierungen zur Anreicherung spezifischer Subtypen für die Wirkstoffforschung und regenerative Medizin von Vorteil sein.

Obwohl die Kulturen unterschiedliche neuronale und in älteren Kulturen Gliazellen enthalten, erzeugt dieses Protokoll nicht die anderen Zelltypen, die natürlicherweise in der in vivo-Nische des ENS vorkommen, wie Muskelzellen, Epithelzellen und Immunzellen. Die Untersuchung der ENS-Interaktion mit diesen Zelltypen im Kontext von Gesundheit und Krankheit erfordert Investitionen in die Optimierung von Co-Kultur- und Darmorganoid-Systemen. Insgesamt wird hier eine leistungsfähige Methode zur Generierung verschiedener Subtypen des ENS aus hPSCs in vitro beschrieben. Die skalierbaren Kulturen eignen sich für Entwicklungsstudien des menschlichen ENS, toxikologische Tests und Krankheitsmodellierungsexperimente, die auf die Entwicklung von Arzneimitteltherapien und die Bereitstellung transplantierbarer Zellen zur Behandlung von enterischen Neuropathien abzielen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A5960
B27 Supplement (serumfrei, abzüglich Vitamin A)	Gibco	12587-010
Basalmembranmatrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D systems	314-BP
Zellkulturzentrifuge	Eppendorf, Modell-Nr. 5810R	02262501
Zellablösung, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Konische Röhrchen	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differenzierungsbasismedium, Essential 6	Leben Technologies	A1516401
DMEM/F-12 ohne Glutamin	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-freies hPSC-Erhaltungsmedium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R& D systems	233-FB/CF
Fibronektin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hämozytometer	Hausser Scientific	1475
Humane pluripotente Stammzellen, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Inkubator mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit, Temperatur und CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverses Mikroskop	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar-Flow-Haube	Thermo Fisher Scientific	1300 Serie Klasse II, Typ A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-Glutamin-Ergänzungsmittel, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell-Platten, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca- und Mg-frei)	Life Technologies	10010023
Pipettenfüller	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipettenspitzen	USA wissenschaftlich	1111-2830
Pipetten	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
Polymer-Deckglas Boden-Speicherfolien,	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R& D systems	1614
Trypanblau gebeizt, 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Extrem niedrige Befestigungsplatten	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 Dihydrochlorid	R& D-Systeme	1254