Methodenartikel

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

DOI:

10.3791/66169

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5. Januar 2024

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomolekulare Kondensate, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden, gelten als entscheidend für die zelluläre Organisation und eine zunehmende Anzahl zellulärer Funktionen. Die Charakterisierung von LLPS in lebenden Zellen ist auch deshalb wichtig, weil aberrante Kondensation mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde, darunter Krebs und neurodegenerative Erkrankungen. LLPS wird oft durch selektive, transiente und multivalente Wechselwirkungen zwischen intrinsisch ungeordneten Proteinen angetrieben. Von großem Interesse ist die Interaktionsdynamik von Proteinen, die an LLPS beteiligt sind, die durch Messungen ihrer Bindungsverweilzeit (RT), d.h. der Zeit, die sie in Kondensaten gebunden verbringen, gut zusammengefasst wird. Hier stellen wir eine Methode vor, die auf der Einzelmolekül-Bildgebung lebender Zellen basiert und es uns ermöglicht, die mittlere RT eines bestimmten Proteins in Kondensaten zu messen. Wir visualisieren gleichzeitig einzelne Proteinmoleküle und die Kondensate, mit denen sie assoziiert sind, verwenden Single-Particle Tracking (SPT), um Einzelmolekül-Trajektorien aufzuzeichnen, und passen die Trajektorien dann an ein Modell der Protein-Tröpfchen-Bindung an, um die mittlere RT des Proteins zu extrahieren. Schließlich zeigen wir repräsentative Ergebnisse, bei denen diese Einzelmolekül-Bildgebungsmethode angewendet wurde, um die mittleren RTs eines Proteins an seinen LLPS-Kondensaten zu vergleichen, wenn es mit einer oligomerisierenden Domäne fusioniert und nicht fusioniert ist. Dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf die Messung der Interaktionsdynamik jedes Proteins, das an LLPS beteiligt ist.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine wachsende Zahl von Arbeiten deutet darauf hin, dass biomolekulare Kondensate eine wichtige Rolle bei der zellulären Organisation und zahlreichen zellulären Funktionen spielen, z. B. Transkriptionsregulation 1,2,3,4,5, DNA-Schadensreparatur 6,7,8, Chromatinorganisation 9,10,11,12, X-Chromosom Inaktivierung 13,14,15 und intrazelluläre Signalübertragung 16,17,18. Darüber hinaus ist die Dysregulation biomolekularer Kondensate an vielen Krankheiten beteiligt, darunter Krebs 19,20,21 und neurodegenerative Erkrankungen 22,23,24,25,26. Die Kondensatbildung wird häufig durch transiente, selektive und multivalente Protein-Protein-, Protein-Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Nukleinsäure-Wechselwirkungen angetrieben27. Unter bestimmten Bedingungen können diese Wechselwirkungen zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) führen, einem Dichteübergang, der bestimmte Biomoleküle lokal in membranlosen Tröpfchen anreichert. Solche multivalenten Wechselwirkungen werden oft durch die intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) von Proteinen vermittelt 1,28,29. Die biophysikalische Charakterisierung dieser Wechselwirkungen auf molekularer Ebene ist entscheidend für unser Verständnis zahlreicher gesunder und abweichender zellulärer Funktionen, da Kondensate in ihnen allgegenwärtig sind. Obwohl Techniken, die auf der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie basieren, z. B. die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching (FRAP)30,31,32, weit verbreitet sind, um qualitativ zu zeigen, dass der molekulare Austausch zwischen Kondensaten und der umgebenden zellulären Umgebung dynamisch ist, ist die Quantifizierung der Interaktionsdynamik spezifischer Biomoleküle innerhalb von Kondensaten mit konventioneller konfokaler Mikroskopie oder Einzelmolekülen im Allgemeinen nicht möglich Mikroskopie ohne spezielle Datenanalysemethoden. Die in diesem Protokoll beschriebene Einzelpartikel-Tracking-Technik (SPT) basiert auf der Lebendzell-Einzelmolekülmikroskopie33 und bietet ein einzigartig leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung der Wechselwirkungsdynamik zwischen bestimmten Proteinen in Kondensaten. Die Auslesung von SPT für eine solche Messung ist die mittlere Verweilzeit eines Proteins von Interesse in den Kondensaten.

Das Protokoll kann in zwei Teile unterteilt werden - Datenerfassung und Datenanalyse. Der erste Schritt der bildgebenden Datenerfassung besteht darin, in Zellen ein Protein von Interesse zu exprimieren, das mit einem HaloTag34 fusioniert ist. Dies ermöglicht die Markierung des interessierenden Proteins mit zwei Fluorophoren, wobei ein Großteil der Proteinmoleküle mit einem nicht photoaktivierbaren Fluorophor (z. B. JFX549 Halo-Ligand35) und ein kleiner Teil von ihnen mit einem spektral unterschiedlichen, photoaktivierbaren Fluorophor (z. B. PA-JF646 Halo-Ligand36) markiert werden soll). Dies ermöglicht die gleichzeitige Erfassung aller Kondensatstellen in der Zelle und die Erfassung von Einzelmolekülfilmen des interessierenden Proteins, das an die Kondensate bindet und löst. In der Zwischenzeit wird derselbe Zelltyp modifiziert, um Halo-markiertes H2B stabil zu exprimieren, ein Histon, das auf Chromatin weitgehend unbeweglich ist. Die Zellen werden dann mit dem PA-JF646-Halo-Liganden gefärbt, um eine Einzelmolekül-Bildgebung von H2B zu ermöglichen. Wie im Folgenden ausführlich diskutiert wird, berücksichtigt dieses Experiment den Beitrag des Photobleaching, um eine präzise Quantifizierung der Interaktionsdynamik des interessierenden Proteins zu ermöglichen. Zellen für bildgebende Experimente müssen dann auf sauberen Deckgläsern kultiviert, mit HaloTag-Liganden gefärbt und in einer Bildgebungskammer für lebende Zellen zusammengesetzt werden. Von dort aus wird die Probe unter stark geneigter und laminierter optischer Blattbeleuchtung (HILO) auf einem TIRF-Mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) abgebildet, das Zweikanal-Bildgebung und Einzelmoleküldetektion ermöglicht. Die Emission wird dann auf zwei Kameras aufgeteilt, eine verfolgt die Kondensatpositionen und eine verfolgt einzelne Moleküle. Die Akquisition wird mit einer langen Integrationszeit (in der Größenordnung von Hunderten von ms) durchgeführt, um frei diffundierende Proteine zu verwischen und nur Proteine einzufangen, die aufgrund der Bindung an stabile Strukturen in der Zelle weniger mobil sind37.

Der erste Schritt der Datenanalyse besteht darin, einen etablierten Einzelpartikel-Tracking-Algorithmus (SPT)38,39 zu verwenden, um einzelne Proteinmoleküle in jedem Bild des Films zu lokalisieren und die Lokalisierungen zu einer Trajektorie für jedes Molekül über seine nachweisbare Lebensdauer zusammenzusetzen. Die Trajektorien werden dann in diejenigen sortiert, die Moleküle innerhalb und Moleküle außerhalb der Kondensate repräsentieren, indem die Lokalisationen der Moleküle während ihrer Trajektorien mit den Lokalisationen aller Kondensate zu den entsprechenden Zeitenverglichen werden 1.

Als nächstes wird eine Überlebenskurve (1 - CDF) unter Verwendung der Längen aller In-Kondensat-Trajektorien erstellt. Die scheinbare mittlere Verweilzeit der Moleküle wird dann extrahiert, indem die Überlebenskurve an das folgende Zweikomponenten-Exponentialmodell der Proteinbindung angepasst wird:

figure-introduction-1,

mit A als Anteil der unspezifisch gebundenen Moleküle und mit kobs,ns und kobs,s als den beobachteten Dissoziationsraten der unspezifisch gebundenen bzw. spezifisch gebundenen Moleküle. Von hier an werden nur noch kobs,s berücksichtigt. Die Dynamik sowohl der Proteindissoziation, ktrue,s, als auch der Photobleichung des Fluorophors, kpb, trägt zu kobs,s als

figure-introduction-2;

Um die Effekte der Proteindissoziation zu isolieren, wird daher die spezifische Dissoziationsrate von H2B-Halo in der zuvor erwähnten Zelllinie gemessen.

figure-introduction-3

H2B ist ein Protein, das stabil in das Chromatin integriert ist und auf der Zeitskala einer Einzelmolekül-Filmaufnahme eine minimale Dissoziation erfährt37. Seine spezifische Dissoziationsrate ist dann gleich der Photobleichrate des PA-JF646-Halo-Liganden oder

figure-introduction-4.

Die mittlere Verweilzeit des interessierenden Proteins im Kondensat, figure-introduction-5, ist dann

figure-introduction-6.

Repräsentative Ergebnisse von Irgen-Gioro et al.40 werden gezeigt, wobei dieses Protokoll angewendet wurde, um zu zeigen, dass die Fusion einer Oligomerisierungsdomäne mit IDR zu längeren Verweilzeiten der IDR in ihren Kondensaten führt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die hinzugefügte Oligomerisierungsdomäne die homotypischen Wechselwirkungen der IDR stabilisiert, die LLPS antreiben. Im Prinzip kann die gleiche Methode mit leicht modifizierten Protokollen angewendet werden, um die homotypischen oder heterotypischen Wechselwirkungen jedes Proteins zu charakterisieren, das an der Bildung von Kondensaten jeglicher Art beteiligt ist.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Markierung von Proteinen in Zellen

  1. Exprimieren Sie das Protein von Interesse, das mit HaloTag fusioniert ist, in der gewünschten Zelllinie.
  2. Stabiles exprimieren Halo-markiertes H2B im gleichen Zelltyp wie in 1.1 unter Verwendung von Transposons oder viraler Transduktion.

2. Vorbereitung von Deckgläsern

  1. Reinigen Sie vor der Verwendung von Deckgläsern für die Zellkultur die Deckgläser, um autofluoreszierende Verunreinigungen zu entfernen.
    1. Montieren Sie die Deckgläser #1,5 mit einem Durchmesser von 25 mm auf einem Keramikfärbegestell und legen Sie sie in einen Polypropylenbehälter.
    2. Deckgläser vollständig in eine 1 M Lösung aus KOH tauchen und 1 h beschallen.
    3. Deckgläser dreimal mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) abspülen.
    4. Deckgläser vollständig in 100% Ethanol tauchen und 1 h beschallen.
    5. Deckgläser vollständig in 20%iges Ethanol mit ddH2O verdünnt tauchen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.

3. Vorbereitung der Zellen für die Mikroskopie

HINWEIS: Führen Sie die Schritte aus diesem Abschnitt in einer Biosicherheitswerkbank durch, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern.

  1. Plattenzellen auf gereinigten Deckgläsern. Führen Sie 2 Tage vor der Bildgebung durch, wenn das Halo-markierte Protein vorübergehend exprimiert werden soll. Führen Sie 1 Tag vor der Bildgebung durch, wenn das Halo-markierte Protein stabil oder endogen exprimiert wird.
    1. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um Deckgläser in eine 6-Well-Platte (ein Deckglas/Well pro Zellprobe) zu legen und das restliche Ethanol verdampfen zu lassen.
    2. Plattieren Sie jede Vertiefung mit einer geeigneten Anzahl von Zellen, um zum Zeitpunkt der Bildgebung eine Konfluenz von 70 % zu erreichen. Plattieren Sie ein zusätzliches Well mit Zellen, die H2B-Halo mit der gleichen Zielkonfluenz stabil exprimieren.
    3. Befolgen Sie diesen Schritt nur, wenn Sie das Halo-markierte Protein von Interesse vorübergehend exprimieren. Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Transfizieren Sie dann die Zellen mit dem Plasmid, das für das markierte Protein von Interesse kodiert, unter Verwendung geeigneter Transfektionsreagenzien und gemäß den Richtlinien des Herstellers.
    4. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2.
  2. Färben Sie die Zellen, die das Halo-markierte Protein von Interesse exprimieren, sowohl mit einem nicht photoaktivierbaren Halo-Liganden (z. B. JFX549) als auch mit einem photoaktivierbaren Halo-Liganden (z. B. PA-JF646). Färbezellen, die H2B-Halo exprimieren, nur mit dem photoaktivierbaren Halo-Liganden.
    HINWEIS: Die hier aufgeführten Konzentrationen von Halo-Liganden sollten als Ausgangspunkt verwendet werden; Die optimale Konzentration hängt vom Expressionsniveau und der lokalen Konzentration des interessierenden Proteins im Kondensat ab.
    1. Für jede Zellprobe, die das interessierende Halo-markierte Protein exprimiert, werden 100 nM JFX549 Halo-Ligand35 und 20 nM PA-JF646 Halo-Ligand36 in 500 μl geeignetem Zellmedium verdünnt. Für jede Probe, die H2B-Halo exprimiert, verdünnen Sie nur 20 nM PA-JF646 Halo-Liganden in 500 μl geeignetem Zellmedium.
    2. Aspirieren Sie für jede Vertiefung vorhandene Medien, fügen Sie 2 ml 1x PBS hinzu, aspirieren Sie dann PBS (dies wird für den Rest des Protokolls als "Spülung" bezeichnet) und ersetzen Sie es durch Medien, die die entsprechenden Halo-Liganden enthalten.
    3. 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    4. Viermal mit PBS spülen und durch frische Medien ersetzen, die keine Halo-Liganden enthalten.
    5. 15 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    6. Die Schritte 3.2.4 und 3.2.5 dreimal wiederholen (insgesamt vier Spül-Inkubationszyklen).
    7. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um das Deckglas mit den Zellen in eine Zellkultur-Deckglaskammer zu übertragen, die mit dem Mikroskoptisch kompatibel ist.
    8. Geben Sie phenolrotfreie Medien in die Kammer und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Inkubieren Sie die Proben, die nicht sofort bei 37 °C und 5 % CO2 abgebildet werden, bis sie benötigt werden.

4. Einzelmolekül-Bildgebung

HINWEIS: Unabhängige Experimente, die die Verweilzeiten sowohl von H2B als auch des interessierenden Proteins messen, sollten über mehrere (≥3) Tage durchgeführt werden, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen. Richten Sie die beiden Kameras vor der Abbildung von Zellproben am Mikroskop mit 0,1 μm gefärbten Mikrokugeln (Table of Materials) oder einem ähnlichen Kalibrierungsstandard aus.

  1. Bereiten Sie das Mikroskop vor.
    1. Schalten Sie das Mikroskop und den Computer ein, der das Mikroskop steuert.
    2. Schalten Sie die Inkubationskomponenten für lebende Zellen (Heizung und CO2) am Mikroskop ein und stellen Sie es auf 37 °C und 5 % CO2 ein. Lassen Sie das System ausgleichen.
    3. Geben Sie einen Tropfen des entsprechenden Öls auf ein 100x TIRF-Ölimmersionsobjektiv am Mikroskop und laden Sie die Zellprobe auf den Mikroskoptisch.
  2. Identifizieren Sie eine Zelle, die abgebildet werden soll.
    1. Bilden Sie die Zellprobe unter Hellfeldbeleuchtung ab und passen Sie die z-Position an, bis die Zellen scharf sind.
    2. Identifizieren Sie eine Zelle, die morphologische Merkmale gesunder Zellen aufweist.
    3. Schneiden Sie das Sichtfeld (FOV) so zu, dass es nur den Zielzellkern erfasst.
    4. Verwenden Sie die Laserbeleuchtung und stellen Sie den TIRF-Winkel ein, bis die HILO-Beleuchtung41 mit optimalem Signal-Rausch-Verhältnis der einzelnen Moleküle erreicht ist.
  3. Bild H2B-Halo in lebenden Zellen.
    HINWEIS: Die in diesem Abschnitt verwendeten Laserleistungen sind spezifisch für dieses Experiment und als Beispiel enthalten. Geeignete Laserleistungen sollten nach den in der Diskussion aufgeführten Kriterien ausgewählt werden.
    1. Richten Sie eine Akquisitionskonfiguration wie folgt ein. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 500 ms ein. Während jeder 500-ms-Exposition werden PA-JF646-markierte H2B-Halo-Moleküle mit einem 9,1 mW, 640 nm-Strahl angeregt. Während der Totzeit zwischen den Bildern (158,01 μs auf dem hier verwendeten Bildgebungssystem) photoaktivieren Sie die Moleküle mit einem 111 μW, 405 nm Strahl.
    2. Nehmen Sie mit diesen Einstellungen 2000 Frames kontinuierlich auf. Erhöhen Sie die Leistung des 405-nm-Strahls im Laufe der Aufnahme allmählich, wenn die Anzahl der photoaktivierten Moleküle nicht mehr ausreicht.
  4. Stellen Sie sich das Halo-markierte Protein von Interesse in lebenden Zellen vor.
    1. Verwenden Sie einen dichroitischen Langpassspiegel, um die Emissionswellenlängen auf zwei Kameras aufzuteilen, eine zum Nachweis von PA-JF646 und die andere zum Nachweis von JFX549. Verwenden Sie geeignete Emissionsfilter vor den Kameras.
    2. Verwenden Sie die gleiche Erfassungskonfiguration, die in 4.3.1 beschrieben ist, mit der folgenden Änderung. Fügen Sie einen zusätzlichen JFX549-Kanal hinzu, um die Positionen der Halo-markierten Proteinkondensate im Laufe der Zeit zu verfolgen. Erfassen Sie alle 10 s ein Bild (500 ms, 2,1 mW, 561 nm Anregung) im JFX549-Kanal, während die Erfassung des PA-JF646-Kanals beibehalten wird. Dies führt zu einem Durchbluten des PA-JF646-Kanals, das bei der Datenanalyse nach der Erfassung berücksichtigt wird.
    3. Nehmen Sie mit diesen Einstellungen 2000 Frames kontinuierlich auf. Erhöhen Sie die Leistung des 405-nm-Strahls im Laufe der Aufnahme allmählich, wenn die Anzahl der photoaktivierten Moleküle nicht mehr ausreicht.

5. Analyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten

HINWEIS: Die in Abschnitt 5 verwendeten Parameter sind spezifisch für dieses Experiment und als Beispiel enthalten. Geeignete Parameter sollten nach den in der Diskussion aufgeführten Kriterien ausgewählt werden.

  1. Bereiten Sie Bildrohdaten für die Verarbeitung vor.
    1. Konvertieren Sie für die Daten des interessierenden Proteins jeden Kanal aus der Rohbilddatendatei mit ImageJ oder einer ähnlichen Bildverarbeitungssoftware in eine unabhängige .tif Datei. Konvertieren Sie für die Daten von H2B den einzelnen Kanal aus der Rohbilddatendatei auf die gleiche Weise in eine .tif Datei.
      HINWEIS: Abhängig von der verwendeten Erfassungssoftware kann es zu leeren Bildern im Kondensatfilm kommen, da nur alle 10 s ein Kondensat-Tracking-Bild aufgenommen wird. Die leeren Rahmen sollten mit dem neuesten Kondensatrahmen gefüllt werden (einige Erfassungssoftware erledigt dies automatisch). Wenn während dieser Kondensatverfolgungsrahmen ein signifikantes Durchbluten vom Kondensatkanal (JFX549) in den Einzelmolekülkanal (PA-JF646) auftritt, sollten die entsprechenden Einzelmolekülrahmen durch den neuesten Einzelmolekülrahmen ersetzt werden.
    2. Wenn es Frames gibt, die aus den oben genannten Gründen in einem der beiden Filme ersetzt werden müssen, ersetzen Sie sie durch den neuesten Frame aus diesem Film, indem Sie (falls erforderlich) pretracking_comb.txt, ein ImageJ-Makro, das in Chong et al.1 verfügbar ist, ändern und ausführen und den Anweisungen folgen.
  2. Erzeugung von Einzelpartikeltrajektorien unter Verwendung einer SPT-Software, z. B. SLIMfast39, einer GUI-Implementierung des MTT-Algorithmus38 , die in Teves et al.42 verfügbar ist.
    1. Laden Sie die Datei aus 5.1.2 mit dem Einzelmolekülfilm in SLIMfast, indem Sie auf Load > Imagestack klicken.
    2. Stellen Sie die Parameter ein (Lokalisierungsfehlerrate: 10-6; Deflationsschleifen: 3) für die Lokalisierung durch Klicken auf OPT > Blatt: Lokalisierung.
    3. Stellen Sie die Parameter ein (Spitzenemission: 664 nm; Verzögerungszeit: 500 ms) für die Erfassung durch Klicken auf OPT > Blatt: Erfassung.
    4. Visualisieren Sie die Lokalisierungen aller Moleküle in einem einzigen Frame, um sicherzustellen, dass die gewählten Parameter angemessen sind (TEST LOC). Ändern Sie die Parameter in den Schritten 5.2.2 und 5.2.3 und wiederholen Sie diesen Schritt, falls dies nicht zulässig ist.
    5. Generieren Sie eine Datei, die die Lokalisierungen aller Moleküle in jedem Frame enthält (LOC ALL).
    6. Laden Sie die Datei von 5.2.5 in SLIMfast, indem Sie > Partikeldaten laden > SLIMfast klicken.
    7. Stellen Sie die Parameter ein (maximal erwarteter Diffusionskoeffizient: 0,1 μm2/s; Maximale Anzahl von Wettbewerbern: 5) für die Trajektoriengenerierung durch Klicken auf OPT > Sheet: Tracking.
    8. Generieren Sie eine Datei mit den Trajektorien aller Moleküle (GEN TRAJ).
  3. Filtern Sie die Trajektorien heraus, die kürzer als tmin, 2,5 s sind, mit evalSPT39, verfügbar in Drosopoulos et al.43, um Tracking-Fehler zu berücksichtigen, die zu künstlich kurzen Trajektorien führen.
    1. Laden Sie die Datei von 5.2.8 in evalSPT (+ > Datei von 5.2.8 > OK).
    2. Stellen Sie die Parameter ein (min.: 5 Bilder; max: maximale Trajektorienlänge für Datei aus 5.2.8), um die Trajektorien herauszufiltern, die kürzer als 2,5 s sind.
    3. Generieren Sie eine Datei mit allen gefilterten Trajektorien (EXPORT DATA).
  4. Befolgen Sie diesen Schritt nur für die Trajektorien des interessierenden Proteins. Sortieren Sie die Trajektorien in die in den Kondensaten und aus den Kondensaten heraus und extrahieren Sie dann die mittlere Verweilzeit im Kondensat.
    HINWEIS: Alle Codes für diesen Abschnitt sind in Chong et al.1 verfügbar.
    1. Legen Sie einen Schwellenwert für alle Frames des Films fest, die im JFX549-Kanal erfasst wurden, um einen Zeitrafferfilm zu erzeugen, der mit der zeitentwickelnden Binärmaske gefüllt ist, die Kondensatpositionen hervorhebt, indem Sie die ImageJ-Makro-, Nukleus- und Cluster-mask_v2.txt ausführen und den Eingabeaufforderungen folgen.
    2. Formatieren Sie die in 5.3.3 generierten Einzelmolekül-Trajektorien neu. Verwenden Sie das MATLAB-Skript ConvertASCII_SlowTracking_css3.m und passen Sie die Dateinamen, Pfade und Parameter nach Bedarf an. (Parameter: Belichtung, 0,5 s; Auflösung, 0,16 μm/Pixel).
    3. Sortieren Sie Trajektorien basierend auf dem Bruchteil der Lebensdauer, die ein bestimmtes Molekül in einem Kondensat (F) verbringt, indem Sie das MATLAB-Skript categorization_v4.m verwenden und die Dateinamen und Pfade nach Bedarf anpassen.
    4. Fahren Sie nur mit In-Kondensat-Trajektorien fort.
  5. Extrahieren Sie kobs,s und kpb und berechnen Sie die korrigierte mittlere Verweilzeit, figure-protocol-1.
    1. Extrahieren Sie kobs,s aus dem interessierenden Protein im Kondensat mit dem MATLAB-Skript PLOT_ResidenceHist_css.m und passen Sie Dateinamen, Pfade und Parameter nach Bedarf an.
      (Parameter: Belichtung, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 Frames).
    2. Extrahieren Sie kpb aus den H2B-Trajektorien mit dem MATLAB-Skript PLOT_ResidenceHist_css.m und passen Sie Dateinamen, Pfade und Parameter nach Bedarf an.
      (Parameter: Belichtung, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 Frames).
    3. Berechnen Sie die korrigierte mittlere Verweilzeit des interessierenden Proteins, das spezifisch an seine Kondensate gebunden ist, figure-protocol-2als
      figure-protocol-3
      HINWEIS: Es sollten Kontrollen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass unterschiedliche Belichtungszeiten, die lang genug sind, um mobile Partikel zu verwischen, z. B. 300 ms und 800 ms, immer noch zur gleichen mittleren Verweilzeit des interessierenden Proteins führen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir repräsentative Ergebnisse von Irgen-Gioro et al.40, wo wir dieses SPT-Protokoll verwendet haben, um die Interaktionsdynamik zweier Proteine in ihren jeweiligen selbstorganisierten LLPS-Kondensaten zu vergleichen. TAF15 (TATA-Box-Bindungsprotein-assoziierter Faktor 15) enthält einen IDR, der bei Überexpression in menschlichen Zellen einer LLPS unterzogen werden kann. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Fusion von TAF15(IDR) mit FTH1 (Ferritin-Schwerkette 1), das ein Oligomer mit 24 Untereinheiten bildet, zu stabileren homotypischen Protein-Protein-Wechselwirkungen führen würde, die LLPS antreiben. Um diese Hypothese zu testen, exprimierten wir in U2OS-Zellen vorübergehend entweder Halo-TAF15(IDR)- oder TAF15(IDR)-Halo-FTH1-Fusion und führten eine zweifarbige Einzelmolekül-Bildgebung jedes Proteins gemäß dem obigen Protokoll durch. Ein repräsentatives Bild aus einem TAF15(IDR)-Halo-FTH1-Film ist in Abbildung 1A dargestellt. Im PA-JF646-Kanal nachgewiesene Moleküle wurden lokalisiert und diese Lokalisierungen zu Trajektorien zusammengesetzt. Die resultierenden Trajektorien wurden dann zwischen In-Kondensat- und Nicht-Kondensat-Populationen sortiert, indem sie mit einer binären Maske verglichen wurden, die Kondensatpositionen hervorhebt (Abbildung 1B). Während wir nur einen kleinen Bruchteil der Trajektorien für eine gute Sichtbarkeit zeigen, gibt es eine klare Unterscheidung zwischen den Trajektorien von Molekülen, die an die Kondensate gebunden sind, und denen, die außerhalb der Kondensate gebunden sind. Als nächstes wurde eine Überlebenskurve der Trajektorienlängen im Kondensat gegen das Zweikomponenten-Exponentialmodell angepasst (Abbildung 1C). Schließlich wurden die mittleren Verweilzeiten nach der Korrektur für Photobleaching extrahiert und für beide Proteine aufgetragen (Abbildung 1D). Wir fanden heraus, dass die mittlere Verweilzeit von Halo-TAF15(IDR) in seinen LLPS-Kondensaten 10,23 s ± 1,10 s betrug, während die von TAF15(IDR)-Halo-FTH1 64,15 s ± 11,65 s betrug. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Zugabe der oligomerisierenden Domäne zu TAF15(IDR) tatsächlich die Protein-Kondensat-Bindung stabilisiert.

figure-results-1
Abbildung 1: SPT-basierte Methode löst Unterschiede in den Verweilzeiten von Proteinen in ihren Kondensaten auf. Repräsentative Bilder aus einem zweifarbigen Einzelmolekülfilm von TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Die Proteine wurden mit einer Kombination aus einer höheren Konzentration an nicht photoaktivierbarem Farbstoff (100 nM JFX549, gelb) markiert, um die Positionen von Kondensaten zu visualisieren, und einer niedrigeren Konzentration an photoaktivierbarem Farbstoff (20 nM PA-JF646, magenta), um einzelne Proteine sichtbar zu machen, was eine SPT ermöglichte. Für Halo-TAF15(IDR) wurden Filme unter den gleichen Bildgebungsbedingungen und für H2B-Halo einkanalige PA-JF646-Filme aufgenommen. Eine weiße gestrichelte Linie umreißt den Kern. B. Repräsentatives zusammengeführtes Bild, das eine binäre Maske der Kondensatposition (grau) und der Trajektorien (mehrfarbig) überlagert. C. Repräsentative Überlebenskurve von TAF15(IDR)-Halo-FTH1 mit dem Zweikomponenten-Exponentialmodell. D. Die mittlere Verweilzeit von Halo-TAF15 in war signifikant kürzer als die von TAF15(IDR)-Halo-FTH1 in ihren jeweiligen Kondensaten. Der Wert für jedes Protein wurde aus 20 Zellen gemittelt, die in unabhängigen Experimenten über drei Tage hinweg gemessen wurden. Der Fehler wurde als Standardfehler des Mittelwerts propagiert und das Sternchen stellt einen signifikanten Unterschied in der Verweilzeit der beiden Proteine dar (p<0,05, Wilcoxon-Rangsummentest). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Irgen-Gioro et al.40 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier vorgestellte Protokoll ist für Systeme wie die in Irgen-Gioro et al.40 untersuchten konzipiert. Je nach Anwendung können einige Komponenten des Protokolls modifiziert werden, z. B. das Verfahren zur Erzeugung fluoreszenzmarkierter Zelllinien, das fluoreszierende Markierungssystem und die Art des verwendeten Deckglases. Das Halo-Tagging eines Proteins in einer Zelle kann mit zwei Strategien erfolgen, je nachdem, welche für ein bestimmtes Experiment besser geeignet ist. 1) Exogene Expression: Fusion des interessierenden Proteins mit einem HaloTag und Expression der Fusion in einer Zielzelllinie entweder vorübergehend durch Transfektion oder stabil durch Transposons oder virale Transduktion. 2) Genom-Editierung: Klopfen Sie einen HaloTag an den Genort, der für das endogene Protein von Interesse in einer Zielzelllinie kodiert, unter Verwendung von Genom-Editing-Techniken, z. B. CRISPR44. Die Vor- und Nachteile beider werden an anderer Stelle diskutiert45, aber kurz gesagt, die exogene Expressionsstrategie ist weniger zeitaufwändig, erzeugt aber eine Population von Zellen mit einem breiten Spektrum von Expressionsniveaus, die oft nicht-physiologisch sind. Die Genom-Editing-Strategie dauert viel länger, markiert aber endogen exprimierte Proteine von Interesse auf ihrem nativen Expressionsniveau.

Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll nicht ausdrücklich die Verwendung eines HaloTag; vielmehr ist es mit jedem Tag kompatibel, der die gleichzeitige Einzelmolekül- und Ensemblemarkierung desselben Proteins in der Zelle ermöglicht. Somit kann das Protokoll für die Verwendung mit anderen selbstbeschriftenden Tags wie SNAP-tag46 modifiziert werden. Schließlich können vorgereinigte, handelsübliche Glasbodenschalen für die Zellkultur, wie z. B. MatTek-Schalen (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), anstelle von Deckglaskammern verwendet werden, sofern sie mit dem Mikroskopobjektiv und dem Immersionsöl kompatibel sind. Deckgläser können jedoch unmittelbar vor dem Gebrauch gründlicher gereinigt werden und sind daher vorzuziehen.

Während die oben genannten Änderungen am Protokoll optional sind, gibt es experimentelle und analytische Parameter, die optimiert werden müssen, nämlich die Konzentrationen der HaloTag-Liganden, die Laserleistungen, die Lokalisierungs- und Tracking-Parameter und tmin. Die Konzentration des nicht photoaktivierbaren HaloTag-Liganden sollte so gewählt werden, dass das Kondensat dicht genug markiert ist, um die Maskenbildung zu ermöglichen. Die Konzentration des photoaktivierbaren HaloTag-Liganden und die Photoaktivierungslaserleistung sollten so gewählt werden, dass Proteinmoleküle spärlich genug markiert und photoaktiviert werden, um qualitativ hochwertige Einzelpartikeltrajektorien zu erzeugen, da ein Übermaß an Lokalisierungen in jedem Frame zu einer ungenauen Trajektoriengenerierung führt. Bei Experimenten, die in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt wurden, gab es im Allgemeinen weniger als fünf Lokalisierungen pro Frame. Die Anregungslaserleistung sollte niedrig genug gehalten werden, um ein schnelles Photobleichen zu minimieren, aber hoch genug, um einzelne Moleküle präzise zu lokalisieren. Die Einzelmolekül-Lokalisierungs- und Tracking-Parameter sollten in Abhängigkeit von der Dichte der Anregungen und der erwarteten Diffusionsdynamik des interessierenden Proteins angepasst werden. Schließlich sollten die Werte von figure-discussion-1 über einen Bereich von tmin berechnet werden (beginnend bei 0 s und in Schritten der Belichtungszeit ansteigend). Die Werte von figure-discussion-2 sollten über einem bestimmten Schwellenwert von tmin konvergieren; dieser tmin sollte in Schritt 5.3 verwendet werden.

Die hier beschriebene Methode quantifiziert die Wechselwirkungsdynamik von Proteinen in Kondensaten mit einer Präzision, die mit herkömmlichen Techniken nicht erreichbar ist. Darüber hinaus kann es dies in lebenden Zellen mit minimaler Probenstörung tun. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da das Interaktionsverhalten von IDRs, einschließlich ihrer Kondensatbildung, stark von ihrer lokalen Umgebung abhängt40.

Die repräsentativen Ergebnisse von Irgen-Gioro et al.40 zeigen die Fähigkeit dieser Methode, Verweilzeiten für Proteine zu extrahieren, die an ihre selbstorganisierten LLPS-Kondensate binden. Wichtig ist, dass diese Methode durch homotypische oder heterotypische Wechselwirkungen leicht auf jedes Protein erweitert werden kann, das an jede Art von Kondensaten bindet. Darüber hinaus ist es nicht auf die Messung der Interaktionsdynamik von Proteinen beschränkt, die einer LLPS unterzogen werden. Es wurde gezeigt, dass das Fusionsonkoprotein EWS::FLI1, von dem bekannt ist, dass es das Ewing-Sarkom verursacht, lokale, hochkonzentrierte Knotenpunkte bildet, die eine wesentliche Rolle bei seiner transkriptionellen Aktivierung und seinen onkogenen Transformationsfunktionen spielen 1,2. Während die Bildung dieser Hubs durch transiente, selektive und multivalente IDR-IDR-Wechselwirkungen von EWS::FLI1 angetrieben wird, gibt es bisher noch keine überzeugenden Beweise dafür, dass es sich um echte LLPS-Kondensatehandelt 1,2. Trotzdem haben wir mit der hier vorgestellten Methode die mittlere Verweilzeit von EWS::FLI1 an seinen Hubs gemessen und gezeigt, dass die Mutation spezifischer Reste und die Deletion seiner IDR die Bindung von EWS::FLI1 an seine Hubssignifikant destabilisiert 1.

Trotz der Vielseitigkeit dieser Methode bei der Charakterisierung der Bindungsdynamik von Proteinen in Kondensaten ist bei der Auswahl des Modells für die Proteinbindung in bestimmten Kontexten Vorsicht geboten. Vorhandene biochemische Daten unterstützen die Idee, dass eine Zweikomponenten-Exponentialverteilung oft ein geeignetes Modell für viele Systemeist 1,37,40,42, aber dieselbe Verteilung hat sich auch als ungeeignete Darstellung der Proteinbindung in anderen Systemen erwiesen, in denen alternative Modelle wie die Dreikomponenten-Exponentialverteilung 47,48,49 und die Potenzgesetzverteilungen50 besser zu den experimentellen Beobachtungen passen. Um ungenaue Schlussfolgerungen zu vermeiden, sollte man ein Modell sorgfältig auswählen und motivieren, überprüfen, ob die Anpassungsqualität die Verwendung des Modells unterstützt, und die Ergebnisse mit Bedacht interpretieren.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter der Fördernummer unterstützt. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), der Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), der Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), der Mallinckrodt Research Grant (S.C.) und der Margaret E. Early Medical Research Trust 2024 Zuschuss (S.C.). S.C. wird auch vom NIH/NCI unter der Award-Nummer P30CA016042 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 &Mikro; m TetraSpeck MikrosphäreInvitrogenT7279Einzelmolekül-Bildgebung
25 mm Durchmesser, #1,5 DeckgläserMarienfeld Superior111650Präparation von Deckgläsern
593/40 nm BandpassfilterSemrockFF01-593/40-25Einzelmolekül-Bildgebung
676/37 nm BandpassfilterSemrockFF01-676/37-25Einzelmolekül-Bildgebung
6-Well TC PlateGenesee25-105MPVorbereitung von Zellen für die Mikroskopie
Zelllinie: U-2 OSATCCHTB-96Markierung von Proteinen in Zellen
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten: Verfügbar in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Vorbereitung von Deckgläsern
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusVorbereitung von Zellen für die Mikroskopie
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Markierung von Proteinen in Zellen: Verwendete Wachstumsmedien: DMEM mit 5 % fötalem Rinderserum, 1 % Penstrep
Eclipse Ti2-E Inverses MikroskopNikonEinzelmolekül-Bildgebung
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALVorbereitung von Deckgläsern
evalSPTAnalyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten: Verfügbar in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Markierung von Proteinen in Zellen: Verwendete Wachstumsmedien: DMEM mit 5 % fötalem Rinderserum, 1 % Penstrep
FidschiAnalyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Einzelmolekül-Bildgebung
Dichromoitische Langpass-StrahlteilerSemrockDi02-R635-25x36Einzelmolekül-Bildgebung: Rot/Fernrot Strahlteiler
LUN-F LasereinheitNikonEinzelmolekül-Bildgebung: 405/488/561/640
MatTek GlasbodenschaleMatTekP35G-1.5-20-CVorbereitung der Zellen für die Mikroskopie: 35 mm, #1.5 Deckglasschale für die Zellkultur.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Mikroskop-Erfassungssoftware
Nucleus und Cluster mask_v2.txtAnalyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten: Verfügbar in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Markierung von Proteinen in Zellen: Verwendete Wachstumsmedien: DMEM mit 5 % fötalem Rinderserum, 1 % Penstrep
Phosphat gepufferte KochsalzlösungThermo Fisher Scientific18912014Markierung von Proteinen in Zellen
Photoaktivierbares Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusVorbereitung von Zellen für die Mikroskopie
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten: Verfügbar in Chong et al., 2018
KaliumhydroxidMallinckrodt Chemicals6984-06Herstellung von Deckgläser
pretracking_comb.txtAnalyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten: Verfügbar in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalyse von Einzelmolekül-Bildgebungsdaten: Verfügbar in Teves et al., 2016
Stage-top InkubationssystemTokai HitEinzelmolekül-Bildgebung: Für die Lebendzell-Bildgebung
TwinCam Dual-Emissions-BildsplitterCairn ResearchUltraschallreiniger
Branson5800für Einzelmolekül-Bildgebung Vorbereitung von Deckgläsern

Referenzen

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Single Molecule ImagingLiquid Liquid Phase SeparationIntrinsically Disordered ProteinsResidence Time MeasurementLive Cell ImagingSingle Particle TrackingHalo Tagged ProteinsProtein Condensate Binding

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