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Methodenartikel

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

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DOI:

10.3791/66212

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17. Mai 2024

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells für intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) vor, das es uns ermöglicht, altersbedingte Veränderungen im Glukosestoffwechsel zu beobachten, die auf ICSI zurückzuführen sind, und Einblicke in ihre potenziellen langfristigen Auswirkungen auf die menschliche Entwicklung zu geben.

Zusammenfassung

Die Lebenserwartung des Menschen ist beträchtlich lang, während Mausmodelle die gesamte menschliche Lebensspanne in einem relativ kurzen Zeitraum simulieren können, wobei ein Jahr Mausleben etwa 40 Menschenjahren entspricht. Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ist eine in der klinischen Praxis häufig eingesetzte assistierte Reproduktionstechnologie. Angesichts ihrer relativ jungen Entstehung vor etwa 30 Jahren sind die langfristigen Auswirkungen dieser Technik auf die menschliche Entwicklung jedoch unklar. In dieser Studie haben wir die ICSI-Methode in Kombination mit dem Embryotransfer (ET) unter Verwendung eines Mausmodells etabliert. Die Ergebnisse zeigten, dass normale Mausspermien nach In-vitro-Kultur und anschließender ICSI eine Befruchtungsrate von 89,57 % und eine Zwei-Zell-Rate von 87,38 % aufwiesen. Nach ET lag die Geburtenrate der Nachkommen bei etwa 42,50%. Darüber hinaus wurden mit zunehmendem Alter der Mäuse Schwankungen im Glukosestoffwechsel beobachtet, die mit der Anwendung der ICSI-Technik in Verbindung gebracht werden können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ICSI-ET-Technik der Maus eine wertvolle Plattform für die Bewertung der Auswirkungen von Spermienanomalien auf die Embryonalentwicklung und ihrer langfristigen Auswirkungen auf die Gesundheit der Nachkommen, insbesondere in Bezug auf den Glukosestoffwechsel, bietet. Diese Studie liefert wichtige Erkenntnisse für die weitere Erforschung der potenziellen Auswirkungen der ICSI-Technik auf die menschliche Entwicklung und unterstreicht die Notwendigkeit einer eingehenden Untersuchung der langfristigen Auswirkungen dieser Technologie.

Einleitung

Fruchtbarkeitsprobleme sind zu einem wichtigen Schwerpunkt medizinischer und soziologischer Besorgnis geworden, insbesondere in der modernen Gesellschaft, in der sinkende Fruchtbarkeitsraten und die zunehmende Schwere der Prävalenz und Schwere der Unfruchtbarkeit in den Vordergrund gerückt sind. Die assistierte Reproduktionstechnologie (ART) bietet eine breite Palette von Möglichkeiten, diese Herausforderungen zu bewältigen, wobei die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) häufig als therapeutische Intervention eingesetzt wird.

Seit Palermo 1992 über die erste erfolgreiche Schwangerschaft durch intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) berichtete, hat sich die ICSI zu einer zentralen Technik in der assistierten Reproduktionstechnologie (ART)1 entwickelt. Wenn man jedoch bedenkt, dass ICSI erst seit 30 Jahren im klinischen Umfeld eingesetzt wird, was im Vergleich zur menschlichen Lebensspanne ein relativ kurzer Zeitraum ist, wurden die Langzeitwirkungen von ICSI, insbesondere auf die Entwicklung der Nachkommen, nicht umfassend untersucht und aufgeklärt. Gegenwärtig haben sich Mäuse, die sich durch ihren einheitlichen genetischen Hintergrund und ihre kürzere Lebensdauer auszeichnen, als weit verbreitetes alternatives Modell in der medizinischen Forschung herauskristallisiert. Darüber hinaus kann das Mausmodell die gesamte menschliche Lebensspanne innerhalb eines komprimierten Zeitrahmens rekapitulieren, wobei ein Jahr bei Mäusen ungefähr 40 Jahren beim Menschen entspricht2.

In den letzten zehn Jahren haben mehrere kleinere Studien berichtet, dass Personen, die durch ICSI gezeugt wurden, ein erhöhtes Risiko haben, später im Leben metabolische Syndrome wie abnormale Blutzuckerspiegel zu entwickeln 3,4. Obwohl die Evidenz nicht endgültig ist, hat dieser Befund in der wissenschaftlichen Gemeinschaft dennoch ernsthafte Bedenken hinsichtlich der langfristigen gesundheitlichen Auswirkungen von ICSI hervorgerufen. Diese Situation unterstreicht die dringende Notwendigkeit einer strengeren Bewertung von ART und ihren langfristigen gesundheitlichen Folgen. Insbesondere vor dem Hintergrund der Grenzen und ethischen Überlegungen von Humanstudien ist die Entwicklung von Tiermodellen, die die Entwicklung menschlicher Nachkommen nach ICSI genau rekapitulieren können, immer wichtiger geworden. In diesem Zusammenhang hat sich das Maus-ICSI-ET-Modell (Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer) aufgrund seiner Fähigkeit, die ICSI beim Menschen nachzuahmen und die langfristige Überwachung der gesundheitlichen Ergebnisse der Nachkommen zu erleichtern, zu einem wirksamen Instrument zur Bewertung der potenziellen Gesundheitsrisiken der ICSI-Technologie für die Nachkommenentwickelt 5.

Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss der ICSI-ET-Technologie auf einen vorherrschenden metabolischen Phänotyp, nämlich die Glukosestoffwechselgesundheit der Nachkommen, zu untersuchen, indem zufällige Blutzuckermessungen, Nüchternblutzuckertests und Glukosetoleranztests eingesetzt werden, um den Glukosestoffwechselzustand von Mäusen zu beurteilen. Die zufällige Blutzuckermessung wird verwendet, um die natürlichen Schwankungen im Glukosestoffwechsel während normaler physiologischer Aktivitäten zu erfassen, während Nüchternblutzucker- und Glukosetoleranztests eingesetzt werden, um potenzielle prädiabetische Zustände zu beurteilen.

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Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll von ICSI-ET folgt den Richtlinien und wurde von der Animal Ethical Review des Shanghai Institute of Planned Parenthood Research genehmigt. Sicherheitsmaßnahmen: Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien oder biologischen Materialien immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA). Verwendung von Hauben: Führen Sie alle Verfahren, bei denen flüchtige Chemikalien oder Aerosole entstehen, in einem zertifizierten Abzug oder einer Biosicherheitswerkbank durch. Verwenden Sie weibliche Mäuse (6-8 Wochen alter B6D2F1-Stamm) für den Superovulationsvorgang.

1. ICSI bei Mäusen

  1. Superovulation von Mäusen
    1. Verabreichen Sie am ersten Tag gegen 20:00 Uhr eine intraperitoneale Injektion von trächtiger Stutenserumgonadotropin (PMSG) in einer Dosis von 7,5 IE pro Maus.
    2. Verabreichen Sie am dritten Tag gegen 20:00 Uhr (48 Stunden nach der PMSG-Injektion) eine intraperitoneale Injektion von humanem Choriongonadotropin (HCG) in einer Dosis von 7,5 IE pro Maus.
  2. Bereiten Sie das HTF-Medium in 1-ml-Aliquoten vor und lassen Sie sie unbedeckt für die Äquilibrierung über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator am selben Tag der HCG-Injektion bei weiblichen Mäusen.
  3. Aufbereitung von ICSI-Befruchtungströpfchen
    1. Am selben Tag der HCG-Injektion bei weiblichen Mäusen teilen Sie einen 50 x 9 mm großen Deckel der Zellkulturschale in die obere und untere Hälfte. Verwenden Sie die obere Hälfte, um 4-6 Tröpfchen à 5 μl zu erzeugen, wobei 10 % Polyvinylpyrrolidon (PVP) für die Spermienplatzierung verwendet werden. Verwenden Sie die untere Hälfte, um 8-10 Tröpfchen zu je 5 μl herzustellen, wobei M2-Medium für das ICSI-Verfahren verwendet wird.
    2. Bedecken Sie die Tröpfchen des PVP- und M2-Mediums mit ca. 3 mL Mineralöl (Abbildung 1).
  4. Zubereitung von Kulturgerichten
    1. Am selben Tag der HCG-Injektion bei weiblichen Mäusen werden 12 Tropfen KSOM-Medium (MR-020P-D) mit 20 μl gleichmäßig in eine 35 x 10 mm große Zellkulturschale abgegeben. Bedecken Sie die Tropfen mit ca. 3 mL Mineralöl.
  5. Spermiengewinnung:
    1. Euthanasieren Sie männliche Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation um ca. 9:00 Uhr am vierten Tag (13 h nach HCG-Injektion).
    2. Isolieren Sie die Nebenhoden-Cauda und reinigen Sie sie gründlich, um Fettgewebe und Blutreste zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig mit steriler Gaze abtupfen und in vorgewärmtem HTF-Medium spülen.
    3. Schneiden Sie den Cauda epididymis auf, damit die Spermien frei in das HTF-Medium hinausschwimmen können. Drücken Sie die Cauda vorsichtig mit einer Pinzette zusammen, um die Spermien freizusetzen, sammeln Sie sie in vorequilibrierten HTF-Röhrchen und bewahren Sie sie unbedeckt in einem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator auf, um die Spermien für die weitere Verwendung zu kapazitieren
  6. Entnahme von Eizellen
    1. Euthanasieren Sie weibliche Mäuse, die am vierten Tag gegen 9:30 Uhr durch Gebärmutterhalsluxation für die Eizellentnahme stimuliert wurden. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt entlang der Mittellinie der Bauchhaut und der Muskelschicht, um die Bauchhöhle freizulegen.
    2. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um Gewebe von beiden Seiten der Eileiter, insbesondere aus den geschwollenen Ampullenregionen, vorsichtig zu isolieren und in einer sterilisierten Kulturschale in M2-Medium zu überführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Eileiter aller bezeichneten Mäuse entnommen sind.
    3. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine 1-ml-Spritzennadel, um den transparenten Abschnitt der geschwollenen Ampulle des Eileiters sanft zu punktieren und so die Freisetzung von Kumulus-Eizell-Komplexen (KOK) in das Medium zu erleichtern.
    4. Entnehmen Sie die KOK mit derselben Spritze vorsichtig und geben Sie sie in eine neue Schale mit 100 μl frischem M2-Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle KOK erfolgreich von den ursprünglichen Eileitersegmenten übertragen wurden.
    5. Wischen Sie Blut und Gewebsflüssigkeiten ab und reißen Sie unter einem Präpariermikroskop die Ampulle des Eileiters mit einer 25-G-Nadel auf, wodurch zahlreiche KOK freigesetzt werden.
    6. Entfernen Sie den Eileiter und die Gewebefragmente, übertragen Sie die KOK in Tröpfchen aus M2-Medium, das Hyaluronidase (HY) enthält, und erwärmen Sie sie auf 37 °C.
    7. Nach einer Inkubation von ca. 5 Minuten ist ein sanftes Pipettieren durchzuführen, um die Trennung von Kumuluszellen und Eizellen zu erleichtern. Übertragen Sie die Eizellen der Metaphase II (MII) aus der HY-haltigen Lösung in das frische M2-Medium; Führen Sie dann die sequentielle Übertragung in mehrere Tröpfchen des M2-Mediums durch.
    8. Nach 2-3 Waschgängen werden die Eizellen in Tröpfchen mit KSOM-Nährmedium umgefüllt und zur weiteren Verwendung in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 aufbewahrt.
  7. Gegen 10:00 Uhr am vierten Tag werden 100 μl des kapazitiven Spermiums (siehe Schritt 1.5.2.) 5 s lang beschallt, um die Köpfe von den Schwänzen bei einer Frequenz von 46 kHz zu trennen, mit einer Leistungseinstellung von 50 Watt.
    HINWEIS: Wenn Sie Spermien beschallen, um den Schwanz zu kürzen, seien Sie vorsichtig, um die Zeit zu kontrollieren, die 5 s nicht überschreiten sollte. Wenige Sekunden nach der Beschallung können die Spermien unter einem inversen Mikroskop beobachtet werden; Hören Sie auf zu beschallen, wenn etwa die Hälfte der Spermien abgeschnittene Schwänze aufweist.
  8. ICSI-Verfahren
    1. Verwenden Sie für die Injektion eine handelsübliche Mikromanipulationsnadel mit flacher Spitze und einem Innendurchmesser von 6 μm, die in einem Winkel von 25° eingestellt ist. Füllen Sie die Nadel mit dem Betriebsmittel, wobei sich die gefüllte Portion mit einer Länge von 0,5 cm im Inneren der Nadel befindet. Stellen Sie sicher, dass der Füllstand der Flüssigkeit ~0,5 cm erreicht.
      HINWEIS: Halten Sie die Raumtemperatur während der Injektion bei 19 °C, um hohe Temperaturen zu vermeiden, die die Überlebensrate befruchteter Eizellen verringern könnten. Die Präzision, mit der sichergestellt wird, dass der Flüssigkeitsstand 0,5 cm erreicht, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität des Injektionsprozesses und die Sicherstellung der Lebensfähigkeit der Eizellen.
    2. Montieren Sie die Injektionsnadel am rechten Arm des Mikromanipulators und befestigen Sie sie sicher durch Festziehen der Haltekappe. Installieren Sie eine handelsübliche Mikromanipulationspipette mit flacher Spitze, die für Maus-Eizellen entwickelt wurde, am linken Arm des Mikromanipulators und positionieren Sie die Injektionsnadel und die Haltepipette im Sichtfeld des Mikroskops.
    3. Geben Sie mit einer Pipette 1 μl beschalltes Sperma in ein Tröpfchen PVP-Lösung.
    4. Geben Sie 20 MII-Eizellen in einen Tropfen M2-Medium.
    5. Verwenden Sie die Injektionsnadel, um 10-20 Spermienköpfe in PVP-Lösung zu aspirieren. Schieben Sie dann die Injektionsnadel in das Tröpfchen mit den Eizellen.
    6. Bestimmen Sie direkt die Position der Metaphase-Spindel innerhalb der Eizelle unter einem Polarisationsmikroskop, um sicherzustellen, dass sich der Spindelapparat nicht auf der Seite der Injektion befindet, wobei sich der Polkörper typischerweise entweder in der 12-Uhr- oder 6-Uhr-Position relativ zur Ausrichtung der Eizelle befindet.
    7. Halten Sie die Eizelle in Kontakt mit dem Boden der Kulturschale. Stellen Sie die Fokusebene so ein, dass sich die Zona pellucida der Eizelle und der Injektionsnadel in derselben Ebene befinden.
    8. Bei Kontakt der Injektionsnadel mit der Zona pellucida üben Sie einen leichten Unterdruck auf die Injektionsnadel aus und ziehen Sie einen Teil der Zona pellucida ein.
    9. Aktivieren Sie gleichzeitig Piezoimpulse mit einer Intensitätseinstellung von 5 und einer Frequenz von 1, wodurch eine Perforation in der Zona pellucida erzeugt wird und die Injektionsnadel durchgelassen wird.
    10. Schieben Sie die Injektionsnadel in den perivitellinischen Raum und schieben Sie den Spermienkopf zur Spitze der Nadel. Führen Sie die Injektionsnadel in die Eizelle ein, bis sie die gegenüberliegende Seite der Zona pellucida erreicht.
    11. Verwenden Sie Piezoimpulse, die auf eine Intensität von 1 und eine Frequenz von 1 eingestellt sind, um eine kleine Pore in der Plasmamembran zu erzeugen, um sicherzustellen, dass der Spermienkopf mit minimalem PVP-Eintrag in das Ooplasma injiziert wird und die Integrität der Eizelle optimal erhalten bleibt.
    12. Schritt 1.8.11 wiederholen, bis alle 20 Eizellen injiziert sind, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei 19 °C.
    13. Übertragen Sie die überlebenden Eizellen in das KSOM-Medium und legen Sie sie in den Inkubator. Beobachten Sie die Bildungsraten von 2-Zellen, 4-Zellen, Morula und Blastozysten.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt für die intrazytoplasmatische Injektion einzelner Spermien (ICSI) in die Eizelle sollte kontrolliert werden, mit dem Ziel, den Eingriff innerhalb von 14-18 Stunden nach der Injektion von HCG abzuschließen.

2. Uterustransplantation von Maus-Blastozysten

  1. Aufbereitung von vasektomierten männlichen Mäusen
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Studie männliche ICR-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen.
    1. Induzieren Sie die Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von 1,25 % 2,2,2-Tribromethanol in einer Dosierung von 0,2 ml/10 g Körpergewicht. Das Fehlen einer Schmerzreaktion deutet auf eine erfolgreiche Anästhesie hin.
      HINWEIS: Obwohl das aktuelle Protokoll das Auftragen von Tiersalbe auf die Augen von anästhesierten Tieren nicht beinhaltet, wird es als bewährte Methode empfohlen, um Augentrockenheit zu verhindern und die Gesundheit und den Komfort der Tiere während des Eingriffs zu gewährleisten. Während des gesamten Operations- und Genesungsprozesses wurden alle chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch sterilisiert, und der Operationsbereich wurde mit antiseptischen Lösungen vorbereitet, um eine saubere Operationsumgebung zu gewährleisten.
    2. Um sich vor möglichem Stress oder Verletzungen zu schützen, sollten Sie die Mäuse, die sich einer Operation unterzogen haben, während der ersten Erholungsphase einzeln unterbringen.
    3. Verabreichen Sie Buprenorphin in einer Dosierung von 0,05 mg/kg Körpergewicht, um eine optimale Schmerzlinderung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Um das Wohlbefinden der Mäuse zu gewährleisten, überwachen Sie die Mäuse während der Erholungsphase genau und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
    4. Bereiten Sie die Operationsstelle im unteren Bauchbereich oberhalb der Hoden vor. Das Fell entfernen und mit Povidon-Jod desinfizieren. Machen Sie mit einer sterilen Schere einen 1 cm langen Schnitt entlang der Linea alba. Entfernen Sie vorsichtig jegliches Blut mit sterilem, staubfreiem Papier und fahren Sie fort, die Bauchmuskeln entlang der Linea alba stumpf zu präparieren und Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
    5. Fassen Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig den linken Hoden und das zugehörige Fettpolster und legen Sie es frei. Identifizieren Sie den Samenleiter und isolieren Sie ihn vorsichtig mit einer spitzen Pinzette, um ein 10-mm-Segment für die Manipulation zu erstellen.
    6. Sterilisieren Sie die gebogene Pinzette, indem Sie sie einige Sekunden lang in die äußere Flamme einer Alkohollampe halten. Fassen Sie den Samenleiter vorsichtig an, wodurch er durch die Verätzung abgeflacht und weiß wird. Erstellen Sie einen zweiten Kauterisationspunkt 3-5 mm distal zum ersten. Schneiden Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere das Segment des Samenleiters zwischen den beiden Kauterisationspunkten heraus.
    7. Untersuchen Sie sorgfältig die kauterisierten Enden des Samenleiters und stellen Sie sicher, dass ein kurzes, abgeflachtes, aufgehelltes Segment übrig bleibt. Bringen Sie den Hoden und das zugehörige Fettpolster mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig in die Bauchhöhle zurück.
    8. Wiederholen Sie den in Schritt 2.1.6 beschriebenen Vorgang auf der kontralateralen (rechten) Seite.
    9. Verschließen Sie die Operationsstelle mit Nähten, wobei Sie in der Regel einen Stich in die Muskelschicht und drei Stiche in die Haut legen. Stellen Sie sicher, dass der chirurgische Schnitt richtig ausgerichtet ist, und desinfizieren Sie ihn mit Povidon-Jod. Bringen Sie das Tier zur Beobachtung auf ein Heizkissen und überwachen Sie es 10-15 Minuten lang, bis das Tier wieder zu Bewusstsein kommt. Sobald es genesen ist, bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück.
      HINWEIS: Nach einer Vasektomie-Operation benötigen die Mäuse eine 14-tägige Erholungsphase, gefolgt von einem 1-wöchigen Paarungsversuch.
    10. Verpaaren Sie in dieser Woche kontinuierlich die vasektomierten Männchen mit den Weibchen und beobachten Sie den Trächtigkeitsstatus aller Weibchen mit Kopulationspfropfen. Eine erfolgreiche Paarung wird durch das Vorhandensein eines gelblich-weißen, blockartigen Vaginalstopfens an der Vaginalöffnung der weiblichen Maus angezeigt.
      1. Koppeln Sie die Mäuse am ersten Tag zwischen 16:00 und 18:00 Uhr und überprüfen Sie die Vaginalstöpsel am zweiten Tag zwischen 7:00 und 9:00 Uhr. Betrachten Sie Frauen mit Vaginalplugs nach 0,5 Tagen als in einem pseudoschwangeren Zustand und verwenden Sie sie für nachfolgende Embryotransferexperimente. Bringen Sie Weibchen ohne Vaginalpfropfen in die Empfängergruppe zurück.
        HINWEIS: Diese Weibchen ohne Vaginalpfropfen können weiterhin zur Paarung verwendet werden, um pseudoschwangere Weibchen vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass nicht alle gestopften Weibchen schwanger werden; Erst dann können die vasektomierten Männchen für formale Experimente verwendet werden.
      2. Während sich vasektomierte Männchen täglich paaren können, sollten Sie zwischen den Paarungssitzungen 1 Tag Pause einplanen.
        HINWEIS: Nach unseren Erfahrungen können vasektomierte Männchen über ein Jahr lang eine hohe Kopulationspfropfenrate aufrechterhalten. Vasektomierte Männchen, die bei paarenden Weibchen für 4-6 aufeinanderfolgende Versuche keine kopulatorischen Pfropfen produzieren, sollten jedoch aus der Studie entfernt werden.
  2. Vorbereitung von pseudoschwangeren Frauen
    1. Erzeugung pseudoschwangerer weiblicher Mäuse durch Verpaarung von weiblichen ICR-Mäusen (im Alter von 7-10 Wochen, mit einem Gewicht von über 25 g) mit vasektomierten männlichen Mäusen (3-6 Monate alt) im Verhältnis 1:1.
      HINWEIS: Die vasektomierten Männchen wurden verwendet, um den Gebärmutterhals der weiblichen Mäuse zu stimulieren, was zur Aktivierung der Corpora lutea führte.
  3. Vorbereitung der Pipette für den Transfer von Blastozysten
    1. Nehmen Sie die zu transplantierenden Embryonen aus dem Inkubator und überführen Sie sie in ein Tröpfchen M2-Medium bei einer Temperatur von 37 °C.
    2. Verwenden Sie eine Transferpipette, um eine kleine Menge Flüssigkeit zu aspirieren, ziehen Sie eine kleine Menge Luft und aspirieren Sie 6-10 Embryonen. Zum Schluss saugen Sie ein weiteres kleines Luftvolumen an, um die Pipette abzudichten.
      HINWEIS: Die Länge der Flüssigkeit in der Transferpipette sollte 0,5 cm nicht überschreiten.
  4. Gebärmuttertransplantation (Blastozysten)
    1. Wiegen Sie die pseudoschwangeren weiblichen Mäuse (2,5 Tage nach der Paarung) und betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion von 1,25 % 2,2,2-Tribromethanol in einer Dosis von 0,2 ml/10 g Körpergewicht. Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf das Ohr.
    2. Nachdem Sie den Mäusen eine Anästhesie verabreicht und die Asepsis durch Alkoholdesinfektion sichergestellt haben, führen Sie einen Mittellinien-Längsschnitt am ventralen Bauch durch. Unter Ausnutzung des lockeren Unterhautgewebes verlagern Sie den Schnitt je nach Bedarf für die Transplantation auf die linke oder rechte Seite. Verwenden Sie eine kleine Schere, um eine stumpfe Dissektion der Bauchwandmuskelschicht bei ~0,5 cm lateral der Lendenwirbelsäule durchzuführen, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
    3. Äußere die Eierstöcke, Eileiter und die Gebärmutter vorsichtig mit einer atraumatischen Zange.
    4. Machen Sie mit der Spitze einer Spritzennadel einen kleinen, nach oben gewinkelten Schnitt an der Gebärmutterwand unterhalb des utero-tubalen Übergangs, um Blutgefäße zu vermeiden. Dieser Schnitt ermöglicht den Zugang zur Gebärmutterhöhle; Führen Sie den Eileiter vorsichtig 2-3 mm durch das kleine Loch ein.
    5. Stoßen Sie die kleine Luftblase am Ende der Transferpipette vorsichtig aus, während Sie die Transferpipette während der langsamen Injektion der Embryonen vorsichtig beobachten. Sobald bestätigt wurde, dass der zentrale Teil des Kulturmediums ausgestoßen wurde, stoppen Sie den Vorgang und entfernen Sie vorsichtig die Transferpipette.
    6. Positionieren Sie die Eierstöcke, Eileiter und die Gebärmutter wieder in die Bauchhöhle. Nähen Sie die Muskelschicht und die Haut separat. Legen Sie die Mäuse auf ein Heizkissen, bis sie sich von der Narkose erholt haben. Um das Wohlbefinden der Mäuse zu gewährleisten, überwachen Sie die Mäuse während der Erholungsphase genau und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
  5. Beobachtung der Schwangerschaft
    1. Beobachten Sie die Mäuse nach der Operation 18-21 Tage lang, um die Anzahl der geborenen Nachkommen zu überwachen. Im Falle einer Dystokie (schwierige Geburt) führen Sie einen Kaiserschnitt durch. Lassen Sie die neugeborenen Mäuse von laktierenden Muttertieren der gleichen Altersgruppe aufziehen.

3. Zufälliger Blutzucker-, Nüchternblutzucker- und Glukosetoleranztest

  1. Verfolgung des zufälligen Blutzuckerspiegels während des Mauswachstums
    1. Überwachen Sie seit der Geburt der Mäuse alle 4 Wochen um 9 Uhr morgens den zufälligen Blutzuckerspiegel nach einer guten Nacht mit Fütterung und Spaß.
      1. Punktiere die Schwanzspitze der Maus, um Blut aus der Schwanzvene zu gewinnen.
      2. Der erste Tropfen Blut hat einen höheren Zuckermesswert, da die mit ihm vermischte Gewebsflüssigkeit vorhanden ist. Wischen Sie daher den ersten Tropfen Blut vorsichtig mit sauberem, saugfähigem Papier ab.
      3. Messen Sie den Blutzucker ab dem zweiten Tropfen (~4 μl) aus der Schwanzvene mit einem tragbaren Blutzuckermessgerät.
  2. Verfolgung von Veränderungen des Nüchternblutzuckers und der Glukosetoleranz während der Entwicklung von Mäusen
    HINWEIS: Wenn man bedenkt, dass der Zeitpunkt der ersten Blutentnahme 15 Minuten beträgt, müssen alle Mäuse innerhalb von 15 Minuten injiziert werden. Da jede Mausinjektion 20-30 s dauerte, um sicherzustellen, dass die Injektionen innerhalb dieses Zeitrahmens abgeschlossen werden, darf die maximale Anzahl von Mäusen, die in jedem Test verwendet werden können, 30 nicht überschreiten.
    1. Führen Sie die Nüchternblutzucker- und Glukosetoleranztests alle 4 Wochen nach der Geburt bei über Nacht nüchternen Mäusen durch.
      1. Bereiten Sie am ersten Tag frische, bestrahlte Späne, Einstreu, saubere Käfige, Deckel und Wasserflaschen vor. Setzen Sie die Mäuse ohne Futter in einen frischen Käfig um. Versehen Sie die Käfige mit "Nicht füttern"-Etiketten.
      2. Bereiten Sie ausreichend 10%ige Glukoseinjektion (steril und pyrogenfrei) und 1 ml-Spritzen vor.
      3. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse in jeder Gruppe 16 Stunden lang fasten, von 17:00 Uhr an Tag 1 bis 9:00 Uhr an Tag 2, aber erlauben Sie freien Zugang zu Wasser. Messen Sie den Nüchternblutzuckerspiegel wie in den Schritten 3.1.1.1 bis 3.1.1.3 beschrieben mit einem Glukosemessgerät.
    2. Wiegen Sie die Mäuse und markieren Sie ihre Schwänze, um eine schnelle Identifizierung zu ermöglichen. Bereiten Sie Glukosespritzen mit 10 μL/g Mausgewicht vor.
    3. Injizieren Sie im Abstand von 30 s 10 μl/g Glukose in die intraperitoneale Höhle der Maus.
      HINWEIS: Besonderes Augenmerk muss hier auf Injektionstechniken gelegt werden, um ein ungenaues Flüssigkeitseinspritzvolumen zu vermeiden. Die wichtigsten Punkte der Operation sind wie folgt:
      1. Lege die Maus ruhig und halte den Schwanz mit einer Hand fest. Halten Sie den Kopf etwas tiefer als das Gesäß, so dass sich die Organe in der Bauchhöhle in Richtung Kopf verschieben und genügend Platz für die Injektion bleibt.
      2. Positionieren Sie die Nadel zwischen der Mittellinie und dem Hüftknochen, führen Sie sie in einem 45-Grad-Winkel durch die Haut und führen Sie die Nadel dann sanft tiefer in die Bauchhöhle, während Sie sie ~0,5 cm lang parallel zur Hautoberfläche ausrichten.
        HINWEIS: Achten Sie auf einen eventuellen Widerstand während der Injektion, um festzustellen, ob die inneren Organe versehentlich punktiert wurden.
      3. Werfen Sie die Spritze in die Bauchhöhle aus.
      4. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Injektion begonnen hat, und verwenden Sie einen Timer, um die Injektionsrate zu steuern. Stellen Sie den Timer für drei Mäuse auf 90 s ein, um Zeitverluste bei der Handhabung des Timers zu vermeiden.
    4. Nehmen Sie die Blutzuckermessung aus der Schwanzvene in den gewünschten Abständen (0 vor der Glukoseverabreichung, 15, 30, 60, 90 und 120 min nach der Glukosebelastung).
      HINWEIS: Nachfolgende Blutzuckermessungen sollten ebenfalls 20-30 s für jede Maus dauern.
    5. Bringen Sie die Mäuse nach dem Experiment in ihre mit Futter und Wasser ausgestatteten Käfige zurück.

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Ergebnisse

In unserem Labor haben wir mittels ICSI mit nebenhoden kaudalen Spermien bei Mäusen eine Befruchtungsrate von 89,57 % und eine 2-Zell-Rate von 87,38 % erreicht. Die Geburtenrate der Nachkommen nach ET liegt bei etwa 42,50%. Bemerkenswert ist, dass alle Befruchtungsraten, 2-Zell-Raten und Geburtenraten der Nachkommen mit den Werten vergleichbar sind, die bei der menschlichen ART erreicht werden, was eine umfassende Simulation der verschiedenen Stadien menschlicher ART-Techniken bei Mäusen ermöglicht. Weitere Einzelheiten ...

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Diskussion

Diese Studie integrierte Techniken der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) und des Embryotransfers (ET) von Mäusen, um die assistierte Reproduktionstechnologie (ART) des Menschen umfassend zu rekapitulieren und den Einfluss von ICSI in Verbindung mit ET auf die Entwicklung der Nachkommen zu untersuchen. Die Anwendung der ICSI-Technik mit normalen Mausspermien führte zu einer hohen Befruchtungsrate (86,76 %) und einer hohen 2-Zell-Rate (88,48 %). Nach ET lag die Geburtenrate v...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Großprojektplan des Sonderentwicklungsfonds für die Shanghai Zhangjiang National Independent Innovation Demonstration Zone (ZJ2022-ZD-006), das Shanghai Municipal Science and Technology Commission Targeted Funding Project (22DX1900400) und das Jugendprogramm der Shanghai Municipal Health Commission (20204Y0276). die National Natural Science Foundation of China (32070849).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,25 % Avertin (2,2,2-Tribromethanol)Nanjing AibeiM2960für die Anästhesie
Bakteriologische Petrischalen 35 x 10 mm mit dichtem Deckel, reines Polystyrol in Kristallqualität, sterilBD353001
Bakteriologische Petrischalen 50 x 9 mm mit dichtem Deckel, reines Polystyrol in Kristallqualität, sterilBD351006
BiosicherheitswerkbankESCOclass figure-materials-1BSC Aseptische Operationen, Herstellung von Kulturschalen, Aliquotierung von Reagenzien usw.
CO2-InkubatorThermo8000DH
OlympusSZX16Verwendung beim Embryotransfer von Mäusen
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 ist eine thermisch stabile, vollfluorierte Flüssigkeit mit hoher Durchschlagsfestigkeit und hohem spezifischen Widerstand, die als Betriebsmittel verwendet
HandglukometerRocheAccuChek performaBlut Glukosemessung
HTFMerckMR-070-DDie EmbryoMax Human Tubal Fluid (HTF) (1x), Flüssigkeit, die für die Verwendung mit Maus-IVF entwickelt wurde, ist in einem 50-ml-Format erhältlich und wurde für die Embryokultur optimiert und validiert.
Hydraulischer MikroinjektorEppendorfCellTram 4r Öl, 5196000030Für die Spermieninjektion
Inverses MikroskopNikonTI2-UMikromanipulation Beobachtungshost
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Pulver, ohne Phenolrot, 5 x 10 mL
M2 MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), Flüssigkeit, mit Phenolrot
MikromanipulatorNARISHIGENTX-N4Mikromanipulationsarm
Mineralöl SIGMAM8410Mineralöl eignet sich als Deckschicht zur Kontrolle von Verdunstung und Kreuzkontamination in verschiedenen molekularbiologischen Anwendungen.
NadelschneiderNanjing AibeiSutter MF-800Verwendung zur Herstellung von Mikromanipulationsnadeln
NadelabzieherNanjing AibeiSutter Modell p-100Verwendung zur Herstellung von Mikromanipulationsnadeln
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Anwendung der ICSI-Injektionsnadel.
Piezoelektrischer Mikromanipulator (Membranbrecher)EppendorfEppendorf PiezoXpertVerwendung von Mikroimpulsen zum Aufbrechen der Zona pellucida und des Oolemma der Eizelle
Pneumatischer MikroinjektorEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Zur Fixierung der Eizelle
Gebrauchsfertiges humanes Choriongonadotropin (Hcg)Nanjing AibeiM2520Sterilisationsreagenz, intraperitoneale Injektion. 50 IE/ml
Gebrauchsfertiges Trächtigkeitsserum Gonadotropin (PMSG)Nanjing AibeiM2620Sterilisationsreagenz, intraperitoneale Injektion. 50 I.E./ml
StereomikroskopOlympusSZX7Eizellentnahme und Beobachtung der Embryonalentwicklung
Embryokultur-Dissektionsmikroskop wird

Referenzen

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