Eine Reihe von in situ informierten simulierten Medienformaten für die Kultivierung umweltbedingt erworbener anaerober Mikroorganismen

Die meisten Mikroorganismen bleiben unkultiviert; Dies wird durch die große Ungleichheit zwischen den mikroskopisch beobachteten Zellen im Gegensatz zu den wenigen Mikroorganismen unterstützt, die erfolgreich mit Agarplatten kultiviert wurden. Staley und Konopka nannten diese Diskrepanz die "Great Plate Count Anomaly"¹. Die geschätzte unberücksichtigte Diversität wird durch metagenomische und metatranskriptomische Daten gestützt, die zeigen, dass viele neue Gattungen in Rangabundanzkurven aus verschiedenen Umgebungen verteilt sind². Mikroorganismen, die beobachtet wurden (in der Regel durch zufällige Sequenzierung einer mikrobiellen Gemeinschaft), aber nicht kultiviert wurden, wurden als "mikrobielle dunkle Materie" ^{bezeichnet3,4}.

Im Zeitalter der -omics ist die Kultivierung von Mikroorganismen nach wie vor unerlässlich, um genomische Daten vollständig auszuwerten und die Funktion/den Phänotyp der vorhandenen Gene zu überprüfen. Die Sequenzierung kultivierter Mikroorganismen ist immer noch der einzige Weg, um sicher vollständige Genome zu erhalten, bis Technologien wie Schrotflinten-Metagenomik und Metagenom-assemblierte Genome aus der Umwelt zulässig unfehlbar werden⁵. Genomische Bewertungen in Verbindung mit kultivierten Mikroorganismen liefern starke Schlussfolgerungen für das Verständnis der "mikrobiellen dunklen Materie". Viele Mitglieder der "mikrobiellen Dunklen Materie" erfüllen entscheidende Funktionen, die den Kreislauf von Nährstoffen und anderen Elementen sowie die Produktion wertvoller Naturprodukte beeinflussen, ökologische Systeme unterstützen und ökologische Dienstleistungen erbringen. Aus medizinischer Sicht sind etwa die Hälfte aller derzeit vermarkteten Arzneimittel Produkte und Derivate von Produkten aus Bakterien, und es wird vermutet, dass die Profilierung unkultivierter Spezies die Antibiotika der Zukunft aufzeigt. Um Zugang zu dieser unkultivierten Mehrheit zu erhalten, muss eine Vielzahl von Kultivierungsmethoden erweitert werden⁶. Unter den Mitgliedern der "mikrobiellen dunklen Materie" werden anaerobe oligotrophe Mikroorganismen weitgehend unterschätzt und verfügen wahrscheinlich über ökologisch und industriell wertvolle biochemische Signalwege⁷, was sie zu wichtigen Zielen der Kultivierung macht. Anaerobe oligotrophe Mikroorganismen sind jedoch schwieriger zu kultivieren als ihre aeroben und copiotrophen Gegenstücke, da oft längere Inkubationszeiten, anspruchsvolle Bedingungen (z. B. bestimmte nicht standardmäßige In-vitro-Temperaturen ) und die Verwendung spezieller Medienrezepturen erforderlich sind.

Aktuelle Entwicklungstechniken zur Kultivierung von Mitgliedern der "mikrobiellen dunklen Materie", einschließlich neuartiger anaerober oligotropher Mikroorganismen, haben unser Verständnis erheblich verbessert und die Repräsentation dieser Mikroorganismen innerhalb des phylogenetischen Baums erhöht. Aktuelle Techniken, die informierte Medien zur Kultivierung neuartiger Mikroorganismen verwenden (d. h. Medien, die aus dem Wissen über den/die interessierenden Mikroorganismus gewonnen werden), können in drei verschiedene Methoden unterteilt werden. Die erste der Methoden beinhaltet die direkte Entfernung eines diskreten Abschnitts der Umgebung für den Transfer in eine In-vitro-Wachstumskammer, die die interessierenden Mikroorganismen bereits in einer Membran enthält. Der diskrete Abschnitt (z. B. Meerwasser) dient dazu, den interessierenden Mikroorganismen den geochemischen Lebensraum zu bieten, den sie in situ nutzen, während die Membran die Bewegung der Zellen stoppt (die interessierenden Zellen bleiben drinnen; fremde Zellen, die mit dem diskreten Abschnitt angekommen sind, bleiben ohne). Durch die Einbeziehung von Verbindungen, die natürlich verfügbar sind, um Mikroorganismen in ihrem natürlichen Lebensraum zu bekämpfen, können solche Mikroorganismen kultiviert werden⁸. Die zweite Methode nutzt Metatranskriptomik oder Genomik, um metabolische Fähigkeiten aufzuklären und Hinweise auf enge Kultivierungsparameter für ein gezieltes Mediumdesign zu liefern. Dieser Ansatz liefert ein ökophysiologisches Profil, mit dem die Anreicherung bestimmter Arten von Mikroorganismen aus einer Umgebung gezielt erreicht werden kann. Die Bestimmungen des Mediums sind auf die identifizierten vorhandenen Gene ausgerichtet, von denen angenommen wird, dass sie den/die Zielmikroorganismus(en) unterstützen, um die Anreicherungsvielfalt zu ^{reduzieren,9,10}. Ein Vorbehalt ist, dass genomische Informationen nicht direkt auf die Expression von Genen schließen, während transkriptomische Informationen dies tun.

Die dritte Methode umfasst umweltinformierte und simulierte Medien, die sich von der ersten Methode unterscheidet, die die Medien nicht simuliert, sondern die Umwelt direkt als Medienquelle nutzt. Diese dritte Methode erfordert eine Umwelterkundung der Geochemie eines Feldstandorts, der Mikroorganismen von Interesse enthält. Mit diesem Wissen werden Primärkomponenten und physikalische Parameter identifiziert, um ein umweltbewusstes simuliertes Medium herzustellen. Das Medium erhält dann eine direkte Infusion von Mikroorganismen-haltigen Sedimenten oder Flüssigkeiten aus der Umgebung in das Medium. Diese Methode ist von besonderem Wert in Fällen, in denen der kultivierende Mikrobiologe weder Zugang zu ausreichenden Mengen an Quellumgebung (wie für die erste Methode erforderlich) noch zu geeigneten metatranskriptomischen oder genomischen Daten (wie für die zweite Methode erforderlich) hat.

Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für die dritte Methode; Es basiert auf interessanten Umgebungen und zielt darauf ab, diese zu simulieren. Drei naive Medienrezepte, die auf verschiedene im Feld erworbene anaerobe Mikroorganismenkulturen abzielen, werden parallel im Protokoll vorgestellt. Bei den drei vertretenen Kulturen handelt es sich um Mischkulturen, die aus dem Boden stammen (im Folgenden "Bodenmischkultur"), Mischkulturen, die aus einem Bohrloch stammen (im Folgenden "Bohrlochmischkultur") und um ein isoliertes Methanogen, das aus einem Bohrloch stammt (im Folgenden "isoliertes Methanogen" aus dem Bohrloch). Die zusammengesetzten Identitäten und Mengen in den hier geteilten Medienrezepten sind als erster Leitfaden gedacht; Sie können und werden ermutigt, an die Umgebung und die interessierenden Mikroorganismen des Lesers angepasst zu werden.

1. Herstellung eines anpassbaren anaeroben flüssigen Mediums

1. Medium für Kulturflaschen (Herstellung von 500 ml)
   1. Messen und fügen Sie Verbindungen in eine 1-Liter-Flasche hinzu und passen Sie den pH-Wert mithilfe der Spalte in Tabelle 1 an, die der interessierenden Kultur des Lesers entspricht (die Mengen in Tabelle 1 sind für die Produktion von 1.000 ml aufgezeichnet, entsprechend anpassen). Mischen Sie die Mischungen durch Schwenken der Flasche, um homogen zu sein.
   2. Erhitzen Sie die Flüssigkeit zum Kochen, indem Sie die Flasche 5-6 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzen. Öffnen Sie die Mikrowelle häufig und schwenken Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einem hitzebeständigen Handschuh. Öffnen Sie die Mikrowelle schnell, wenn die Flüssigkeit nach dem Blasen still wird. Andernfalls kann sich die Flüssigkeit schnell ausdehnen und die Flasche überlaufen.
   3. Befestigen Sie eine sterile 10-ml-Glaspipette an einem N 2-Gasverteileraufbau (basierend auf dem Design von Balch et ^al.11, obwohl keine beheizte Kupfersäule für N₂ -Gas der Reinheit erforderlich ist; siehe Zusatzdatei 1 für weitere Informationen zu Gasverteilern). Öffnen Sie den Verteiler, um O₂ zu entlüften, und lassen Sie N₂ -Gas ausströmen.
   4. Legen Sie die Pipettenspitze in die Flüssigkeit und stellen Sie den Gasstrom so ein, dass die Blasen mäßig stark sind. Spülen Sie die Flüssigkeit mit N₂ , bis die Flasche nicht mehr zu heiß ist, um sie anzufassen.
      HINWEIS: Dies hängt vom Inhalt des Mediums ab, dauert aber in der Regel ~20 Minuten.
   5. Während Sie auf das Abkühlen der Flasche warten, stellen Sie 10 sterile 100-ml-Kulturflaschen bereit; oder wenn Sie Medien für die Entnahme von Bodenmischkulturen vorbereiten, stellen Sie zwei sterile 500-ml-Flaschen bereit.
   6. Sobald sich die Medienflasche kühl anfühlt, ziehen Sie die Pipettenspitze nach oben in den Kopfraum der Flasche. Fügen Sie 0,125 g NaHCO₃ und 0,300 g Na₂S∙9 H₂O hinzu und warten Sie, bis Resazurin farblos wird.
      ACHTUNG: Na₂S∙9 H₂O ist ätzend, giftig und reizend. Verwenden Sie beim Umgang mit Metallwerkzeugen persönliche Schutzausrüstung und spülen Sie Metallwerkzeuge nach Kontakt gründlich ab.
   7. Während Sie darauf warten, dass Resazurin seine Farbe ändert, befestigen Sie Metallkanülen am Gasverteiler und legen Sie die Kanülenspitzen in Kulturflaschen. Stellen Sie den Durchfluss von N₂ in die Flaschen auf eine moderate Geschwindigkeit ein, damit die im folgenden Schritt zugegebene Flüssigkeit nicht durch den Gasfluss herumschwappt.
   8. Sobald Resazurin farblos ist, aliquotieren Sie 50 ml Flüssigkeit in jede Kulturflasche oder 250 ml Flüssigkeit in jede 500-ml-Flasche.
   9. Verschließen Sie jede Flasche sofort nach dem Entfernen der Kanülen mit einem Gummistopfen in passender Größe. Sichern Sie den Stopfen mit einer Aluminiumdichtung (für Kulturflaschen) oder einem oben offenen GL45-Schraubverschluss (für 500-ml-Flaschen).
   10. Legen Sie die Flaschen in einen autoklavierbaren Behälter und füllen Sie den Behälter mit Leitungswasser, bis der Wasserstand mit dem in den Flaschen übereinstimmt.
       HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass die Flaschen nicht aufgrund von Belastungen durch Temperaturunterschiede auf dem Glas während des Autoklavierens platzen.
   11. Autoklavieren Sie die Flaschen bei 121 °C für 30 min.
2. Medium für Bioreaktor (Produktion von 8 L)
   1. Zubereitung von Ballonflaschen
      1. Öffnen Sie das Ventil eines 1/4" (6,4 mm) Schlauchtüllen-Kugelhahns. Befestigen Sie zwei 6 cm lange Silikonschläuche mit einem Innendurchmesser von 1/4" (6,4 mm) und einem Außendurchmesser von 1/2" (12,7 mm) an beiden Enden des Kugelhahns mit Schlauchtülle.
      2. Befestigen Sie an einem Ende der Baugruppe eine 5/16"-1/4" (7,9 mm-6,4 mm) Schlauchtülle. Befestigen Sie das andere Ende der Baugruppe an der Schlauchtülle einer 8-Liter-Ballonflasche.
      3. Verwenden Sie einen Kabelbinder, um die Verbindung zwischen der Schlauchtülle der Ballonflasche und dem Schlauch sowie die Verbindung zwischen der Schlauchtülle und dem Schlauch zu sichern.
      4. Autoklavieren Sie die Ballonflasche mit Montage bei 121 °C für 30 min.
   2. Mittlere Produktion
      1. Schließen Sie das Ventil des Schlauchtülle-Kugelhahns an der 8-Liter-Ballonbaugruppe.
      2. Messen und fügen Sie der 8-Liter-Ballonflasche Verbindungen hinzu und passen Sie den pH-Wert mithilfe der Spalte in Tabelle 1 an, die der interessierenden Kultur des Lesers entspricht (die Mengen in Tabelle 1 sind für die Produktion von 1.000 ml aufgezeichnet, entsprechend anpassen). Fügen Sie einen Rührstab hinzu und verwenden Sie eine Rührplatte, um die Verbindungen homogen zu mischen.
      3. Die Flüssigkeit mit der Rührplatte zum Kochen bringen. Die Flüssigkeit 30 min kochen lassen.
         Anmerkungen: Das Erhitzen der Flüssigkeit bis zum Sieden hängt vom Inhalt des Mediums ab, kann jedoch 2-3 Stunden dauern.
      4. Befestigen Sie eine sterile 10-ml-Glaspipette an einem N 2-Gasverteileraufbau (basierend auf dem Design von Balch et ^al.11, obwohl keine beheizte Kupfersäule für N₂ -Gas der Reinheit erforderlich ist; siehe Zusatzdatei 1 für weitere Informationen zu Gasverteilern). Öffnen Sie den Verteiler, um O₂ zu entlüften, und lassen Sie N₂ -Gas ausströmen.
      5. Schalten Sie die Hitze aus, stecken Sie dann die Pipettenspitze in die Flüssigkeit und stellen Sie den Gasfluss so ein, dass die Blasen mäßig kräftig sind, aber nicht überlaufen. Spülen Sie die Flüssigkeit 30 Minuten lang mit N₂ .
      6. Ziehen Sie die Pipettenspitze nach oben in den Kopfraum der Ballonflasche. Fügen Sie 2,0 g NaHCO₃ und 4,8 g Na₂S∙9 H₂O hinzu und warten Sie, bis Resazurin farblos wird.
         ACHTUNG: Na₂S∙9 H₂O ist ätzend, giftig und reizend. Verwenden Sie beim Umgang mit Metallwerkzeugen persönliche Schutzausrüstung und spülen Sie Metallwerkzeuge nach Kontakt gründlich ab.
      7. Sobald Resazurin farblos ist, entfernen Sie die Glaspipette und verschließen Sie die Ballonflasche sofort mit einem #10-Stopfen. Drehen Sie einen Draht über den Stopfen und um die Lippe der Ballonflasche, um den Stopfen zu sichern.

2. In-situ-Erfassung von anaeroben Mikroorganismen aus der Umwelt

1. Anaerobe Probenentnahme an der Oberfläche (Bodenmischkultur)
   1. Bringen Sie die Flasche(n) mit gemischten Bodenkulturmedien, die wie oben hergestellt wurden, und einen Ausleser ins Feld.
      HINWEIS: Ein Giddings 2 5/8" Standard-Kegel-Bodenbohrer wird von den Autoren verwendet (Materialtabelle). Es kann jedoch jeder Bodenbohrer oder jede Kelle verwendet werden, die bis zur gewünschten Tiefe beprobt werden kann.
   2. Schieben Sie den Greifer in das Sediment, bis die Oberseite des Probenentnahmezylinders bündig mit der Oberfläche des Sediments abschließt.
   3. Drehen Sie den Entkerner um 90°, um den Kern freizugeben, und ziehen Sie ihn nach oben, bis die Probe aus der Umgebung entnommen ist.
   4. Decken Sie in lockeren Sedimenten (wie sie bei der Beprobung von Feuchtgebieten auftreten können) die Basis des Kerns während der Entnahme mit einer neuen Nitrilhandschuhhand ab, um zu verhindern, dass die Probe herausfällt oder sich bei der Entnahme im Wasser verteilt.
   5. Schnell mit dem Auge 6-7 cm von der Basis des Kerns annähern. Verwenden Sie eine neue Hand mit Nitrilhandschuhen, um in den Kern zu schneiden und die unteren 6-7 cm zu trennen.
   6. Übertragen Sie sofort den Boden des Kerns in die Kulturflasche. Wenn der Boden/das Sediment zu groß ist, formen Sie es schnell so, dass es leichter in die Flasche passt, um die Exposition gegenüber der aeroben Atmosphäre so weit wie möglich zu minimieren.
   7. Sobald die Probe übertragen ist, positionieren Sie den Stopfen sofort wieder und halten Sie ihn mit einem Schraubverschluss fest.
   8. Halten Sie die Probe kühl. Kühlen Sie die Auffangflasche bei 4 °C bei der Rückkehr ins Labor.
2. Anaerobe Probenentnahme unter der Oberfläche (Bohrloch-Mischkultur)
   1. Stellen Sie eine sterile 1-Liter-Flasche neben den Gasverteiler. Verschließen Sie die Flasche mit einem Gummistopfen. 100% Ethanol auf den Stopfen tropfen und mit einem Feuerzeug anzünden.
   2. Befestigen Sie eine sterile 23-G-Nadel an der N 2-Gasverteileraufstellung. Öffnen Sie den Verteiler, um O₂ zu entlüften, und lassen Sie N₂ (oder Ar) Gas mit mäßiger Geschwindigkeit ausströmen.
   3. Sobald der Stopfen nicht mehr brennt, führen Sie die Nadel in die Flasche ein. Führen Sie eine zweite sterile 23-G-Nadel, die nicht am Gasverteiler befestigt ist, in die Flasche ein. Spülen Sie die Flasche 1-2 Min. lang.
   4. Ziehen Sie die Nadel heraus, die nicht am Gasverteiler befestigt ist. Die Flasche 1 Minute lang unter Druck setzen. Ziehen Sie die restliche Nadel heraus.
   5. Bringen Sie die Druckflasche und eine sterilisierte 23-G-Nadel zur Bohrlochstelle. Saugen Sie Flüssigkeit aus dem Bohrloch nach den Methoden von Merino et ^al.12.
      HINWEIS: Abhängig von der Methode, dem Anschluss und der Durchflussmenge des Bohrlochs ändert sich dadurch die Strategie zur Entnahme einer Wasserprobe. Bei kontinuierlichem Wasserfluss Wasser wie in Schritt 2.2.6 beschrieben. ausreichen. Wenn der Wasserfluss chargenweise gesammelt wird oder ein geringer Durchfluss ist, kann eine alternative Einlass-/Auslassmethode verwendet werden. Minimieren Sie in allen Situationen die Kontamination und versuchen Sie sicherzustellen, dass die entnommene Probe repräsentativ für die Umgebung ist, in der die Probe entnommen werden soll. Dies ist eine weitgehend verallgemeinerte Aussage, da die Autoren die Erfahrung gemacht haben, dass jede Probensammlung von staatlichen oder privaten Websites in hohem Maße an die verfügbare Zugänglichkeit angepasst werden musste.
   6. Öffnen Sie schnell die Flasche, pumpen Sie Flüssigkeit ein, um die Flasche vollständig zu füllen, und schließen Sie die Flasche.
   7. Führen Sie die mitgebrachte 23-G-Nadel in den Gummistopfen der Flasche ein, um den Druck in der Flasche zu verringern. Ziehen Sie die Nadel heraus.
   8. Halten Sie die Probe kühl. Kühlen Sie die Auffangflasche bei 4 °C bei der Rückkehr ins Labor.

3. In-vitro-Wachstum von im Freiland erworbenen anaeroben Mikroorganismen

1. Wachstum pro Kulturflasche
   1. Stellen Sie eine sterile Flasche mit N₂ mit Stopfen und die wie oben vorbereiteten Kulturflaschen und die Auffangflasche bereit. 100% Ethanol auf die Stopfen tropfen und mit einem Feuerzeug anzünden.
   2. Montieren Sie eine 23-g-Nadel auf eine 1-ml-Spritze. Sobald die Stopfen nicht mehr brennen, führen Sie die Nadel in die N_2-Flasche ein und ziehen Sie ~1 ml N₂ auf. Ziehen Sie die Nadel heraus.
   3. Drücken Sie langsam auf den Kolben, um den N₂ zu lösen. Sobald die Spritze leer ist, führen Sie die Nadel in die Auffangflasche ein und entnehmen Sie 0,5 ml der Umgebungsprobe. Ziehen Sie die Nadel heraus.
   4. Führen Sie die Nadel in die Kulturflasche ein und injizieren Sie die Probe. Ziehen Sie die Nadel heraus.
   5. Schwenken Sie die Flasche und legen Sie sie bei Temperatur in einen Inkubator, wie in Tabelle 1 oder in der interessierenden Umgebung des Lesers angegeben.
      HINWEIS: Der Kulturfortschritt (entweder Flasche oder Bioreaktor) wird mit einem 0,02 mm tiefen Petroff-Hauser-Hämozytometer überwacht. Anreicherungen von anaeroben oder anspruchsvollen Mikroorganismen erreichen in der Regel keine Zelldichten, bei denen OD₆₀₀ verwendet werden kann, und andere Nachweismethoden sind für die routinemäßige und wiederholte Überwachung unpraktisch. Nachweisgrenzen, Qualitätskontrolle und statistische Berechnungen hängen von der Art der Zellzählkammer und den Bedürfnissen des Benutzers ab.
2. Wachstum durch Bioreaktor
   1. Präparation eines Ballons mit einer modifizierten Spritze
      1. Entfernen Sie den Kolben von drei 10-ml-Luer-Lock-Spritzen (eine für jede Endmontage). Schneiden Sie den Flansch von jeder Spritze ab und feilen Sie das abgetrennte Ende, damit es die Ballons nicht durchbohrt. Reinigen Sie alle gefeilten Späne aus der modifizierten Spritze.
      2. Bereiten Sie einen doppelten Ballon vor, indem Sie einen Ballon in einen anderen legen.
      3. Dehnen Sie das Ende des verdoppelten Ballons über die modifizierte 10-ml-Spritze.
      4. Trennen Sie das Ende des äußeren Ballons leicht vom inneren Ballon. Drücken Sie die gesamte Luft aus, die zwischen den Ballons eingeschlossen ist.
      5. Ziehen Sie einen Kabelbinder um die Basis der Ballons fest, um die Ballons an der Spritze zu befestigen.
   2. Vorbereitung eines modifizierten Stopfens
      1. Entfernen Sie die Kolben von zehn 1-ml-Luer-Lock-Spritzen (zwei für jeden zu ändernden Stopfen). Schneiden Sie den Flansch von den Spritzen ab.
      2. Legen Sie zwei Gummistopfen der Größe #10 (für 8-Liter-Ballonflaschen) und drei für Flaschen mit GL45-Gewinde (für Auffangflaschen) bereit. Bohren Sie mit einem 1/4" (6,4 mm) Bohrer zwei Löcher durch die Oberseite jedes Gummistopfens, die breit genug sind, damit die modifizierten Spritzen passen, und schmal genug, damit die Passform luftdicht ist.
      3. Führen Sie die modifizierten Spritzen durch die Löcher des Gummistopfens.
      4. Reinigen und autoklavieren Sie den modifizierten Stopfen bei 121 °C für 30 min.
   3. Vorbereitung der Bioreaktorbaugruppe
      1. Desinfizieren Sie alle Absperrhähne, weibliche Luer-Lock-Adapteranschlüsse und andere nicht autoklavierbare Bioreaktormaterialien mit 70 % Ethanol und autoklavieren Sie 30 Minuten lang bei 121 °C alle Schläuche (nach dem Ablängen), Stopfen, Glaswolle und andere autoklavierbare Bioreaktormaterialien.
      2. Stellen Sie einen sterilen Bioreaktor (Abbildung 1 und Abbildung 2) auf einen Ringständer und sichern Sie ihn mit einem Kettenband. Stellen Sie außerdem ein Wasserbad, eine Schlauchpumpe, die mit Stopfen versehene 8-Liter-Ballonflasche mit Medium (aus Protokollschritt 1.2), eine 3,5-Liter-Flasche (Auffangflasche ohne Probenahme) und eine 500-ml-Flasche (Auffangflasche für die Probenahme) bereit.
      3. Stoppen der Ballonflasche
         1. Legen Sie einen Ballon mit einer modifizierten Spritze aus. Schließen Sie einen Dreiwegehahn an die Luer-Lock-Spitze der Spritze an.
         2. Nehmen Sie die Ballonbaugruppe und verbinden Sie den Dreiwegehahn mit dem Schlauch eines Tanks mit N₂. Drehen Sie den Dreiwegehahn, um das zur Atmosphäre hin offene Ende zu blockieren.
         3. Öffnen Sie den Gastank und füllen Sie den Ballon mit N₂. Sobald er voll ist, drehen Sie den Dreiwegehahn, um das Ende des Ballons zu blockieren. Schließen Sie den Gastank und trennen Sie den Tankschlauch vom Dreiwegehahn.
         4. Schließen Sie nacheinander Folgendes an: einen Dreiwegehahn (des Ballons mit der modifizierten Spritze), einen Zweiwegehahn, eine weibliche Luer-Lock-Adapterkupplung und die Luer-Lock-Spitze einer der Spritzen des modifizierten Stopfens.
         5. Schließen Sie einen Zwei-Wege-Absperrhahn an die Luer-Lock-Spitze der anderen Spritze an. Schließen Sie beide Ventile der Zweiwegehähne an der modifizierten Stopperbaugruppe.
         6. Drehen Sie den Draht auf, der den unveränderten Stopfen der Ballongröße #10 hält. Ersetzen Sie schnell den unveränderten Stopper durch die modifizierte Stopperbaugruppe und verdrehen Sie den Draht wie zuvor, um die modifizierte Stopperbaugruppe an der Ballonflasche zu befestigen.
            HINWEIS: Wenn Sie sicher und vorbereitet sind, kann die modifizierte Stopperbaugruppe verwendet werden, um die Ballonflasche im letzten Schritt der Mediumvorbereitung (Schritt 1.2.2.7) zu verschließen.
         7. Drehen Sie den Dreiwegehahn, um das zur Atmosphäre hin offene Ende zu blockieren. Öffnen Sie den nacheinander angeordneten Zweiwegehahn. Das Gas des Ballons und der Kopfraum der 8-Liter-Ballonflasche sind nun miteinander verbunden.
      4. Verschließen der Nichtprobenahme- und Probenahme-Auffangflaschen
         1. Stopfen Sie die 3,5-Liter-Auffangflasche ohne Probenahme mit einem modifizierten Stopfen, der für Flaschen mit GL45-Gewinde ausgelegt ist, und tragen Sie 70% Ethanol auf den Boden des Stopfens auf, um ihn in die Flasche zu passen. Verschließen Sie die Flasche mit einem oben offenen GL45-Schraubverschluss.
         2. Schließen Sie nacheinander Folgendes an: einen Ballon mit der Luer-Lock-Spitze der modifizierten Spritze, einen Drei-Wege-Absperrhahn, eine weibliche Luer-Lock-Adapterkupplung und die Luer-Lock-Spitze einer der modifizierten Stopfenspritzen. Drehen Sie den Dreiwegehahn, um das Ende direkt zur Atmosphäre hin offen zu blockieren.
         3. Schließen Sie an die Luer-Lock-Spitze der anderen Spritze eine weibliche Luer-Lock-Adapterkupplung an.
         4. Wiederholen Sie die obigen drei Schritte für die 500-ml-Probenauffangflasche.
      5. Aufbau von Schläuchen
         1. Messen Sie den Abstand zwischen den Anschlüssen des Bioreaktor-Wassermantels und den Tüllen des Wasserbadschlauchs. Schneiden Sie zwei Längen von Silikonschläuchen mit einem Innendurchmesser von 3/16" (4,8 mm) und einem Außendurchmesser von 3/8" (9,5 mm) ab, um diese Distanz zu überbrücken.
         2. Montieren Sie zwei gerade Schlauchanschlüsse mit oben offenen GL14-Schraubkappen. Befestigen Sie sie jeweils an einem Ende der beiden Schlauchstücke.
         3. Drehen Sie die Schraubverschlüsse auf die Anschlüsse des Bioreaktor-Wassermantels. Befestigen Sie die anderen Enden des Schlauchs an den Schlauchtüllen des Wasserbads, so dass das Wasser aus dem Wasserbad fließt, am Boden des Bioreaktor-Wassermantels eindringt, oben am Wassermantel austritt und zum Wasserbad zurückkehrt. Ziehen Sie Kabelbinder um die Enden des Schlauchs fest, um den Schlauch an den Schlauchtüllen des Wasserbads zu befestigen.
         4. Bei Pumpen, die der VWR Ultra Low Flow Mini-Pumpe mit variablem Durchfluss ähneln, fädeln Sie die zugehörige 3/16" (4,8 mm) Außendurchmesser-Schlitzschlauchbaugruppe durch die Pumpe.
         5. Messen Sie den Abstand zwischen der Ballonschlauchbaugruppe und der Schlauchbaugruppe der Schlauchpumpe. Schneiden Sie einen Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 3/16" (4,8 mm) und einem Außendurchmesser von 3/8" (9,5 mm) ab, um diese Distanz zu überbrücken.
         6. Befestigen Sie ein Ende des Schlauchs an der Schlauchtülle der Ballonschlauchbaugruppe und das andere an der Schlauchtülle der Schlauchbaugruppe der Schlauchbaugruppe, so ausgerichtet, dass das Medium von der Ballonflasche durch die Schlauchpumpe fließt.
         7. Messen Sie den Abstand zwischen der Schlauchbaugruppe der Schlauchpumpe und dem unteren Anschluss des Bioreaktors. Schneiden Sie einen Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 3/16" (4,8 mm) und einem Außendurchmesser von 3/8" (9,5 mm) ab, um diese Distanz zu überbrücken.
         8. Befestigen Sie ein Ende dieses Schlauchs an der Schlauchtülle der Schlauchbaugruppe der Schlauchpumpe und befestigen Sie das andere vorsichtig am unteren Anschluss des Bioreaktors. Achten Sie darauf, das Glas nicht zu zerbrechen, aber auch um die Verbindung zu sichern, ziehen Sie einen Kabelbinder um das Ende des Schlauchs fest, um den Schlauch am unteren Anschluss des Bioreaktors zu befestigen.
         9. Messen und schneiden Sie ca. 5" (127 mm) Länge von 3/16" (4,8 mm) Innendurchmesser, 3/8" (9,5 mm) Außendurchmesser Silikonschlauch.
         10. Befestigen Sie eine Luer-Lock-Adapterbuchse an einem Dreiwegehahn. Befestigen Sie ein beliebiges Ende des Dreiwegehahns am Schlauch.
         11. Montieren Sie einen abgewinkelten Schlauchanschluss mit oben offenem GL14-Schraubverschluss. Befestigen Sie es am anderen Ende des Schlauchs.
         12. Drehen Sie den Schraubverschluss auf den obersten vertikalen Anschluss des Bioreaktors. Drehen Sie den Dreiwegehahn, um das zum Bioreaktor zeigende Ende zu blockieren.
         13. Messen Sie den Abstand zwischen der obersten vertikalen Anschlussbaugruppe und der nicht beprobten Auffangflaschenbaugruppe. Schneiden Sie einen Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 3/16" (4,8 mm) und einem Außendurchmesser von 3/8" (9,5 mm) ab, um diese Distanz zu überbrücken. Schneiden Sie die Flansche von zwei 1-ml-Luer-Lock-Spritzen ab und führen Sie sie in die Enden des Schlauchs ein.
         14. Befestigen Sie ein Ende dieser Schlauchbaugruppe am Dreiwegehahn der obersten vertikalen Anschlussbaugruppe und befestigen Sie das andere Ende am weiblichen Luer-Lock-Adapteranschluss an der Nicht-Probenahme-Auffangflaschenbaugruppe.
         15. Messen Sie den Abstand zwischen der obersten vertikalen Anschlussbaugruppe und der Probenahmeauffangflasche. Schneiden Sie einen Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 3/16" (4,8 mm) und einem Außendurchmesser von 3/8" (9,5 mm) ab, um diese Distanz zu überbrücken. Schneiden Sie die Flansche von zwei 1-ml-Luer-Lock-Spritzen ab und führen Sie sie in die Enden des Schlauchs ein.
         16. Befestigen Sie ein Ende dieser Schlauchbaugruppe am Dreiwegehahn der obersten vertikalen Anschlussbaugruppe und das andere am weiblichen Luer-Lock-Adapter an der Probenahmeflaschenbaugruppe.
   4. Befüllung des Bioreaktors
      1. Verschließen Sie einen der GL18-Anschlüsse des Bioreaktors mit einem weißen Gummiseptum. Verschließen Sie den anderen GL18-Anschluss und die verbleibenden vertikal freiliegenden GL14-Anschlüsse mit GL18/GL14-beschichteten Silikonsepten (PTFE gegenüber dem Glas) und offenen Schraubkappen.
      2. Mit einem 50 cm langen Stab 0,9 g Glaswolle in den Boden des Bioreaktors packen.
      3. 1,3 l Sand bei 121 °C für 30 min autoklavieren. Füllen Sie den Bioreaktor mit einem Trichter mit dem Sand.
         HINWEIS: Andere Sedimenttypen, die von der Umgebung des Lesers und den interessierenden Mikroorganismen beeinflusst werden, können hier ersetzt werden.
      4. Legen Sie den Schlauch zu einem Tank mit N₂ oben in den Bioreaktor und spülen Sie den Kopfraum des Bioreaktors 2 Minuten lang mit N₂ . Verschließen Sie den Bioreaktor sofort mit einem Stopfen der Größe #7 und einem oben offenen GL45-Schraubverschluss.
      5. Trennen Sie den Schlauch von der Auffangflasche ohne Probenahme und drehen Sie den Dreiwegehahn, um das zum Ballon zeigende Ende zu blockieren. Verbinden Sie den Schlauch mit einem Tank von N₂ mit dem weiblichen Luer-Lock-Adapteranschluss und spülen Sie den Kopfraum des Bioreaktors 2 Minuten lang mit N₂ . Schließen Sie die Schläuche sofort wieder an und bringen Sie den Dreiwegehahn wieder zurück, um das zur Atmosphäre hin offene Ende zu blockieren.
      6. Wiederholen Sie den obigen Schritt für die Probenauffangflasche.
      7. Drehen Sie den Dreiwegehahn der obersten vertikalen Öffnung des Bioreaktors, um das Ende der Probenahmeauffangflasche zu blockieren. Pumpen Sie Flüssigkeit aus der Ballonflasche in den Bioreaktor. Halten Sie die Pumpe an, entlüften Sie den Ballon der Probenahmeflasche und füllen Sie den Ballonballon nach Bedarf mit N₂ .
      8. Sobald der Bioreaktor mit dem Medium gefüllt ist, stellen Sie die Pumpendurchflussrate auf 0,6 ml/min ein (digitaler Wert von 40 bei der Minipumpe).
         HINWEIS: Andere vom Lesegerät gewünschte Durchflussraten können hier ersetzt werden.
      9. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur gemäß Tabelle 1 oder der interessierenden Umgebung des Lesers ein.
         HINWEIS: Inoculum kann zu diesem Zeitpunkt oder später hinzugefügt werden, abhängig von den Besonderheiten der Studie. Wenn Sie an dieser Stelle impfen, fahren Sie mit Schritt 3.2.4.10 fort. Wenn Sie später impfen, fahren Sie mit Schritt 3.2.5 fort.
      10. Stellen Sie eine Auffangflasche oder eine beimpfte Kulturflasche und eine sterile Flasche mit N₂ mit Verschluss bereit. 100% Ethanol auf die Stopfen tropfen und mit einem Feuerzeug anzünden.
      11. Montieren Sie eine 23-g-Nadel auf eine 60-ml-Spritze. Sobald die Stopfen nicht mehr brennen, führen Sie die Nadel in die N_2-Flasche ein und ziehen Sie ~50 ml N₂ auf. Ziehen Sie die Nadel heraus.
      12. Drücken Sie langsam auf den Kolben, um den N₂ zu lösen. Sobald die Spritze leer ist, führen Sie die Nadel in die Sammelflasche ein und entnehmen Sie 50 ml der Umgebungsprobe. Ziehen Sie die Nadel heraus.
      13. Tauschen Sie die 23 G-Nadel gegen eine sterile lange Metallnadel (Kanüle, Länge 31,5 cm) aus. Führen Sie die lange Metallnadel durch das weiße Gummiseptum am GL18-Anschluss des Bioreaktors ein.
      14. Drücken Sie die Nadel in das Sediment und injizieren Sie das Inokulum. Ziehen Sie die Nadel heraus.
   5. Laufende Wartung von Bioreaktoren
      1. Führen Sie an jedem Tag, an dem der Bioreaktor läuft, Folgendes durch:
         1. Überprüfen Sie den Wasserbadstand. Wenn niedrig, fügen Sie mehr Wasser hinzu (verwenden Sie destilliertes Wasser für die Langlebigkeit der Geräte, indem Sie Korrosion und Mineralablagerungen reduzieren).
         2. Überprüfen Sie den Ballon der Auffangflasche ohne Probenahme; Ein voller Ballon hemmt den Fluss des Mediums. Wenn er voll ist, drehen Sie den Dreiwegehahn, um das zur Fangflasche zeigende Ende zu blockieren. Drücken Sie den Ballon, um ihn zu leeren; Bringen Sie dann den Dreiwegehahn zurück, um das zur Atmosphäre offene Ende zu blockieren. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Ballon leer ist.
         3. Überprüfen Sie den Ballon der 8-Liter-Ballonflasche. Wenn niedrig, schließen Sie den hintereinander angeordneten Zweiwegehahn und trennen Sie den Dreiwegehahn vom Zweiwegehahn. Füllen Sie die Ballonbaugruppe wieder auf und befestigen Sie sie erneut, indem Sie die Schritte 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 und 3.2.3.3.7 befolgen.
         4. Überprüfen Sie den Füllstand des Mediums in der 8-Liter-Ballonflasche. Bei niedrigem Pegel wird ein weiterer 8-Liter-Ballonflasche zusammengebaut und ein weiterer mittlerer Ballon gemäß den Protokollschritten 1.2 vorbereitet. und 3.2.3.3. Halten Sie die Pumpe an, schließen Sie den Schlauchtüllen Kugelhahn, trennen Sie schnell die alte Ballonflasche und schließen Sie die neue Ballonflasche an.
            HINWEIS: Für eine Durchflussrate von 0,6 ml/min wird alle 9 Tage ein neues Medium benötigt.
         5. Überprüfen Sie den Füllstand des Mediums in der nicht probenehmenden Auffangflasche. Wenn sie voll ist, wird eine weitere Auffangflasche ohne Probenahme gemäß Schritt 3.2.3.4.1 zusammengebaut. Spülen Sie die neue Flasche mit N₂, trennen Sie den Ballon mit der modifizierten Spritze und dem Schlauch schnell von der alten Flasche und verbinden Sie sie mit der neuen Flasche.
         6. Entfernen Sie den modifizierten Stopfen von einer vollen Auffangflasche ohne Probenahme. Autoklavieren Sie die Flüssigkeit 30 Minuten lang bei 121 °C; Entsorgen Sie dann die Flüssigkeit gemäß den institutionellen Richtlinien des Lesers. Reinigen und autoklavieren Sie alle Teile der nicht probenehmenden Auffangflaschenbaugruppe, um sie für den nächsten Gebrauch vorzubereiten.
      2. Führen Sie die Probenahme alle 7 (oder die vom Leser gewünschte Anzahl) Tage durch, indem Sie wie folgt vorgehen:
         1. Drehen Sie den Dreiwegehahn der obersten vertikalen Öffnung des Bioreaktors, um das Ende zu blockieren, das auf die nicht probenehmende Auffangflasche zeigt. Sammeln Sie 250 ml Flüssigkeit.
            HINWEIS: Bei einer Durchflussrate von 0,6 ml/min dauert das Sammeln von 250 ml ~7 h.
         2. Bringen Sie den Dreiwegehahn der obersten vertikalen Öffnung des Bioreaktors wieder zurück, um das Ende der Probenahmeauffangflasche zu blockieren. Trennen Sie den Schlauch und die Probenauffangflasche vom Dreiwegehahn des obersten vertikalen Anschlusses des Bioreaktors.
         3. Reinigen Sie nach dem Testen, Lagern und/oder ordnungsgemäßen Entsorgen der Probenahmeflüssigkeit alle Teile der Probenahmeauffangflasche mit Ausnahme des Ballons mit der modifizierten Spritze. Autoklavieren Sie alle Teile 30 Minuten lang bei 121 °C, mit Ausnahme des Ballons mit der modifizierten Spritze und den weiblichen Luer-Lock-Adapteranschlüssen. Für den nächsten Probenahmetag wieder zusammenbauen.
            HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, eine doppelte oder dreifache Redundanz von Teilen, Kappen, Schläuchen und Septen für eine schnelle Reparatur und einen schnellen Austausch bei Bedarf zu verwenden.

Hier zeigen wir die Ergebnisse einer Bioreaktorstudie unter Verwendung einer Bohrloch-Mischkulturmedium-Aufbereitungsmethode und einer Bioreaktor-Setup-Methode, wie hier beschrieben. Das Bohrloch-Mischkulturmedium wurde so modifiziert, dass es als Kohlenstoffquelle eine Aufschlämmung von Maiskolben enthält, die durch oxidative hydrothermale Auflösung (OHD) verarbeitet wurden13,14. Modifiziertes Bohrloch-Mischkulturmedium wurde 44 Tage lang mit einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/min in den Bioreaktor gepumpt. An Tag 23 wurde ein Inokulum aus Bohrloch BLM-1 in der Region Death Valley in Nevada, USA, hinzugefügt15. Flüssige Proben aus dem Bioreaktor wurden an den Tagen 1, 8, 15, 22, 23 (nach der Inokulation), 30, 37 und 44 in einer Probenauffangflasche gesammelt.

Um den allgemeinen Status der Inokulumkultur (und der überlebenden Bewohner des Bioreaktorsediments vor dem Inokulumautoklaven) zu verfolgen, wurden Bioreaktorflüssigkeitsproben durch direkte Zellzählungen beobachtet. Direkte Zellzählungen der entnommenen Flüssigkeit wurden mit einem Petroff-Hauser-Hämozytometer durchgeführt. Um die Identität der mikrobiellen Mitglieder des Bioreaktors zu erfahren, wurde DNA aus flüssigen Proben des Bioreaktors extrahiert und die 16S rRNA-Gene wurden durch Next Generation Sequencing (NGS) analysiert. Die NGS-Daten wurden intern mit mothur nach der MiSeq SOP16 verarbeitet.

Vor der Inokulation lagen die direkten Zellzahlen oft unter der Nachweisgrenze (b.d.l.) von 1,0 × 106 Zellen/ml. Tag 23 (nach der Inokulation) hatte eine niedrige Zellzahl von 2,6 × 106 Zellen/ml, während die folgenden Tage 30, 37 und 44 eine Zellzahl von über 1,0 × 107 Zellen/ml aufwiesen (Abbildung 3). Obwohl die Zellzahlen an den Tagen 1, 8 und 22 b.d.l. waren, wurde DNA aus jedem Zeitpunkt für NGS extrahiert, was auf ein basales Vorhandensein von Präinokulum-Mikroorganismen im Sediment auch nach dem Autoklavieren hinweist. Die Hauptgattung (bestimmt durch die Anzahl der Reads in jeder Operational Taxonomic Unit (OTU)) war an den Tagen 8, 15 und 22 stabil und wurde als Geobacillus identifiziert. Nach der Inokulation mit dem BLM-1-Inokulum am Tag 23 dominierte Geobacillus nicht mehr, und es entstanden neue Hauptgattungen zusammen mit einer Vielzahl von geringfügig vorhandenen Gattungen, die größtenteils bis zum Ende der Studie präsent blieben (Abbildung 4). Daraus schließen wir, dass das BLM-1-Inokulum eine aktive und sich dynamisch verändernde Kultur innerhalb des Bioreaktors war.

Eine zusätzliche Studie der NGS-Daten enthüllte Mitglieder der "mikrobiellen dunklen Materie". OTUs mit zugewiesenen taxonomischen Namen, die die Wörter "nicht klassifiziert" oder "unkultiviert" enthielten, wurden als Stellvertreter für OTUs verwendet, die Mitglieder der "mikrobiellen dunklen Materie" enthielten. NGS-Daten wurden für Tag 44 (den letzten Tag nach der Inokulation mit Mikroorganismen aus Bohrloch BLM-1) gesammelt und gefiltert, um keine OTUs zu enthalten, die in den Daten vor der Inokulation (Tage 1, 8, 15 oder 22) gelesen wurden, da diese OTUs wahrscheinlich nicht im Inokulum waren. Die gefilterten NGS-Daten von Tag 44 enthielten 1.844 OTUs und 3.396 Lesevorgänge. Davon waren 366 OTUs (20%) und 925 Reads (27%) auf Stammebene nicht klassifiziert, und 1252 OTUs (68%) und 2357 Reads (69%) waren auf Gattungsebene nicht klassifiziert oder nicht kultiviert. Obwohl kurzfristig, unterstützt diese Pilotstudie durch diesen Proxy das Potenzial eines Bioreaktors mit umweltbewussten Medien, Mitglieder der "mikrobiellen dunklen Materie" zu kultivieren.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines kundenspezifischen Borosilikat-Bioreaktors, der für die anaerobe Kultivierung verwendet wird. (A) Ansicht des Bioreaktors von einer Seite. (B) Durch Drehen von A um 90° (im Uhrzeigersinn) um die z-Achse ergibt sich die Ansicht). (C) Eine Draufsicht auf den Bioreaktor. Das ummantelte Design ermöglicht eine Temperaturregelung mit Wasser oder Öl. Die beiden Mantelöffnungen sind auf der rechten Seite der Ansicht in B zu sehen. Die innere Kammer kann mit Sedimenten jeglicher Art gefüllt oder für die planktonische Kultivierung frei von Sedimenten gelassen werden. Drei Probenahmeöffnungen (rechts in der Ansicht in A) ermöglichen die Entnahme von Material in unterschiedlichen Tiefen der Bioreaktorsäule. Standard-45-, 18- und 14-GL-Öffnungen können mit Teflon- oder Butylsepten abgedichtet werden, die 1-6 Monate lang gasdicht sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aktive Bioreaktorbaugruppe. Die auf dem Foto von links nach rechts gezeigten Glaswaren sind (A) 8-Liter-Ballonflasche, (B) Bioreaktor (siehe Abbildung 1) und (C) Auffangflasche ohne Probenahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Direkte Zellzählungen aus der Bioreaktorstudie. Die mikrobiellen Populationen im Bioreaktor wurden mit einer 0,02-mm-Petroff-Hauser-Hämozytometer-Zellzählkammer überwacht. Inoculum wurde zu Beginn von Tag 23 hinzugefügt. Die Zellzahlen für die Tage 1, 8 und 22 lagen unter der Nachweisgrenze. Die effektive Nachweisgrenze der direkten Zellzählung liegt bei 1 × 106 Zellen/ml. Abkürzung: b.d.l. = unterhalb der Nachweisgrenze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Bioreaktor-Sequenzierung der nächsten Generation. OTUs werden in gestapelten Balkendiagrammen dargestellt, die den Prozentsatz der Lesevorgänge angeben, die zu eindeutigen OTUs zu jedem Zeitpunkt der Bioreaktorstudie gehören. Eindeutige OTUs wurden ihrer zugehörigen Taxonomie an einem Gattungs-Cutoff zugeordnet. Die Gattung "Other" ist definiert als alle Gattungen, die zu jedem Zeitpunkt weniger als 10 % der Reads aufweisen. Die Gesamtzahl der vertretenen DNA-Lesungen beträgt 506.358. Die Anzahl der Lesevorgänge für jeden Zeitpunkt wird oben im Diagramm aufgeführt. Inoculum wurde zu Beginn von Tag 23 hinzugefügt. Abkürzung: OTU = Operational Taxonomic Unit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Medienzusammensetzung. Liste der Verbindungen und physikalischen Parameter für jedes Medium. Die präsentierten Medien sind naiv; Sie enthalten keinen Kohlenstoff und keine Energiequellen, da diese spezifisch für die Mikroorganismen und die Umgebung des Lesers sein können und von ihnen beeinflusst werden sollten. Siehe den Diskussionsabschnitt für Ideen für mögliche Kohlenstoff- und Energiequellenzusätze.

Ergänzende Datei 1: Einrichtung des Gasverteilers. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.