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Methodenartikel

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

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DOI:

10.3791/66231

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26. Januar 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Zusammenfassung

Die Einzelzellsequenzierung hat die Kartierung heterogener Zellpopulationen im Stroma hämatopoetischer Organe ermöglicht. Diese Methoden bieten eine Linse, durch die bisher ungelöste Heterogenität im stationären Zustand sowie Veränderungen in der Zelltyprepräsentation, die durch extrinsische Belastungen oder während des Alterns induziert werden, untersucht werden können. Im Folgenden stellen wir schrittweise Protokolle für die Isolierung hochwertiger stromaler Zellpopulationen aus murinem und humanem Thymus sowie aus murinem Knochen und Knochenmark vor. Zellen, die durch diese Protokolle isoliert werden, eignen sich für die Generierung hochwertiger Einzelzell-Multiomics-Datensätze. Die Auswirkungen des Probenverdaus, der Depletion der hämatopoetischen Abstammungslinie, der FACS-Analyse/-Sortierung und wie diese Faktoren die Kompatibilität mit der Einzelzellsequenzierung beeinflussen, werden hier diskutiert. Anhand von Beispielen von FACS-Profilen, die eine erfolgreiche und ineffiziente Dissoziation und nachgeschaltete Stromazellausbeuten in der Postsequenzierungsanalyse anzeigen, werden erkennbare Hinweise für die Benutzer bereitgestellt. Die Berücksichtigung der spezifischen Anforderungen von Stromazellen ist entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, die das Wissen auf diesem Gebiet voranbringen können.

Einleitung

Beim gesunden Erwachsenen findet die De-novo-Produktion von Blutzellen im Knochenmark und im Thymus statt. Stromazellen an diesen Stellen sind für die Aufrechterhaltung der Hämatopoese unerlässlich, aber das Stroma macht weniger als 1 % des Gewebes aus 1,2,3,4. Die Gewinnung reiner Hämatopoese-Isolate, die das Stroma unterstützen, stellt daher eine große Herausforderung dar, insbesondere für die Einzelzell-Multiomik, die eine zweckmäßige Verarbeitung erfordert, um Proben von hoher Qualität zu erhalten. Komponenten verschiedener Verdauungscocktails können bestimmte Schritte in der Multiomics-Analyse beeinträchtigen 5,6. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben die Isolierung einer Vielzahl von Stromazellen aus Knochenmark- und Thymusgewebe.

Störungen der stromalen Bestandteile sowohl im Knochenmark als auch im Thymus führen zu einer tiefgreifenden Störung der Entwicklung der Blutzellen und können zu Malignomen führen 7,8,9. Die Hämatopoese, die das Stroma unterstützt, wird nach zytotoxischer Konditionierung und Knochenmarktransplantation geschädigt, was zu einer verminderten Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren führt, die hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) erhalten2,10,11. Darüber hinaus wirkt sich das Altern auf Knochenmark- und Thymusstromazellen aus, die wahrscheinlich zu gealterten hämatopoetischen Phänotypen beitragen. Der Thymus ist das erste Organ, das einer großflächigen altersbedingten Involution unterzogen wird. Fett und fibrotisches Gewebe beginnen bereits zu Beginn der Pubertät mit dem Ersatz des T-Zell-unterstützenden Stromas12,13. Im Knochenmark nimmt der Adipozytengehalt mit dem Alter zu und die vaskulären und endostalen Nischen werden signifikant umgebaut 14,15,16.

Um die Untersuchung des hämatopoese-unterstützenden Stromas über mehrere Stresszustände hinweg und im Falle des Thymus sowohl des menschlichen als auch des murinen Gewebes zu ermöglichen, haben wir die zuvor veröffentlichten Verdauungsprotokolleoptimiert 1,2,8,17,18. Diese Protokolle gewährleisten eine effiziente und reproduzierbare Isolierung von Zellen und sind mit der Einzelzell-RNAssequenzierung (scRNAseq) und anderen Arten von Multiomics kompatibel.

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Protokoll

Alle Arbeiten mit menschlichem Gewebe wurden nach Genehmigung durch das Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB) durchgeführt. Alle Eingriffe an den Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden C57Bl/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen und sowohl Männchen als auch Weibchen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Aufbereitung von murinem Thymusgewebe

  1. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Lösungen vor.
    1. Medium 199 (M199) mit 2 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) (siehe Materialtabelle).
    2. Muriner Dissoziationscocktail: 0,5 WU/mL Liberase TM und 6,3 U/mL DNase I in M199 + 2% FBS (siehe Materialtabelle).
    3. M199 mit 2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA).
      HINWEIS: FBS-haltiges Medium kann auf BSA umgestellt werden, um die RNA-Qualität zu verbessern.
  2. Führen Sie die murine Thymusdissektion durch
    1. Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung (nach institutionell anerkannten Protokollen) und legen Sie sie auf den Rücken. Befeuchten Sie das Fell auf der Brust mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Brusthöhle.
    2. Präparieren Sie den Thymus vorsichtig, indem Sie zuerst mit einer chirurgischen Schere einen Querschnitt direkt unterhalb des Brustkorbs vornehmen. Schneide die Rippen auf jeder Seite der Maus bis zum Schlüsselbein ein. Schneide dann das Zwerchfell ab, damit sich die Brustwand lösen kann. Hebe die Rippen mit einer Pinzette an, um die Brusthöhle freizulegen.
      1. Der Thymus ist ein weißes, bilobuläres Organ, das am oberen Ende der Höhle direkt über dem Herzen sitzt. Halten Sie den Thymus mit der Pinzette fest und schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe durch, das den Thymus an Ort und Stelle hält. Legen Sie das präparierte Thymusgewebe in die Vertiefung einer 6-Well-Platte mit M199 + 2% FBS auf Eis.
        HINWEIS: Bei der Arbeit mit gealterten oder strahlenkonditionierten Mäusen oder mutierten Stämmen mit Thymusdefekten kann der Thymus so klein sein, dass ein Präpariermikroskop erforderlich ist, um das Organ zuverlässig zu entfernen.
    3. Entfernen Sie mit einem Präpariermikroskop extrathymisches Gewebe mit einer stumpfen Pinzette und einer Mikrofederschere.
  3. Durchführung einer enzymatischen Dissoziation von murinem Thymusgewebe (30 min in Schritten von 10 min)
    1. Legen Sie den gereinigten Thymus in die Kappe eines 15-ml-Röhrchens und hacken Sie das Gewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere fein auf.
      HINWEIS: Das Zerkleinern des Gewebes in der Kappe des Röhrchens, das für die Verdauung verwendet werden soll, minimiert den Gewebeverlust durch den Transfer von einem Behälter in einen anderen. Dies ist sehr wichtig bei der Arbeit mit gealterten oder strahlenkonditionierten Mäusen oder mutierten Stämmen mit Thymusdefekten. Die geringe Thymusgröße in diesen Umgebungen erfordert es, den Materialverlust so weit wie möglich zu reduzieren.
    2. Geben Sie 2 ml murinen Dissoziationscocktail in das 15-ml-Röhrchen, setzen Sie die Kappe mit den Thymusstücken auf und drehen Sie sie 5 Mal um, um sicherzustellen, dass das Gewebe im Dissoziationscocktail resuspendiert wird.
    3. Um ein Auslaufen zu verhindern, wickeln Sie die Kappe des Schlauchs in Paraffinfolie ein. Legen Sie dann den Schlauch waagerecht in ein 37 °C warmes Wasserbad mit 250 U/min Schütteln. 10 Min. inkubieren.
      HINWEIS: Der Erfolg des Aufschlussprotokolls hängt davon ab, ob die Inkubation bei 37 °C und unter Rühren durchgeführt wird. Das beschriebene Protokoll wurde mit Hilfe eines Schüttelwasserbads optimiert. Wenn dies nicht verfügbar ist, können andere Ansätze funktionieren, die das Rühren in einer hitzigen Umgebung ermöglichen, aber es wird empfohlen, das Protokoll zuerst für diese Einstellungen zu optimieren.
    4. Legen Sie das 15-ml-Röhrchen in ein Gestell und lassen Sie die Gewebestücke absetzen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und geben Sie ihn über ein 70 μm Zellsieb in ein eiskaltes 50 ml Röhrchen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2-4 zweimal für insgesamt 3 Verdauungsrunden. Das Gewebe sollte bis zum Ende der letzten Inkubation mehr oder weniger vollständig dissoziiert sein.
    6. Geben Sie 20 ml M199 + 2 % FBS in die gesammelte Zellsuspension. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C runterschleudern.
    7. Den Überstand entfernen und in einem geeigneten Volumen von M199 + 2 % FBS resuspendieren. Fahren Sie dann mit der Zellzählung fort.
      HINWEIS: Das Volumen von M199 + 2 % FBS, in dem resuspendiert werden soll, hängt vom Zustand des Thymus ab. Für 6-10 Wochen alte Mäuse empfehlen wir, das Gewebe in 3-4 ml M199 + 2% FBS zu resuspendieren. Für Experimente mit gealtertem oder strahlenkonditioniertem Gewebe oder mutierten Stämmen mit Thymusdefekten erfordert die kleine Thymusgröße jedoch geringere Volumina von 0,1 bis 1 ml.
    8. Zählen Sie die Zellen, indem Sie die Zellsuspension 1:2 in 0,4%iger (w/v) Trypanblau-Lösung verdünnen. Legen Sie die Zellen auf ein Hämozytometer und zählen Sie sie unter einem Hellfeldmikroskop. Zählen Sie ungefärbte Zellen, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Milliliter zu bestimmen, und die Anzahl der blau gefärbten Zellen, um die Lebensfähigkeit der Probe zu beurteilen.
  4. Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung des murinen Thymusstromas
    1. Schleudern Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunter. Resuspendieren Sie Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml in M199 + 2 % FBS, ergänzt mit 25 U/ml Protector RNase Inhibitor (siehe Materialtabelle).
    2. murinen Fc-Block (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 2 μg/ml zugeben und 10 min bei 4 °C inkubieren.
    3. Färben Sie die Zellen mit den folgenden Antikörpern: CD45-PE/Cy7 (4 μg/ml), Ter119-PE (4 μg/ml), CD31-BUV737 (2 μg/ml) und EpCam-BV711 (2 μg/ml) (siehe Materialtabelle) für 30 min bei 4 °C.
    4. Die Proben in M199 + 2% BSA waschen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunterschleudern.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in M199 + 2 % BSA, die einen Viabilitätsfarbstoff wie DAPI (0,5 μg/ml) oder 7-AAD (1 μg/ml) enthalten (siehe Materialtabelle). Fahren Sie mit der FACS-Isolierung von Thymusstromazellen gemäß den festgelegten Protokollenfort 19.

2. Aufbereitung von menschlichem Thymusgewebe

  1. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Lösungen vor.
    1. Medium 199 (M199) mit 2% (v/v) FBS.
    2. M199 mit 1,5 % (w/v) BSA.
    3. Dissoziationscocktail beim Humanen: 1 mg/ml Kollagenase IV und 2 mg/ml Dispase und 6,3 U/ml DNase I in M199 +1,5% BSA (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Der letzte Verdauungsschritt bei der Aufbereitung von menschlichem Thymusgewebe umfasst Trypsin. Es ist daher wichtig, dass alle Schritte bis zu diesem Zeitpunkt in BSA-haltigen Puffern durchgeführt werden, da FBS die Trypsinaktivität hemmt.
  2. Führen Sie die Isolierung von menschlichem Thymusgewebe durch
    1. Der menschliche Thymus (entnommen nach der zuvor veröffentlichten Methode19) wird in ein geeignetes Volumen von M199 + 1,5 % BSA gegeben und bis zum Beginn der Verarbeitung auf Eis gelagert.
    2. Wenn Sie mit menschlichem Thymusgewebe arbeiten, behandeln Sie es so, als ob es potenziell infektiös wäre, indem Sie die Arbeit in einer Gewebekulturhaube durchführen und die Standardvorsichtsmaßnahmen gemäß den CDC-Richtlinien20 anwenden.
    3. Geben Sie das Gewebe in eine 10 cm große Petrischale mit 10 mL eiskaltem M199 + 1,5% BSA. Reinigen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere vorsichtig extrathymisches Fett oder Gewebe, das bei der Entnahme des Organs beschädigt wurde.
    4. Schneiden Sie den Thymus mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette in 1 cm3 Würfel und drücken Sie mit dem Kolben einer 10-ml-Spritze vorsichtig auf die Stücke. Dadurch wird ein Teil der sich entwickelnden Thymozyten freigesetzt und so das Volumen des zu verdauenden Gewebes reduziert.
      HINWEIS: Bewahren Sie die freigesetzte hämatopoetische Fraktion auf, wenn eine anschließende Analyse der Entwicklungsstadien der Thymozyten erforderlich ist. Kombinieren Sie diese Fraktion jedoch nicht mit der Stromazellfraktion, die bei der enzymatischen Verdauung entsteht. Es wurde beobachtet, dass das Poolen der beiden Fraktionen das Risiko der Bildung von Verstopfungen in der Zellsuspension signifikant erhöht, was letztendlich die Ausbeute an Stromazellen verringert. Bei der schonenden Zerkleinerung des Gewebes gehen nur wenige Stromazellen verloren.
  3. Durchführung einer enzymatischen Dissoziation von menschlichem Thymusgewebe (90 min in Schritten von 30 min)
    1. Übertragen Sie ca. 5 mg der leicht zerkleinerten Thymusgewebestücke auf die Kappe eines konischen 50-ml-Röhrchens. Schneiden Sie dann das Gewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere fein ab.
    2. Pipettieren Sie 8 ml des humanen Dissoziationscocktails in das 50-ml-Röhrchen, setzen Sie die Kappe mit dem gehackten menschlichen Thymusgewebe auf und drehen Sie das Röhrchen dann vorsichtig 5 Mal um, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe mit dem Enzymcocktail vermischt wird.
    3. Sichern Sie die Kappe der Tube mit Paraffinfolie, um ein Auslaufen zu verhindern. Inkubieren Sie das Röhrchen horizontal in einem Schüttelwasserbad (250 U/min) bei 37 °C für 30 Minuten.
    4. Legen Sie das 50-ml-Röhrchen in ein Gestell und lassen Sie die menschlichen Thymusgewebestücke absetzen, bevor Sie den Überstand entfernen und über ein 70-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen geben, das auf Eis gestellt wird.
    5. Die Schritte 2.3.2 bis 1.3.4 sind für insgesamt zwei Verdauungsrunden mit dem Dissoziationscocktail beim Menschen zu wiederholen.
    6. Nachdem die zweite Verdauungsrunde abgeschlossen ist, fügen Sie dem verbleibenden Gewebe weitere 8 ml des menschlichen Dissoziationscocktails hinzu. Pipettieren Sie dann ebenfalls 2 mL 0,25% Trypsin in das Dissoziationsröhrchen. Weitere 30 Minuten bei 37 °C inkubieren und bei 250 U/min schütteln.
      HINWEIS: Es ist absolut notwendig, dass die Verdauungszeit für menschliches Gewebe mindestens 90 Minuten beträgt, da kürzere Inkubationszeiten zu drastisch reduzierten Stromazellerträgen führen.
    7. Sobald der letzte Inkubationsschritt abgeschlossen ist, werden die Zellsuspension und die verbleibenden Gewebefragmente mit dem in den vorherigen Schritten gesammelten Überstand gepoolt, indem Sie ein 70-μm-Zellsieb passieren. Geben Sie 3 mL FBS in die Probe, um die Trypsinreaktion zu unterbrechen, und legen Sie es auf Eis.
    8. Fahren Sie mit der Zählung der Zellen fort, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
  4. Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung des humanen Thymusstromas
    1. Die Zellsuspension des menschlichen Thymus wird heruntergeschleudert und in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml in M199 + 2 % FBS, ergänzt mit 25 U/ml, Protector RNase-Inhibitor, resuspendiert.
    2. Mit humanem Fc-Block (5 μg/ml) (siehe Materialtabelle) für 10 min bei 4 °C inkubieren.
    3. Färben Sie die Probe 30 Minuten lang bei 4 °C mit CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/ml), Lineage-Cocktail-FITC (3,76 μg/ml), CD66b-FITC (20 μL/100 μL Probe), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL Probe), CD4-BV605 (5 μL/100 μL Probe), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/ml) und EpCam-BV421 (2,5 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
    4. Die Proben in M199 + 1,5 % BSA waschen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunterschleudern.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in M199 + 1,5 % BSA, die einen Viabilitätsfarbstoff wie DAPI (0,5 μg/ml) oder 7-AAD (1 μg/ml) enthalten. Fahren Sie mit der FACS-Isolierung von Thymusstromazellen gemäß den festgelegten Protokollenfort 19.

3. Aufbereitung von murinem Knochen- und Knochenmarkgewebe

HINWEIS: Knochen- und Knochenmarkfraktionen werden in zwei getrennten Verdauungsreaktionen hergestellt, um maximale Reinheit der Stromazellen und eine optimale Dissoziation des Gewebes zu erreichen. Die Proben können nach den Aufschlussschritten gepoolt werden, um als ein Stromakompartiment sortiert zu werden.

  1. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Lösungen vor.
    1. M199 mit 2% (v/v) FBS.
    2. Muriner B&M-Dissoziationscocktail (Knochen und Knochenmark): Stemxym 2 mg/ml, Dispase 1 mg/ml und 10 U/mL DNase I (siehe Materialtabelle) in M199 +2% FBS.
      HINWEIS: Bereiten Sie die B&M-Dissoziationsmischung frisch zu und bewahren Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis auf.
    3. M199 mit 0,5 % (w/v) BSA.
    4. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % (w/v) BSA.
    5. M199 mit 2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA.
      HINWEIS: FBS-haltiges Medium kann auf BSA umgeschaltet werden, um die RNA-Qualität zu verbessern.
  2. Durchführung einer murinen Knochenmarktrennung
    1. Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung (nach institutionell anerkannten Protokollen). Mit 70% Ethanol besprühen, um das Fell zu befeuchten.
    2. Entfernen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen, das Schienbein, das Becken und den Oberarmknochen von jeder Seite und legen Sie sie in eine Vertiefung mit M199 + 2 % FBS auf Eis21,22.
    3. Entfernen Sie sämtliches Muskel-, Bänder- und Knorpelgewebe mit Gewebetüchern, um Schäden am Knochen zu minimieren und die Periostschicht zu erhalten. Legen Sie sie in eine neue Vertiefung mit M199 + 2% FBS auf Eis.
    4. Mit einem Skalpell die Wachstumsfugen der langen Knochen durchschneiden, um die Epiphyse zu entfernen und in eine 10 cm Schale mit M199 + 2% FBS auf Eis zu legen.
    5. Spülen Sie das Knochenmark aus den Knochen, bis es hellweiß ist. Verwenden Sie eine 28 g Nadel und eine 10 mL Spritze, die mit 10 mL M199 + 2% FBS gefüllt sind, um das Mark in ein 15 mL Röhrchen auf Eis zu spülen. Legen Sie den gespülten Knochen in die 10 cm Schale mit der Epiphyse.
      HINWEIS: Eine vollständige Spülung des Knochenmarks für eine vollständige Trennung des Gewebes führt zu einer besseren Probenvorbereitung.
  3. Durchführung einer enzymatischen Dissoziation von murinem Knochenmarkgewebe (insgesamt 30 min in Schritten von 10 min)
    1. Lassen Sie das 15-ml-Röhrchen aufrecht auf Eis stehen, bis das Mark auf den Boden des Röhrchens sinkt. Entfernen Sie die 10 mL M199 + 2% FBS langsam durch Pipettieren.
    2. Geben Sie 4 mL B&M Dissoziationscocktail in das 15 mL Röhrchen und legen Sie es für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad (kein Schütteln).
    3. Nach 5 Minuten drehen Sie den Schlauch dreimal um und legen Sie ihn wieder in das Wasserbad.
    4. Stellen Sie nach den ersten 10 Minuten sicher, dass sich das Pellet am Boden befindet, und sammeln Sie den Überstand, während Sie durch ein 70-μm-Zellsieb in ein eiskaltes 50-ml-Röhrchen filtrieren. Geben Sie 2 mL frischen B&M-Dissoziationscocktail zum restlichen BM-Pellet und legen Sie es wieder in das Wasserbad.
    5. Dissoziieren Sie alle verbleibenden Knochenmarkstücke durch kräftiges Pipettieren mit einer 1-ml-Pipette. Sammeln Sie die gesamte resultierende Zellsuspension im selben Röhrchen wie in den vorherigen Schritten. Geben Sie 20 mL M199 + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA in die gesammelte Zellsuspension.
      HINWEIS: In Schritt 3.3.5 enthält der Puffer, der nach der abschließend aufgeschlossenen Probe hinzugefügt wird, EDTA, um die Hemmung weiterer enzymatischer Aktivitäten zu unterstützen.
  4. Durchführung einer hämatopoetischen Zelldepletion von murinem Knochenmarkgewebe.
    1. Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie in 500 μl PBS + 0,5 % BSA mit Biotin-Antikörpern (5 mg/ml), die auf CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 und CD3 abzielen (siehe Materialtabelle). In ein Röhrchen mit rundem Boden und Kappe umfüllen.
    2. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    3. Wirbeln Sie die Magnetkügelchen gründlich durch und geben Sie 25 μl Magnetkügelchen in das Röhrchen.
    4. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    5. Legen Sie das Röhrchen für 2-3 min in den passenden Magneten und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen.
      HINWEIS: Das Knochenmark kann nach diesem Schritt gepoolt oder getrennt von der Knochenfraktion aufbewahrt werden. Wenn die Depletion der Abstammungslinie erfolgreich ist, sollte die resultierende Zellsuspension frei von roten Blutkörperchen sein.
  5. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation von murinem Knochengewebe durch.
    1. Brechen Sie die Knochen in der 10-cm-Schale mit dem flachen Kappenende eines 50-ml-Röhrchens in kleinere Stücke. Filtrieren Sie den Überstand durch ein 70-μm-Zellsieb, um Knochenfragmente im Inneren des Filters zu isolieren.
      HINWEIS: Alternativ kann ein Mörser und Stößel zur Knochenfragmentierung verwendet werden. Diese Option neigt jedoch dazu, mehr Ablagerungen zu erzeugen und die Lebensfähigkeit der Stromazellen zu verringern, wenn der Knochen zermahlen und nicht gebrochen wird. Die Stromazellen sind noch am und im Knochen befestigt, und der Überstand mit den hämatopoetischen Zellen ist zu verwerfen.
    2. Schneiden Sie mit einer Schere die Knochenfragmente in das Zellsieb. Dadurch wird die Oberfläche für eine effizientere enzymatische Dissoziation vergrößert. Waschen Sie den Knochen mit 5 mL M199 + 2% FBS.
    3. Geben Sie die Knochenfraktion in 5 mL murines B&M-Dissoziationsgemisch (siehe Materialtabelle) in ein neues 50-ml-Röhrchen.
    4. Um ein Auslaufen zu verhindern, wickeln Sie die Kappe des Schlauchs in Paraffinfolie ein. Legen Sie dann den Schlauch waagerecht in ein 37 °C warmes Wasserbad mit 120 U/min und schütteln Sie ihn 30 min lang.
    5. Nach dem Aufschluss werden 25 mL M199 + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA zugegeben und der Überstand mit den Stromazellen durch ein 70 μm Zellsieb in ein eiskaltes 50 ml Röhrchen filtriert.
      HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die entstandenen Knochenfragmente durch die Verdauung sichtbar vermindert wurden. In Schritt 3.5.5 enthält der Puffer, der nach der abschließend aufgeschlossenen Probe zugegeben wird, EDTA, um die Hemmung weiterer enzymatischer Aktivität zu unterstützen.
  6. Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von murinem Knochen und Knochenmarkstroma.
    1. Schleudern Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunter.
    2. In murinen Fc-Zellen resuspendieren: Bei einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA blockieren und 10 min bei 4 °C inkubieren.
    3. Färben Sie die Zellen (bis zu 10 Millionen Zellen/100 μl Gesamtfärbevolumen) mit den folgenden Antikörpern: CD45-PE/Cy7 (1 μg/ml), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/ml), CD31-BV421 (0,66 μg/ml), CD140a-APC (2 μg/ml), Sca1-AF700 (0,66 μg/ml), CD51-PE (2 μg/ml), CD105-PE/Dazzle (2 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
    4. Lassen Sie Calcein-AM auf Raumtemperatur äquilibrieren und resuspendieren Sie es in 50 μl DMSO. Frisch zubereiten für jeden Gebrauch. Nach der Aufwirbelung bei Raumtemperatur aufbewahren. Das Calcein in PBS (0,1 mg/ml) vorverdünnen, bevor es der bereits im Antikörper-Färbecocktail resuspendierten Probe (20 μg/ml) zugesetzt wird, und 20-30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
    5. Die Proben in PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA waschen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA. Fahren Sie mit der FACS-Isolierung von Knochen- und Knochenmarkstromazellen gemäß den festgelegten Protokollenfort 19.

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Ergebnisse

Diese Protokolle liefern reproduzierbare Stromazellsorten aus dem Thymus und dem Knochenmark, die für die durchflusszytometrische Analyse sowie für Einzelzell-Multiomics, wie z. B. die scRNA-Sequenzierung, geeignet sind. Das murine Thymusgewebe erfährt als Reaktion auf Stressfaktoren wie die zytotoxische Konditionierung, die der Knochenmarktransplantation vorausgeht, oder den natürlichen Alterungsprozess einen erheblichen Umbau. Infolgedessen ist die Thymuszellularität in beiden Fällen drastisch reduziert (

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Diskussion

Stromazellen in hämatopoetischen Organen sind entscheidend für die normale Blutproduktion, und hämatopoetische Stromastörungen können zu schwerwiegenden Beeinträchtigungen der hämatopoetischen Aufrechterhaltung und der Reaktion auf Stress führen 9,23,24. Der Einblick in hämatopoetische Stromazellen ist essentiell für das Verständnis hämatologischer Erkrankungen 7,9,10,24 und für die Fähigkeit, ...

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Offenlegungen

D.T.S. ist Direktor und Anteilseigner von Agios Therapeutics und Editas Medicines; Gründer, Direktor, Anteilseigner und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Magenta Therapeutics und LifeVault Bio, Aktionär und Gründer von Fate Therapeutics und Garuda Therapeutics sowie Direktor, Gründer und Gesellschafter von Clear Creek Bio, Berater für FOG Pharma, Inzen Therapeutics und VCanBio sowie Empfänger von gesponserten Forschungsgeldern von Sumitomo Dianippon. D.T.S und K.G sind Erfinder von Patenten US20220143099A1.

Danksagungen

Wir wurden von der HSCI-CRM-Einrichtung für Durchflusszytometrie am Massachusetts General Hospital und der Bauer Core Facility an der Harvard University mit fachkundiger technischer Unterstützung unterstützt. T.K und K.G wurden vom Schwedischen Forschungsrat und C.M. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir danken Sergey Isaev und I-Hsiu Lee für die Unterstützung bei der Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-Aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
RinderserumalbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 MäuseJackson664Männchen oder Weibchen, 8-12 Wochen alter
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Kollagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Zellsiebe, weiß, Maschenweite: 70 µ mFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I LösungThermo Fisher Scientific90083  2500 U/mL
Easysep Maus Streptavidin RapidSpheres IsolationskitStemCell Technologies19860
Fötales RinderserumGibcoA31605-01Qualifizierter One-Shot-Human-Fc-Block
BD Biosciences564220
Liberase TM MilliporeSigma 5401127001Research Grade Medium
199Gibco12350
Maus Anti-Mensch CD235a-BV77BD Biosciences740785
Maus Anti-Mensch CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Maus Anti-Mensch CD45-BV77Biolegend304050
Maus Anti-Mensch CD4-BV605BD Biosciences562658
Maus Anti-Mensch CD66b-FITCBD Biosciences555724
Maus Anti-Mensch CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Maus Anti-Mensch EpCam-BV421Biolegend324220
Protektor RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Ratte Anti-Maus CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Ratte Anti-Maus CD11b-BiotinBiolegend101204
Ratte Anti-Maus CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block)BD Biosciences553142
Ratte Anti-Maus CD31-BUV737BD Biosciences612802
Ratte Anti-Maus CD31-BV421Biolegend102424
Anti-Maus CD3-BiotinBiolegend100244
Ratte Anti-Maus CD45.2-BiotinBiolegend109804
Ratte Anti-Maus CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Ratte Anti-Maus CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Ratte Anti-Maus CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Anti-Maus für Ratte CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Anti-Maus für Ratte CD51-PEBiolegend104106
Anti-Maus für Ratte EpCam-BV711BD Biosciences563134
Ratte Anti-Maus Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Ratte Anti-Maus Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Anti-Maus-Mittel für Ratten Ter119-BiotinBiolegend116204
Anti-Maus-Mittel für Ratten Ter119-PEBiolegend116208
Anti-Maus-Mittel Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme BiochemischesLS004107
von Worthington

Referenzen

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