Methodenartikel

Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung

2.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

12. April 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

Das Protokoll skizziert eine praktikable, zuverlässige und reproduzierbare Methode des linken pulmonalen hilären Klemmens, die zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei der Lunge in Mausmodellen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) während einer Lungentransplantation sind ein Hauptrisikofaktor für Komplikationen nach der Transplantation, einschließlich primärer Transplantatfunktionsstörungen, akuter und chronischer Abstoßung und Mortalität. Die Bemühungen, die Grundlagen der IRI zu untersuchen, führten zur Entwicklung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Mausmodells für das Hilar-Clamping der linken Lunge. Bei diesem Modell handelt es sich um einen chirurgischen Eingriff, der an einer anästhesierten und intubierten Maus durchgeführt wird. Es wird eine linke Thorakotomie durchgeführt, gefolgt von einer sorgfältigen Lungenmobilisation und Dissektion des linken Lungenhilus. Bei der hilären Klemme handelt es sich um eine reversible Nahtligatur des Lungenhilums mit einem Slipknot, der den arteriellen Zufluss, den venösen Abfluss und den Luftstrom durch den linken Hauptstammbronchus stoppt. Die Reperfusion wird durch vorsichtiges Entfernen der Naht eingeleitet. Unser Labor verwendet 30 min Ischämie und 1 h Reperfusion für das Versuchsmodell in den aktuellen Untersuchungen. Diese Zeiträume können jedoch je nach experimenteller Fragestellung modifiziert werden. Unmittelbar vor der Tötung kann arterielles Blutgas aus dem linken Ventrikel nach einer 4-minütigen Periode der rechten hilaren Klemmung entnommen werden, um sicherzustellen, dass die erhaltenen PaO2-Werte nur der verletzten linken Lunge zugeordnet werden. Wir beschreiben auch eine Methode zur Messung der Zellextravasation mit Durchflusszytometrie, die die intravenöse Injektion eines Fluorochrom-markierten Antikörpers beinhaltet, der für die zu untersuchende(n) Zelle(n) vor der Tötung spezifisch ist. Die linke Lunge kann dann für die Durchflusszytometrie, gefroren oder fixiert, die in Paraffin eingebettete Immunhistochemie und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Diese hilare Clamp-Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der IRI zugrunde liegen. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine verminderte Sauerstoffversorgung der linken Lunge und histologische Hinweise auf eine Lungenschädigung nach hilärem Klemmen. Diese Technik kann von Personal mit und ohne mikrochirurgische Erfahrung leicht erlernt und reproduziert werden, was zu zuverlässigen und konsistenten Ergebnissen führt und als weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der Lungen-IRI dient.

Einleitung

Die IRI während einer Organtransplantation ist ein Hauptrisikofaktor für eine primäre Transplantatdysfunktion und spätere Episoden der Transplantatabstoßung 1,2. Während der Transplantation ist die warme Ischämiezeit definiert als die Zeitspanne von der Kreuzklemmung der Spenderaorta bis zum Beginn der kalten Perfusion und von der Organentnahme aus dem Eis bis zur Organimplantation. Die Kältelagerzeit ist definiert als der Zeitraum vom Beginn der Kaltperfusion bis zur Entnahme des Organs aus dem Eis3. Die warme Ischämie ist für die spätere Organfunktion schädlicher als die kalte Ischämie 4,5,6, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen rechtfertigen weitere Studien in präklinischen Modellen. Darüber hinaus ist eine Organtransplantation aus einer Spende nach Herztod (DCD) mit längeren warmen ischämischen Zeiten verbunden als eine herkömmliche Spende nach Hirntod (DBD)7. Während der Einsatz von DCD-Spendern den Spenderpool erweitern und die Lungenauslastung erhöhen kann, sind weitere präklinische Studien erforderlich, um die Auswirkungen der warmen Ischämie auf die Lungenfunktion nach der Transplantation zu bewerten. Im Folgenden beschreiben wir ein Modell der warmen IRI bei Mäusen über die linke pulmonale Hilarklemme.

Mehrere Tiermodelle für die hiläre Lungenklemmung wurden in den letzten Jahren entwickelt und angepasst und können die Verwendung einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme 8,9,10,11,12,13, eines Rumel-Tourniquets14,15 oder einer Nahtligatur16 umfassen wie die hilare Klemme. Die Krux an der hilären Klemme ist, dass sie reversibel sein muss und die hilären Strukturen nur minimal oder gar nicht schädigt, damit eine Reperfusion erreicht werden kann. Hier beschreiben wir unsere hilare Clamp-Technik bei Mäusen, bei der es sich um eine reversible Nahtligatur des linken Lungenhilums mit einem Slipknot handelt. Bei dieser Methode werden der pulmonalarterielle Zufluss, der venöse Abfluss und der Luftstrom in und aus dem Hauptstammbronchus verschlossen. Der Hauptvorteil eines Slipknot über einer Gefäßklemme, einem Clip oder einem Tourniquet besteht darin, dass der Brustkorb bei längerer Ischämie geschlossen werden kann, wodurch unmerkliche Flüssigkeit und Wärmeverluste in der Maus minimiert werden. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um zuverlässige arterielle Blutgasmessungen (ABG) zu erhalten und die Zellextravasation nach hilärem Clamping zu messen.

Diese hilare Clamp-Technik nimmt einen wichtigen Platz in der breiteren Erforschung der Lungentransplantation ein. Im Vergleich zu Kleintiermodellen der orthotopen Lungentransplantation kann die Hilar-Clamp-Technik die Auswirkungen der IRI ohne Zusatz eines chirurgischen Anastomosentraumas oder einer Allogenität isolieren17. Darüber hinaus kann die Hilar-Clamp-Technik einfacher und schneller gemeistert werden als die Lungentransplantation bei Mäusen. Tatsächlich wurden in den letzten zehn Jahren mit hilären Clamp-Techniken mehrere wichtige Mechanismen in der Pathogenese der IRI identifiziert, wie z. B. TLR4, NADPH-Oxidase und Adenosin-A2A-Rezeptor 14,18,19,20. Im folgenden Protokoll stellen wir eine zuverlässige, lehrbare und reproduzierbare Methode des hilären Klemmens als Werkzeug zur Untersuchung der Lungen-IRI vor.

Protokoll

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt. Die Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8. Auflage21 , der von der National Academy of Sciences erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde, und den von der National Society for Medical Research formulierten Grundsätzen für die Pflege von Labortieren.

1. Anästhesie und Intubation

  1. Wählen Sie eine Maus, die mindestens 25 g wiegt. Dies erleichtert die Intubation aufgrund der größeren Öffnung zwischen den Stimmbändern.
  2. Injizieren Sie der Maus intraperitoneal eine Mischung aus Ketamin (Dosis 100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (Dosis 10 mg/kg Körpergewicht). Diese Mischung sollte in eine 1/2 cc Spritze mit einer 1/2 Zoll 29G Nadel geladen werden. Warten Sie etwa 5 Minuten, bis Ketamin wirkt - die Maus sollte keine spontanen Bewegungen zeigen und reagiert nicht auf ein Zehenkneifen, was eine ausreichende Anästhesie bestätigt.
  3. Injizieren Sie Buprenorphin (Dosis 0,05 mg/kg Körpergewicht) subkutan vor der Operation zur zusätzlichen Schmerzkontrolle.
  4. Tragen Sie eine nicht medikamentöse Augensalbe auf beide Augen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut während der Operation zu vermeiden.
  5. Rasieren Sie die Maus mit einem Haarschneider über die linke Brust und den Rücken (siehe Abbildung 1A) und verlängern Sie sie auf den Bauch, wenn eine Laparotomie geplant ist (siehe Schritt 5.3).
  6. Sobald die Maus anästhesiert ist, führen Sie die Intubation mit einer bevorzugten Intubationsanordnung durch und den Rest des Eingriffs unter einem Mikroskop über einer erwärmten Matte bei ~37 °C (um die Normothermie in der Maus zu erhalten).
  7. Nachdem Sie eine ausreichende Sicht auf die Stimmbänder erhalten haben, führen Sie einen selbstgemachten Einführapparat (siehe ergänzende Abbildung 1) mit einer Kurve am Ende in einen 1-Zoll-20G-Angiokatheter ein, der als Endotrachealtubus (ETT) verwendet wird. Führen Sie die Spitze des Einführers und dann das ETT zwischen und an den Stimmbändern vorbei.
    HINWEIS: Es ist wichtig, sich vorzustellen, wie der ETT durch die Stimmbänder geht, um eine falsche Intubation in die Speiseröhre zu vermeiden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Stimmbänder während der Intubation nicht verletzt werden (d. h. die Anzahl der Intubationsversuche sollte auf 5 begrenzt werden und die ETT sollte nicht vorgezogen werden, wenn der Widerstand erreicht wird).
  8. Sobald das ETT eingesetzt ist, entfernen Sie die Einführhilfe und schließen Sie das ETT an ein Beatmungsgerät für Kleintiere an. Achten Sie auf eine symmetrische Brustanhebung, um die korrekte endotracheale Intubation zu bestätigen. Die Einstellungen des Beatmungsgeräts sollten 100-105 Atemzüge pro Minute und einen Anteil an eingeatmetem Sauerstoff von 100 % betragen. Das Atemzugvolumen beträgt 0,35 mL und der positive endexspiratorische Druck 1 cm H2O.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich der Brustkorb und nicht der Bauch hebt, da eine versehentliche Intubation der Speiseröhre zum Tod führt, wenn sie nicht sofort korrigiert wird.
  9. Sobald die Bestätigung der Position ist, befestigen Sie das ETT mit einem 5 cm breiten Streifen 1 Zoll Seidenband um die Mausnase und achten Sie auf einen ausreichenden Kontakt mit dem ETT und der Nase, damit das ETT nicht aus dem Mund rutscht (siehe Abbildung 1B-C).
  10. Um eine angemessene Anästhesie während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten, verabreichen Sie 1 % bis 1,5 % Isofluran im Einklang mit dem Sauerstofffluss.

2. Thorakotomie

  1. Positionieren Sie die Maus in der rechten seitlichen Dekubitusposition, wobei beide Vorderpfoten an der oberen linken Ecke, die rechte Hinterpfote an der unteren linken Ecke und die linke Hinterpfote an der unteren rechten Ecke befestigt sind (siehe Abbildung 2G zum Kleben).
  2. Desinfizieren Sie mit der Haut über der linken Brust mit mindestens 3 abwechselnden Runden Povidon-Jod, gefolgt von einer Anwendung mit 70% Alkohol.
  3. Führen Sie einen Schnitt über den 4. Interkostalraum von der vorderen Achsellinie bis zur hinteren Achsellinie durch und öffnen Sie die darüber liegende Haut mit einer Schere (siehe Abbildung 2A). Der 4. Interkostalraum befindet sich ca. 1 cm unterhalb der Achselhöhle in der Mittelachsellinie.
  4. Um den Blutverlust zu minimieren, koagulieren Sie die sichtbaren Blutgefäße in den Unterhaut- und Muskelschichten mit einem tragbaren Kauterstift.
  5. Teilen Sie die Muskeln latissimus dorsi und serratus anterior mit einer Schere scharf entlang der Länge des Hautschnitts (siehe Abbildung 2B).
  6. Heben Sie die 4. Rippe vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette an (achten Sie darauf, die darunter liegende Lunge nicht zu verletzen) und schneiden Sie mit einer feinen Schere knapp über der 5. Rippe punktgenau, um in den 4. Interkostalraum einzudringen (siehe Abbildung 2C). Führen Sie die Thorakotomie oberhalb der 5. Rippe und nicht unterhalb der 4. Rippe durch, um eine Verletzung des interkostalen neurovaskulären Bündels zu vermeiden.
  7. Sobald der negative Druck der Pleurahöhle verloren geht und sich die Lunge von der Brustwand zurückzieht, verlängern Sie die Thorakotomie anterior und posterior im 4. Interkostalraum direkt über der 5. Rippe (siehe Abbildung 2D-E). Die gesamte Länge des Schnitts sollte lang genug sein, um die gesamte Lunge freizulegen, normalerweise ~1 cm.
    HINWEIS: Blutungen der inneren Brustarterie können auftreten, wenn die Thorakotomie zu weit nach vorne ausgedehnt wird - wenn sie auftritt, sollte diese kauterisiert werden, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden.
  8. Bringen Sie zwei Rippenaufroller an, um den Rippenraum zu spreizen, so dass ein Arbeitsfenster von mindestens 1 cm2 für eine angemessene Visualisierung vorhanden ist (siehe Abbildung 2F-G).

3. Anwendung der hilaren Klemme

  1. Mobilisieren Sie die linke Lunge mit zweizackigen Applikatoren mit Wattespitze, indem Sie sie cephalad anheben und dann das durchscheinende untere Lungenband stumpf teilen (siehe Abbildung 3A-B).
    HINWEIS: Wenn dies ohne Lungenriss schwierig durchzuführen ist, kann das untere Lungenband auch mit einer feinen Schere scharf geteilt werden.
  2. Reflektieren Sie die Lunge nach vorne, so dass der hintere linke Lungenhilum sichtbar gemacht werden kann. Schneiden Sie ein Stück 6-0 Seidenkrawatte auf ~10 cm ab und platzieren Sie den Mittelpunkt dieser Krawatte hinter dem Hilum (siehe Abbildung 3C).
  3. Drehen Sie dann die linke Lunge nach hinten, um sich über die Krawatte zu legen, und ziehen Sie beide Enden der Krawatte nach vorne (siehe Abbildung 3D).
  4. Mit den beiden freien Enden (A und B) der Krawatte binden Sie einen reversiblen Schlupfknoten mit Pinzette und einer gebogenen Moskitoklemme. Siehe detaillierte Beschreibung in den Schritten 3.4.1 und 3.4.2. Die warme ischämische Zeit beginnt mit dem Binden des Slipknotens. Die linke Lunge sollte sich nicht mehr bei jedem Atemzug des Beatmungsgeräts aufblähen, sobald der Knoten gebunden ist. Es sollte blassweiß werden, was eine Beendigung der Durchblutung bedeutet.
    HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass der Knoten in der Mitte des Hilums sitzt, um zu vermeiden, dass versehentlich der linke Vorhof mittig und das Lungenparenchym seitlich eingeklemmt wird (siehe Abbildung 3F).
    1. Halten Sie mit der Klemme in der dominanten Hand und der Pinzette in der nicht-dominanten Hand das Ende von A mit einer Pinzette fest und schlingen Sie den Mittelpunkt von A einmal um die geschlossene Klemme (siehe Abbildung 3E).
    2. Fassen Sie mit der Klemme den Mittelpunkt von B und ziehen Sie mit beiden Händen, um den Knoten festzuziehen. Lassen Sie das Ende von B nicht durch den Knoten ziehen, da dies den Knoten irreversibel machen würde. Nach dem Binden des Knotens sollte bei B eine Schlaufe vom Knoten ausgehen, während A gerade sein sollte (siehe Abbildung 3F). Der Knoten kann durch Ziehen am Ende von B gelöst werden.
  5. Bestätigen Sie einen adäquaten Verschluss des Bronchus, indem Sie den Abflussschlauch vom ETT zum Beatmungsgerät manuell verschließen, was dazu führen sollte, dass sich die linke Lunge nicht aufbläht (siehe Abbildung 3G). Bei einem Bronchialverschluss wird von einem Gefäßverschluss ausgegangen, da die Kollabierbarkeit der Lungenarterie und der Lungenvenen im Vergleich zum Knorpelbronchus erhöht ist.
  6. Nach dem Anlegen der Hilarklemme schließen Sie den Hautschnitt mit einem einfachen unterbrochenen Stich mit einer 6-0-Nylonnaht, um unmerkliche Flüssigkeitsverluste während der Zeit der warmen Ischämie zu minimieren.

4. Lösen der hilaren Klemme

  1. Nach der gewünschten Zeit der warmen Ischämie lösen Sie den Slipknot, indem Sie vorsichtig am kurzen freien Ende des Seidenbandes ziehen (B aus Abbildung 3F und Schritt 3.4). Starten Sie die Reperfusionszeit nach dem Lösen des Slipknotens.
    HINWEIS: Nach dem Lösen der Bindung kann die Lungenventilation durch einen erneuten manuellen Verschluss des Abflusses des ETT bestätigt werden, was nun zu einer Ausdehnung der linken Lunge führen sollte. Auch hier wird die Durchblutung mit der Blähung der Lunge impliziert, kann aber auch durch ein Aufblähen der Lunge bestätigt werden (siehe Abbildung 4A).
  2. Während der Reperfusionsphase schließen Sie die Brust in drei Schichten, um unmerkliche Verluste zu minimieren. Zuerst schließen Sie den 4. Rippenraum mit einem einzigen Stich mit 6-0 Nylonnaht, mit einem Biss knapp über der 4. Rippe und einem Biss knapp über der 6. Rippe (siehe Abbildung 4B-C). Binden Sie diese bei maximaler Lungenaufblähung, um das Risiko eines iatrogenen Pneumothorax zu minimieren (siehe Abbildung 4D-E).
  3. Als nächstes verschließen Sie die Muskelschicht mit einem einfachen Laufstich mit 6-0 Nylonnaht.
  4. Zum Schluss schließen Sie den Hautschnitt mit einem einfachen unterbrochenen Stich mit 6-0 Nylonnaht (siehe Abbildung 4F). Vermeiden Sie Laufstiche auf der Haut, da die Gefahr besteht, dass wache Tiere an ihrem Schnitt picken und zu einer vollständigen Wunddehiszenz führen.
  5. Von diesem Zeitpunkt an kann die Lunge am Ende der gewünschten Reperfusionszeit direkt entnommen werden. Wenn eine ABG-Auswertung gewünscht wird, lesen Sie Schritt 5. Wenn vor der Tötung eine zusätzliche intravenöse Injektion gewünscht wird, siehe Schritt 6. Dies ist eine unheilbare Operation.
  6. Wenn die Reperfusionszeit länger als ein paar Stunden sein soll, schalten Sie das Isofluran aus, damit die Maus aus der Narkose erwachen und extubieren kann. Zu den Kriterien für die Extubation gehören Zuckungen mit Pfotenkneifen sowie spontane Atmung und Bewegung. Das Aufwachen einer Maus aus der Ketamin- und Isofluran-Anästhesie dauert in der Regel 30-45 Minuten. Dies ist eine Überlebensoperation.
    1. Für die Überlebensoperation injizieren Sie 1 ml warme Kochsalzlösung subkutan, um Flüssigkeitsverluste durch die Operation auszugleichen. Injizieren Sie Buprenorphin (Dosis 0,05 - 0,1 mg/kg Körpergewicht) subkutan vor der Operation zur Schmerzkontrolle. Wiederholen Sie die Anästhesie alle 4-6 Stunden für mindestens 3 Tage nach der Operation. Erwägen Sie eine Bupivacain-Blockade entlang des Schnitts zur zusätzlichen Schmerzkontrolle.

5. ABG-Evaluierung

HINWEIS: Wenn eine ABG-Messung gewünscht wird, wird diese am besten durch arterielle Blutaspiration aus dem linken Ventrikel erreicht. Um sicherzustellen, dass das ABG nur die Funktion der linken Lunge widerspiegelt, sollte dieses arterielle Blut nach etwa 4 Minuten nach dem Einklemmen des rechten Hilumsgewonnen werden 22,23, während dieser Zeit wird nur die linke Lunge mit Sauerstoff versorgt und beatmet.

  1. Wenn die Maus nach einer hilären Klemmung aus der Narkose geweckt wurde, betäuben und intubieren Sie die Maus gemäß Schritt 1.
  2. Etwa 15-20 Minuten vor Ablauf der gewünschten Reperfusionszeit die Maus in Rückenlage legen und alle vier Gliedmaßen mit Klebeband sichern.
    HINWEIS: Für die folgenden Schritte, die vor dem Ende der Reperfusion durchgeführt werden müssen, sollte ausreichend Zeit eingeplant werden. Der genaue Zeitpunkt für die Öffnung von Bauch und Brust hängt vom Chirurgen und seiner Erfahrung ab.
  3. Führen Sie eine Mittellinienlaparotomie vom Schambein bis zum Xiphoid durch, indem Sie mit einer Schere die Haut und anschließend die Bauchdecke entlang der Linea alba einschneiden (siehe Abbildung 5A-B).
  4. Am Xiphoid wird die Laparotomie links und rechts bis zur vorderen Achsellinie verlängert, wobei man der Krümmung der untersten Rippe folgt (siehe Abbildung 5C).
  5. Schneiden Sie vom Bauch aus das vordere Zwerchfell in der Mittellinie ein, um in den Brustkorb einzudringen, und achten Sie darauf, nicht zu tief zu gehen, um eine Verletzung des Herzens zu vermeiden (siehe Abbildung 5D-E). Verlängern Sie dann den vorderen Zwerchfellschnitt nach links und rechts bis zur vorderen Achsellinie entlang der untersten Rippe (siehe weiße gestrichelte Linie in Abbildung 5D).
  6. Teilen Sie die beidseitigen Rippen entlang der vorderen Achsellinie, die sich nach oben zur Achselhöhle erstrecken, um eine Clamshell-Thorakotomie zu erhalten. Reflektieren Sie dann die vordere Brustwand (Brustbein und bilaterale vordere Rippen), was eine vollständige Freilegung des Herzens und der beidseitigen Lunge ermöglicht (siehe weiße gestrichelte Linien in Abbildung 5F).
  7. Bringen Sie eine Klemme an der vorderen Brustwand an, die nach cephalad geklappt wird, um die Retraktion zu erleichtern. Ziehen Sie das Zwerchfell mit einer gebogenen Mückenklemme in der Mittellinie nach unten zurück, um die Sichtbarkeit des Brustkorbs zu verbessern (siehe Abbildung 5F).
  8. Um die rechte Lunge (die 4 Lappen hat) vollständig zu mobilisieren, führen Sie den akzessorischen Lappen, der über die Mittellinie in die linke Brust hinausragt, wieder in die rechte Brust zurück (siehe Abbildung 5G-H). Es gibt ein dünnes Band, das diesen Lappen an der linken Brust befestigt - teilen Sie es entweder stumpf mit Applikatoren mit Wattespitze oder scharf mit einer Schere.
    HINWEIS: Dieser Zubehörlappen kreuzt die Mittellinie hinter der unteren Hohlvene (IVC), daher muss darauf geachtet werden, dass die IVC bei diesem Manöver nicht verletzt wird.
  9. Sobald alle Lappen wieder in die rechte Brust zurückgeführt sind, reflektieren Sie die gesamte rechte Lunge nach vorne und platzieren Sie eine weitere 6-0 Seidenkrawatte (auf ~10 cm geschnitten) hinter dem rechten Hilum. Setze dann die rechte Lunge wieder in die Brust über der Krawatte ein.
  10. Binden Sie einen weiteren Slipknot um den rechten Hilum mit der gleichen Technik wie in Schritt 3.4 beschrieben, wobei Sie darauf achten, alle vier Lappen der rechten Lunge zu umschließen. Dieser rechtshiläre Klemmschritt sollte so geplant werden, dass er etwa 4 Minuten vor dem Ende der Reperfusion liegt.
  11. Beschichten Sie eine 1/2 Zoll große 31G-Nadel auf einer 1-cm³-Tuberkulinspritze mit etwa 200 μl Heparin 1000 Einheit/ml. Ziehen Sie dazu das Heparinvolumen nach oben und ziehen Sie den Kolben 3-4 Mal wiederholt hin und her, damit das Heparin die gesamte Innenseite der Spritze beschichten kann. Dies geschieht, um das Risiko einer Gerinnung von aspiriertem Blut während des Transports von der Operationsstation zur ABG-Maschine zu minimieren.
  12. Nach 4 Minuten des Klemmens des rechten Hilus aspirieren Sie arterielles Blut aus dem linken Ventrikel in die mit Heparin beschichtete Spritze (siehe Abbildung 5I). Achten Sie darauf, dass das Ventrikelseptum nicht durchstochen wird und versehentlich venöses rechtsventrikuläres Blut aspiriert wird. Es gibt einen deutlichen Farbunterschied zwischen dem dunkleren rechten Ventrikel und dem helleren linken Ventrikel (siehe Abbildung 5I Einschub). Winkeln Sie die Nadel in Richtung des linken Halses an. Möglicherweise sind mehrere Punktionen erforderlich, um genügend Blut für einen ABG (~150 μl) zu erhalten.
    HINWEIS: Während der 4 Minuten der rechten hilaren Klemmung kann die Maus beginnen, eine agonale Atmung zu zeigen, die den bevorstehenden Tod ankündigt. In diesem Fall sollte arterielles Blut vor einem Herzstillstand zügig abgesaugt werden. Es ist nicht möglich, Blut aus einem nicht schlagenden Herzen zu aspirieren.
  13. Lassen Sie das arterielle Blut auf einem ABG-Gerät laufen, um unter anderem die Sauerstoffsättigung, den Sauerstoffpartialdruck und den Kohlendioxidpartialdruck zu erhalten. Euthanasieren Sie die Maus nach ABG-Entnahme und/oder Antikörperbehandlung (siehe Schritt 6).

6. Intravenöse Antikörperinjektion zur Messung der Zellextravasation

HINWEIS: Diese Technik kann verwendet werden, um die Zellextravasation durch intravenöse Injektion von Fluorochrom-markierten Antikörpern in die IVC vor der Tötung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen, wie zuvor veröffentlicht18. Kurz gesagt, intravaskuläre Neutrophile können von interstitiellen Neutrophilen unter Verwendung von neutrophilenspezifischen Anti-Ly6G-Antikörpern unterschieden werden. Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC-markiertes) Anti-Ly6G (Klon 1A8) wird 5 Minuten vor der Tötung intravenös injiziert, wodurch die zirkulierenden intravaskulären Neutrophilen markiert werden. Die Konzentration des verwendeten FITC-Ly6G-Antikörpers beträgt 100 ng verdünnt in 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach der Vorbereitung einer Einzelzellsuspension aus der linken Lunge für die Durchflusszytometrie werden alle Neutrophilen mit Allophycocyanin-markiertem (APC-markiertem) Anti-Ly6G (Klon 1A8) markiert. Somit sind APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ Neutrophile intravaskulär, während APC-Ly6G+FITC-Ly6G- extravaskulär oder interstitiell sind. Diese Technik kann beispielsweise an Monozyten mit Anti-Ly6C-Antikörpern, B-Zellen mit Anti-CD19-Antikörpern angepasst werden.

  1. Laden Sie den gewünschten Antikörper in eine 3/10-cm³-Spritze mit einer 5/16-Zoll-31G-Nadel, wobei darauf zu achten ist, dass die Luftblasen in der Spritze minimiert werden. Verwenden Sie dies für die intravenöse Injektion in die IVC in Schritt 6.5.
  2. Führen Sie die Laparotomie gemäß den Schritten 5.3-5.4 durch.
  3. Nach der Laparotomie führen Sie die rechte mediale viszerale Rotation stumpf mit zwei spitzen Applikatoren mit Wattespitze durch. Bei einer Maus geschieht dies, indem der gesamte Darm links vom Bauch ausgeweidet wird, was eine klare Sicht auf die IVC ermöglicht (siehe Abbildung 6A).
  4. Entfernen Sie das Fett, das über der IVC liegt, stumpf mit Applikatoren mit Wattespitze.
  5. Injizieren Sie die Antikörperlösung mittels Venenpunktion in die IVC (siehe Abbildung 6B). Nach der Extraktion der Nadel üben Sie sofort mit einem Wattestäbchen leichten Druck auf die Stelle der Venenpunktion aus, bis sie hämostatisch ist (in der Regel ca. 2-3 Minuten).
  6. Bringen Sie den ausgeweideten Darm über das Wattestäbchen in den Bauch zurück, um weiterhin Druck auf die IVC auszuüben (siehe Abbildung 6C).
  7. Führen Sie eine Clamshell-Thorakotomie gemäß den Schritten 5.5-5.7 durch, um die linke Lunge zu entnehmen. Lassen Sie die Antikörper mindestens 5 Minuten Zeit haben, um systemisch zu zirkulieren, bevor sie geschlachtet und geerntet werden. Euthanasieren Sie die Maus nach der ABG-Entnahme und/oder Antikörperbehandlung.

7. Histologische (H&E) Färbung

  1. Nach der Formalinfixierung und Paraffineinbettung der linken Lunge und dem Schnitt auf eine Dicke von 5 μm wird der Objektträger in Xylol entparaffinisiert (zwei 10-minütige Wäschen).
  2. Dehydrieren in sequentiellen Ethanol-Wäschen: 2x 5 min Wäschen mit 100%, 1x 2 min Wäsche mit 95% und 1x 2 min Wäsche mit 70% Ethanol. Dann in entionisiertem Wasser abspülen.
  3. Färben Sie den Objektträger 2-4 Minuten lang mit Hämatoxylin und waschen Sie ihn dann 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser oder bis er klar ist. Die genaue Dauer der Hämatoxylin-Färbung muss auf das Gewebe und die gewünschte Intensität der Kernfärbung abgestimmt werden.
  4. 30 s lang in der definierenden Lösung waschen, um die Flecken zu unterscheiden, dann 2 Minuten lang in Wasser waschen. In blauer farbbildender Lösung 30 s waschen, dann 2 min in Wasser waschen.
  5. Dehydrieren Sie weiter, indem Sie 15x in 95% Ethanol eintauchen. 1 Min. in Eosin einfärben.
  6. Dehydrieren Sie mit 2 min Ethanol-Waschungen (2x), gefolgt von 2 min Xylol-Waschungen (2x). Montagemedium und Deckglas aufbringen.

Ergebnisse

Nach linker hilärer Klemmung beträgt der Partialdruck der Oxygenierung im arteriellen Blut (PaO2), der der linken Lunge zugeschrieben wird, ~100 mmHg, signifikant niedriger im Vergleich zu den ~500 mmHg nach Scheinthorakotomie (Abbildung 7A, n=6-7). Bemerkenswert ist, dass Schein-Thorakotomien bei B6-Mäusen durchgeführt wurden, wobei die ABG-Messung nach 4 Minuten nach rechtsem Hilar-Clamping durchgeführt wurde, was den Werten entspricht, die nur der linken Lunge zugeschrieben werden. Die H&E-Färbung der hilären geklemmten linken Lunge zeigte eine Infiltration von Entzündungszellen, die die Atemwege füllten und die Blutgefäße mit Erythrozyten anschwollen, während diese Befunde in der naiven linken Lunge nicht vorhanden sind (Abbildung 7B, n=2). Diese Ergebnisse zeigen die unmittelbare Gewebeschädigung und Zellinfiltration nach einer Phase der Ischämie und Reperfusion.

Wie in Schritt 6 diskutiert, können intravaskuläre und interstitielle Neutrophile durch intravenöse Injektion von FITC-markierten Anti-Ly6G-Antikörpern 5 min vor der Tötung unterschieden werden, gefolgt von der Markierung aller Neutrophilen mit APC-Ly6G-Antikörpern18,24. Repräsentative Diagramme zeigen, dass ~75% der Neutrophilen intravaskulär (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) und ~25% interstitiell (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) nach hilärer Klemmung der linken Lunge sind (Abbildung 7C, n=4). Diese Ergebnisse zeigen eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Neutrophilenextravasation und können je nach den verwendeten Antikörpern (z. B. Anti-Ly6C für Monozyten, Anti-CD19 für B-Zellen) an andere Zelltypen angepasst werden. Diese Technik ist nützlich für die Untersuchung der Zelldynamik nach IRI.

figure-results-1
Abbildung 1: Intubation der Maus. (A) Maus mit rasierter linker Brust und Bauch. (B) Endotrachealtubus, der mit dem Beatmungsschlauch verbunden ist. (C) Sobald die Intubation bestätigt ist, kleben Sie den Schlauch umlaufend an die Nase der Maus. (D) Intubierte Maus mit Zu- und Abflussschlauch vom und zum Beatmungsgerät für Kleintiere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Linke Thorakotomie. (A) Hautschnitt über dem 4. Interkostalraum (ICS). (B) Muskelschichten, die über den 4. Interkostalraum verteilt sind. (C) Kleiner Schnitt knapp über der 5. Rippe . (D) Verlängerung der Inzision nach anterior und posterior im 4. ICS. (E) Lunge im 4. ICS visualisiert. (F-G) Rippenaufroller platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Linke hiläre Klemme. (A) Linke Lunge mit Wattestäbchen mobilisiert. (B) Unteres Lungenband (IPL) sichtbar. (C) Wenn die linke Lunge nach vorne geklappt ist, wird die Seidenkrawatte hinter dem Hilum platziert. (D) Wenn die linke Seite nach hinten über die Seidenkrawatte gekippt ist, ist das vordere Hilum sichtbar. (E) Instrumentenbinde des Schlupfknotens über dem linken Hilum. (F) Slipknot auf Hilum. (G) Bei manuellem Verschluss des Ausflusses bläst sich die linke Lunge nicht auf, was auf eine erfolgreiche hiläre Klemmung hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Lösen der linken Hilarklemme und des linken Brustverschlusses. (A) Nach dem Lösen des Slipknots wird die linke Lunge wieder aufgeblasen. (B) Rippenverschluss mit einem Bissen knapp über der 4. Rippe und (C) einem Bissen knapp über der 6. Rippe. (D-E) Die Brust wird mit einem Stich geschlossen, der am Ende der Inspiration festgebunden wird. (F) Hautverschluss mit unterbrochenen Stichen (nach Muskelschichtverschluss mit Laufstich). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Laparotomie, bilaterale Clamshell-Thorakotomie und arterielle Blutentnahme. (A) Maus in Rückenlage angepasst. (B) Hautschnitt über der Mittellinie des Bauches. (C) Laparotomie, die sich vom Xiphoid bis zum Schambein erstreckt, mit Ausdehnung links und rechts entlang der untersten Rippe. (D-E) Öffnung des Zwerchfells zum Eintritt in die Brusthöhle, mit Verlängerung des Zwerchfellschnitts links und rechts entlang der untersten Rippe (gestrichelte Linie). (F) Bilaterale Clamshell-Thorakotomie mit Schnitten in den vorderen Achsellinien (gestrichelte Linie) in Richtung der Brustspitze. (G) Akzessorionslappen der rechten Lunge, der sich in die linke Brust hinter der unteren Hohlvene erstreckt. (H) Der akzessorische Lappen wird mobilisiert und in den rechten Brustkorb zurückgeführt. (I) Aspiration von arteriellem Blut aus dem linken Ventrikel (Einschub: Farbunterschied zwischen rechtem und linkem Ventrikel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 6: Intravenöse Injektion in die Vena cava inferior. (A) Viszerale Rotation nach rechts, um die Vena cava inferior (IVC) freizulegen. (B) Injektion der Lösung in die IVC. (C) Ausüben von Druck auf die IVC, um eine Blutstillung zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-7
Abbildung 7: Repräsentative Ergebnisse der Lungenoxygenierung, der Histologie und der Neutrophilenextravasation nach linker hilärer Klemme. (A) Sauerstoffpartialdruck im arteriellen Blut einer C57BL/6-Maus, die sich einer Scheinthorakotomie vs. einer hilären Klemme unterzogen hat. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, n=6-7, dargestellt. p-Werte , die durch den Mann-Whitney U-Test berechnet wurden. **p <0,01. (B) H&E-Färbung eines formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Lungenabschnitts einer C57BL/6-Maus, die sich einer Scheinthorakotomie im Vergleich zu einer Hilarklemme unterzogen hat. Der Maßstabsbalken stellt 250 μm dar. (C) Repräsentative Verteilungszahl von intravaskulären (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) vs. extravaskulären (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) Ly6G+ Neutrophilen in einer C57BL/6-Maus nach hilärer Klemme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Einführhilfe für den Endotrachealtubus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Wir beschreiben eine hilare Clamp-Technik, bei der ein Slipknot am linken Hilum angelegt wird, der die Lungenarterie und die Venen und den Bronchus verschließt, um eine warme Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren. Nach dem hilären Klemmen kann die linke Lunge für eine Vielzahl von experimentellen Techniken wie Histologie, Durchflusszytometrie, Massen- oder Einzelzellsequenzierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Darüber hinaus können Blut und Milz verwendet werden, um systemische Wirkungen zu untersuchen, während die nicht-ischämische rechte Lunge als interne Kontrolle dienen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir auch detaillierte Methoden zur Erlangung von ABG-Messungen und/oder zur Bestimmung der Zellextravasation.

Die murine hiläre Klemmtechnik ist entscheidend für die Erforschung der Lungen-IRI und für das breitere Feld der Lungentransplantation. Unter Verwendung dieses hilären Clamp-Modells fand unsere Gruppe beispielsweise heraus, dass aus der Milz stammende klassische CCR2+-Monozyten die Neutrophilenextravasation in die Lunge nach IRI18 vermitteln. Eine andere Gruppe zeigte, dass Typ-II-Alveolarepithelzellen CXCL1 (einen neutrophilen Chemotraktor) in einer NADPH-Oxidase-IL-17-TNFα-abhängigen Weise unter Verwendung eines hilären Clamp-Modells19 produzieren. Es wurde festgestellt, dass TLR4 eine Rolle bei der Entwicklung von Ödemen in einem murinen Modell der hilären Klemmungspielt 20.

Während die orthotope murine Lungentransplantation klinisch besser anwendbar ist und sowohl warme als auch kalte Ischämie simulieren kann, führt sie auch zu chirurgischen Traumata durch vaskuläre und bronchiale Anastomosen und allogenen Reizen durch Spender-Empfänger-Mismatch. Der Hauptvorteil der Hilar-Clamp-Technik ist also ihre Fähigkeit, die Auswirkungen der Lungen-IRI von diesen anderen Faktoren zu isolieren. Darüber hinaus ist das Hilar-Clamp-Verfahren für den unerfahrenen Maus-Mikrochirurgen technisch weniger anspruchsvoll und kann im Vergleich zur Lungentransplantation schneller gemeistert werden. Eine Einschränkung des hilären Klemmmodells besteht darin, dass eine kalte Ischämie schwer zu erreichen ist. In situ wurde die kalte Ischämie bei Schweinen mit antegrader Flushperfusion über die linke Lungenarterie25 durchgeführt, was jedoch bei der Maus aufgrund ihrer geringeren Größe und der Notwendigkeit, die Normothermie während der Operation aufrechtzuerhalten, eine viel größere Herausforderung darstellt. Nichtsdestotrotz ist die Untersuchung der isolierten warmen Ischämie wichtig, da sie im Allgemeinen schädlicher für die Organfunktion ist als die kalte Ischämie 4,5,6. Darüber hinaus setzen Transplantationszentren zunehmend DCD-Lungentransplantationen ein, die von viel längeren warmen ischämischen Zeiten begleitet werden als herkömmliche DBD-Lungentransplantationen7. Daher ist eine detaillierte Untersuchung der Ereignisse während der warmen Ischämie und der anschließenden Reperfusionsphase von entscheidender Bedeutung und kann mit diesem hilären Clamp-Modell durchgeführt werden.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Variationen der hilaren Klemmtechnik entwickelt. Dazu gehören die Verwendung einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme 8,9,10,11,12,13, eines Rumel-Tourniquets14,15 und einer Krawatte mit einem Slipknot um das Hilum16. Wir beschreiben unsere Adaption der Slipknot-Technik bei Mäusen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen hilaren Klemmtechniken besteht darin, dass sie den Verschluss des Brustkorbs während der Ischämiephase ermöglicht, wodurch unmerkliche Flüssigkeitsverluste insbesondere bei Protokollen mit längeren Ischämieperioden minimiert werden. Dies kann nicht erreicht werden, wenn eine Klemme oder ein Tourniquet auf den Hilum gelegt wird.

Was die Tierselektion betrifft, so haben wir uns entschieden, dieses Modell in der Maus zu entwickeln, im Gegensatz zu Ratten- oder Großtiermodellen, wie z. B. Schweinen. Die Argumentation ist zweifach: Unser Labor verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Mikrochirurgie der Maus mit orthotoper Lungentransplantationder Maus 17. Zweitens sind Mäuse zwar kleiner und technisch schwieriger zu operieren als Ratten, aber es gibt derzeit mehr kommerziell erhältliche transgene Mausstämme als Rattenstämme26,27. Mäuse vermehren sich auch schneller, was eine schnellere Entwicklung neuer Stämme ermöglicht, was besonders nützlich ist, wenn die Immunmechanismen von IRI untersucht werden. Aus diesen Gründen haben wir uns entschieden, diese Technik an Mäusen zu entwickeln.

Unseres Wissens ist dies der erste videobasierte Artikel, der die Technik der linken Lungenklemme bei Mäusen mit einem Slipknot verwendet. Saito et al. haben einen videobasierten Artikel veröffentlicht, der die hiläre Klemme bei Ratten mit einer mikrovaskulären Klemmedemonstriert 22. Bei der Maus veröffentlichten Liao et al. ein Lungen-IRI-Modell, bei dem die Lungenarterie (PA) mit einem Slipknot eingespannt wurde, die Lunge jedoch in diesem Modell beatmet bleibt, da der Bronchus von der Klemmeausgeschlossen ist 28. Die PA-Klemmtechnik wurde als Modell zur Untersuchung von Lungenembolien29, pulmonaler Hypertonie und/oder rechtsventrikulärer Insuffizienz 30,31 verwendet. Da das Untersuchungsgebiet die Lungen-IRI bei der Transplantation ist, haben wir uns entschieden, den gesamten Hilum einschließlich des Bronchus zu klemmen, um das Barotrauma zusätzlich zur ischämischen Verletzung zu minimieren.

Bemerkenswert ist, dass 30 Minuten warme Ischämie gefolgt von 1 Stunde Reperfusion gewählt wurden, da wir an der Dynamik lungeninfiltrierender Zellen in der sehr frühen Zeit nach der IRI interessiert sind. Zum Beispiel haben Studien über eine Hochregulierung von zytoprotektiven Genen wie Hämoxygenase 1 nach nur 30 Minuten Ischämie, gefolgt von 2 Stunden Reperfusionberichtet 13. Bisher ging man davon aus, dass Neutrophile der zentrale Zelltyp sind, der nach IRI32 in die Lunge infiltriert, aber wir zeigten, dass Monozyten den Neutrophilen bei ihrer Ankunft in der Lunge vorausgehen 18,24. In jüngerer Zeit fanden wir heraus, dass B-Zellen sogar Monozyten vorausgehen und innerhalb von 1 h nach der Reperfusion in die Lunge gelangen (unveröffentlichte Daten). Bei der Anpassung dieser Technik können die Dauer der warmen Ischämie und der Reperfusion je nach Studienfrage und Hypothese angepasst werden. Längere Perioden warmer Ischämie sind möglich, ohne dass ein übermäßiger Flüssigkeits- und Wärmeverlust zu befürchten ist, da die Brust während dieser Zeit geschlossen werden kann.

Perioperativ können mehrere Komplikationen auftreten, wobei das letztendliche häufige Ergebnis ein perioperativer Tod ist. Wir haben beobachtet, dass die Häufigkeit des Todes von Tieren während der Operation mit der Wiederholung der Technik durch den Chirurgen abnimmt. Wir schätzen, dass Chirurgen mindestens 2 Monate Praxis und/oder mindestens 20 Fälle benötigen, um ein Plateau in der Fertigkeit zu erreichen. Zu diesem Zeitpunkt schätzen wir, dass intraoperative Mortalität in etwa 1 von 50 Fällen auftritt. Der Tod bei der anästhesierten Maus wird oft durch agonale Atemzüge angekündigt, die mit kräftigen Kontraktionen des Zwerchfells und der Brustwandmuskulatur einhergehen. Mit dem Einsetzen dieser qualvollen Atemzüge tritt der Tod in 3-5 Minuten ein, wenn keine Intervention erfolgt. Es gibt mehrere Ursachen, die den intraoperativen Tod auslösen können, von denen viele erkennbar und vermeidbar sind. Im Folgenden werden die kritischen Schritte dieser Operation und die Techniken zur Fehlerbehebung hervorgehoben, um ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen.

Intubation
Der erste kritische Schritt ist die sorgfältige Intubation und Sicherung der Atemwege, um eine versehentliche Extubation zu verhindern. Bei einer Überlebensoperation ist es besonders wichtig, darauf zu achten, dass die Stimmbänder bei der Erstintubation nicht geschädigt werden, da die Maus nach der Extubation nicht mehr atmen kann. Das Vorschieben des ETT über die Stränge hinaus sollte unter direkter Visualisierung durch das Mikroskop erfolgen. Wenn während der Intubation ein Widerstand auftritt, sollte der ETT nicht blind vorgeschoben werden. Während der Oropharynx mit der Mückenklemme offen gehalten wird, sollte darauf geachtet werden, dass die Mundschleimhaut nicht durchstochen wird, da das Blut die Sicht auf die Atemwege verdeckt. Die Anzahl der Intubationsversuche sollte auf weniger als fünf begrenzt werden.

Versehentliche Extubation
Wenn sich die Lunge zu irgendeinem Zeitpunkt während des Eingriffs nicht richtig aufzublähen scheint, ist es möglich, dass sich das ETT gelöst hat. Eine weitere Manifestation der versehentlichen Extubation, die über einen längeren Zeitraum unbemerkt bleibt, ist die plötzliche agonale Atmung der Maus. Nach der ersten Intubation sollte darauf geachtet werden, dass das ETT mit Seidenband umlaufend gut an der Nase befestigt wird, und die Anpassung von Hals und Rumpf der Maus sollte begrenzt sein. Wenn sich weder die linke noch die rechte Lunge aufblähen, kann der ETT aus der Luftröhre gekommen sein. Es kann versucht werden, das ETT wieder hineinzuschieben, aber die Maus muss möglicherweise schnell wieder intubiert werden, um einen vorzeitigen Tod des Tieres zu vermeiden. Wenn sich nur eine Lunge aufbläht, obwohl beide zu erwarten sind, ist das ETT möglicherweise zu tief und sollte vorsichtig zurückgezogen und wieder gesichert werden.

Mobilisierung der Lunge
Die Mobilisierung der linken Lunge sollte mit Applikatoren mit Wattespitze und sanftem Druck auf das Lungenparenchym erfolgen, da eine Kompressionsverletzung die Alveolen schädigen und die Compliance der Lunge verringern kann. Die Lunge sollte nicht mit einer Zange oder Klammer gegriffen werden, da dies das Lungenparenchym schädigt.

Anwendung der hilaren Klemme
Die linke Hilarklemme sollte unter direkter Sichtweite platziert werden, wobei darauf zu achten ist, dass der Knoten nicht zu mittig (um den linken Vorhof nicht zu erfassen) oder zu peripher (um kein Lungenparenchym zu fangen) abgelegt wird. Das Einfangen des linken Vorhofs mit der hilären Klemme führt wahrscheinlich zu Vorhofflimmern und anschließendem Tod. Die Visualisierung des Hilums kann verbessert werden, indem eine ausreichende Rippenretraktion zur Erweiterung des Sichtfeldes sichergestellt wird. Nach dem Festbinden des Slipknotens ist es sinnvoll, sicherzustellen, dass die Klemme vollständig okklusiv ist, indem ein Rekrutierungsmanöver durchgeführt wird - indem der Abflussschlauch, der den ETT mit dem Beatmungsgerät verbindet, manuell verschlossen wird und sichergestellt wird, dass sich die linke Lunge nicht bei Überdruck ausdehnt. Ein Gefäßverschluss wird bei Bestätigung des Bronchialverschlusses vermutet, da die Kollabierbarkeit der Lungenarterie und der Lungenvenen im Vergleich zum Knorpelbronchus erhöht ist. Darüber hinaus sollte die hiläre Klemme nicht mit übermäßiger Kraft gebunden werden, da sie die knorpeligen Anteile des linken Hauptstammbronchus zerquetscht und eine Ausdehnung der linken Lunge nach dem Lösen der hilären Klemme verhindert. Sobald die hiläre Klemme gelöst ist, ist es wichtig, durch ein weiteres Rekrutierungsmanöver zu überprüfen, ob die Lunge noch beatmet werden kann.

Verschluss auf der Brust
Beim Schließen des Brustkorbs sollten die 4. und 5. Rippe zusammengeführt werden, wenn die Lunge am maximalen Ende der Inspiration ist. Dadurch wird die Menge an Luft minimiert, die in der Pleurahöhle verbleibt, was zu einem Pneumothorax führen würde, sobald die Rippen geschlossen sind. Die Muskelschichten und die Haut sollten luftdicht verschlossen werden, um die Entstehung eines Spannungspneumothorax zu vermeiden.

Abrufen von ABGs
Schließlich ist es bei der Entnahme von ABGs wichtig, zuerst das rechte Hilum zu klemmen, so dass die ABG-Messung nur die Funktion der linken Lunge widerspiegelt22,23. Ohne die rechte hiläre Klemme wird die normal belüftete rechte Lunge die geschädigte ischämische linke Lunge mehr als ausgleichen und die ABG-Messungen erscheinen normal.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hilar-Clamp-Technik, die wir oben beschrieben haben, ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Lungentransplantation ist und vor allem die Untersuchung der warmen IRI ohne die Einführung von Allogenität, chirurgischem Anastomose-bedingtem Trauma oder kalter ischämischer Lagerung isolieren kann. Bemerkenswert ist, dass diese beschriebene Technik des hilären Klemmens leicht zu erlernen und weithin anwendbar ist und zu zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen führen kann.

Offenlegungen

Die Autoren berichten über keine relevanten Angaben.

Danksagungen

Diese Arbeit erhielt keine spezifische Unterstützung von einer Förderagentur im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Medications
10% Povidon-Jod-LösungAplicareNDC 52380-0126-2Für Desinfektionsmittel
Buprenorphin 1,3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Für die Schmerzkontrolle
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18Für die Schmerzkontrolle
Heparin 1000 Einheiten/mlSagentNDC 25021-404-01Zur Gewinnung von arteriellem Blut
Isofluran 1%-1,5%Sigma Aldrich26675-46-7Für die Anästhesie
Ketaminhydrochlorid 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Für die Anästhesie
Puralube Vet AugensalbeMedi-Vet.com11897Zur Vorbeugung der Augenaustrocknung
Xylazin 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Zur Schmerzkontrolle
Werkzeuge und Instrumente
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231Zur Koagulation von Blutgefäßen
Gebogene MoskitoklemmeFine Science Tools13009-12Für chirurgische
Eingriffe Fein gebogene PinzetteFine Science Tools11274-20Für chirurgische Eingriffe für chirurgische
Feine SchereFine Science Tools15040-11Für chirurgische Eingriffe
Einrichtung der IntubationsklemmeFine Science Tools18374-44, 18144-30Zum vertikalen Halten der Maus an der Zunge während der Intubation. Siehe ergänzende Abbildung 1A.
Magnetische RippenretraktorenFine Science Tools18200-01, 18200-10Für die Retraktion der Thorakotomie. Magnetfixateur und Retraktor sollten über einen Mikrolatexschlauch unten verbunden werden.
Optische Kunststoff-Glasfaser in optischer Qualität, unummantelt, 500 μm; mEdmund Optics02-532Zur Herstellung des Einführrohrs für den Endotrachealtubus. Siehe Ergänzende Abbildung 1B. Eine Länge von 1,5 Zoll dieser optischen Faser sollte an einem Ende mit einem Stück Seidenband befestigt sein. Es kann dann als Einführhilfe für den Endotrachealtubus verwendet werden. Das Ende des Einführgeräts sollte leicht gebogen sein.
Power Pro Ultra HaarschneidemaschineOster078400-020-001Zum Schneiden
von Haaren SchereFine Science Tools14370-22Für chirurgische Eingriffe
Heizkissen für KleintiereK& H Pet ProductsThermo-Peep HeizkissenZur Aufrechterhaltung der Normothermie
Beatmungsgerät für KleintiereHarvard Apparatus55-0000Zur Beatmung (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Gummischlauch (1/8 Zoll Außendurchmesser, 1/16 Zoll Innendurchmesser)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Zum Einziehen von
Thorakotomie-Stat-Profil Prime Blutgasanalysator für die IntensivpflegeNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		Zur Retraktion der Thorakotomie
Gerade KlemmeFine Science Tools13008-12Für chirurgische
Eingriffe Gerade PinzetteFine Science Tools91113-10Für chirurgische Eingriffe
OperationsmikroskopWild Heerbruggwird nicht mehr hergestelltFür Intubationen und chirurgische Eingriffe; ersetzen durch Leica Operationsmikroskope
Supplies
½ cc Spritze mit ½ Zoll 29G NadelMcKesson942665Zur intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin
½ Zoll 31G Nadel auf eine 1 cc TuberkulinspritzeMcKesson16-SNT1C2705Zur Aspiration von arteriellem Blut aus dem linken Ventrikel
1 Zoll 20G IV KatheterTerumoSROX2025CAFür Endotrachealtubus (ETT)
1 Zoll Seide KlebebandDurapore3M ID 7100057168Zum Abkleben von ETT an die Nase und zum Sichern von Gliedmaßen
3/10 cc Spritze mit 5/16 Zoll 31G NadelMcKesson102-SN310C31516PFür die Injektion von Antikörpern in die untere Hohlvene
6-0 monofile Naht auf einer P-10 NadelMcKessonS697GXZum Verschluss von Thorakotomie, Muskelschicht und Haut
6-0 SeidenkrawatteSurgical Specialties LookSP102Zur Herstellung von Slipknot für Hilar
Clamp Spitz zulaufende Applikatoren mit WattespitzeSolon56225Zur Manipulation der Lunge und zum stumpfen Dissektionieren
Eingriffe

Referenzen

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

Tags

Klemmen des LungenhilusLungenverletzung bei M usenNeutrophilen ExtravasationB Zell RekrutierungDurchflusszytometrieThorakotomie Verfahrenarterieller BlutgaswertLungentransplantationsmodell
Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.