Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Summary

Die Arbeit beschreibt die Optimierung von Fluoreszenzmikroskopie-Erfassungsparametern, um den axonalen Transport von endogenen markierten Frachten mit Einzelneuronenauflösung in einem lebenden Fadenwurm sichtbar zu machen.

Abstract

Der axonale Transport ist eine Voraussetzung, um axonale Proteine von ihrem Syntheseort im neuronalen Zellkörper zu ihrem Bestimmungsort im Axon zu transportieren. Folglich beeinträchtigt der Verlust des axonalen Transports das neuronale Wachstum und die Funktion. Die Erforschung des axonalen Transports verbessert daher unser Verständnis der neuronalen Zellbiologie. Mit den jüngsten Verbesserungen in der CRISPR-Cas9-Genomeditierung ist die endogene Markierung axonaler Frachten zugänglich geworden, was es ermöglicht, über die ektopische expressionsbasierte Visualisierung des Transports hinauszugehen. Die endogene Markierung geht jedoch oft auf Kosten einer geringen Signalintensität und erfordert Optimierungsstrategien, um robuste Daten zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports, indem wir Akquisitionsparameter und einen Bleaching-Ansatz diskutieren, um das Signal endogener markierter Fracht über diffusen zytoplasmatischen Hintergrund zu verbessern. Wir wenden unser Protokoll an, um die Visualisierung von synaptischen Vesikelvorläufern (SVPs) zu optimieren, die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markiertem RAB-3 markiert sind, um hervorzuheben, wie die Feinabstimmung von Erfassungsparametern die Analyse endogen markierter axonaler Fracht in Caenorhabditis elegans (C. elegans) verbessern kann.

Introduction

Während ihres gesamten Lebens sind Neuronen auf den axonalen Transport angewiesen, um Proteine, Lipide und andere Moleküle vom Zellkörper zu ihrem endgültigen Bestimmungsort im Axon zu transportieren. Folglich ist eine Beeinträchtigung des axonalen Transports mit einem Verlust der neuronalen Funktion verbunden und ist häufig an der Pathologie neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt ^1,2. Daher ist das Verständnis der Mechanismen, die dem axonalen Transport zugrunde liegen, von großem Interesse.

Mehrere Jahrzehnte der Forschung über den axonalen Transport haben viele wichtige Erkenntnisse über die molekulare Maschinerie, die diesen Transport vermittelt, ihre Zusammensetzung sowie die Regulationsmechanismen zutage gefördert. Der langreichweitige axonale Transport findet am Mikrotubuli-Zytoskelett statt, das aus teilweise überlappenden Mikrotubuli-Polymeren besteht, die typischerweise mit ihrem Plus-Ende nach außen in den Axonen³ orientiert sind. Folglich wird der anterograde Transport durch Motorproteine vermittelt, die bis zum Plus-Ende der Mikrotubuli, den Kinesinen, gehen, während der retrograde Transport vom Minus-Ende des Dynein-Motors abhängt. Obwohl viele Aspekte des Transports geklärt sind, ist für viele axonale Proteine immer noch unklar, wie sie in die Transportmaschinerie geladen werden, wie die einzelnen Transportpakete organisiert sind und wie dieser Transport reguliert wird³.

Der axonale Transport wurde zunächst in Radiomarkierungsexperimenten untersucht, bei denen radioaktiv markierte Aminosäuren in das somatische Kompartiment injiziert wurden, wo sie in entstehende endogene Proteine eingebaut wurden und im Laufe der Zeit im axonalen Kompartiment durch Autoradiographie verfolgt werden konnten⁴. Obwohl Radiomarkierungsexperimente die Untersuchung des axonalen Transports endogener Proteine in vivo ermöglichten, ermöglichen sie keine direkte Verfolgung des Verhaltens einzelner Fracht, um mechanistische Erkenntnisse zu gewinnen⁴. Diese Einschränkung wurde durch den Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie überwunden. Der axonale Transport wird jedoch oft nicht an endogenen Proteinen sichtbar gemacht, sondern durch die Expression einer fluoreszenzmarkierten Kopie. Insbesondere bei niedrig exprimierten Proteinen liefert die Überexpression höhere Signalintensitäten, die eine Visualisierung, vorzugsweise mit Einzelneuronenauflösung, ermöglichen. Darüber hinaus umgeht die ektopische Expression des fluoreszierend markierten Proteins die Notwendigkeit und die Herausforderungen der Genom-Editierung. Umgekehrt wurde argumentiert, dass sich das Verhalten der ektopisch exprimierten Fracht von dem der endogenen Fracht^{unterscheiden kann 5}.

Jüngste Verbesserungen bei der Genom-Editierung haben endogene Markierungsstrategien leichter zugänglich gemacht. Daher ist eine geringere Signalintensität zur Haupteinschränkung bei der Untersuchung des axonalen Transports einer Fracht durch ektopische Expression anstelle von endogener Markierung geworden. Sorgfältige Überlegungen in der endogenen Markierungsstrategie gepaart mit einer Optimierung der Erfassungsbedingungen können diese Herausforderung meistern.

Nematoden stellen aufgrund ihrer Transparenz und Leichtigkeit bei genetischen Manipulationen ein hervorragendes Forschungsmodell für die Untersuchung des axonalen Transports in vivo dar. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Forschungsstrategie zur Visualisierung des axonalen Transports endogener Proteine mit Einzelneuronenauflösung in lebenden Caenorhabditis elegans. Wir visualisieren den axonalen Transport von synaptischen Vesikelvorläufern anhand eines Stammes, der vom Jorgensen Lab⁶ erzeugt wurde, in dem die Vesikel-assoziierte RAB-GTPase RAB3 endogen mit GFP markiert ist, im Motoneuron DA9. Durch die Frage, wie kleine Anpassungen in verschiedenen Aufnahmeparametern und Photobleaching die Visualisierung einzelner Transportereignisse verbessern können, liefert das Protokoll Ideen, wie die Bildgebungsbedingungen optimiert werden können.

Protocol

Ein detailliertes Protokoll zur Pflege und Vorbereitung von Nematoden für die Bildgebung lebender Zellen finden Sie in der Arbeit von S.Niwa ⁷.

1. Erzeugung von Wurmstämmen

Neben der Generierung von Nematodenstämmen enthält das Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ eine wachsende Sammlung von Nematodenstämmen mit endogen fluoreszierend markierten Proteinen, die direkt von ihrer Webseite bezogen werden können.

1. Wahl der Fluoreszenzmarkierungsstrategie
   1. Verwenden Sie den Nematodenstamm MTS1161, der das rab-3(ox699)-Allel⁶ enthält, um endogenes GFP-markiertes RAB-3 im Motoneuron DA9 sichtbar zu machen (der Stamm wird am CGC abgelagert). Um andere axonale Proteine sichtbar zu machen, erzeugen Sie einen Nematodenstamm mit einem endogenen markierten Protein, indem Sie das CRISPR Cas9-Editing-Protokoll aus dem Mello Lab⁹ verwenden.
      HINWEIS: MTS1161 verwendet einen Rekombinationsansatz, um RAB-3 zellspezifisch endogen mit einem GFP-Tag⁶ zu markieren. Ein gängiger alternativer Ansatz basiert auf der Rekonstitution eines gesplitteten fluoreszierenden Proteins, das für besonders niedrig exprimierte Proteine empfohlen wird, da es die fluoreszierende Kopienzahl pro endogenem Protein durch die Verwendung mehrerer geteilter fluoreszierender Kopien^{erhöht 10}. Die Kopienzahl kann zunächst auf der Grundlage von Transkriptom-Datensätzen von der CenGen-Webseite (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹ geschätzt werden.
2. Wahl des Neurons zur Visualisierung des axonalen Transports
   1. Im Stamm MTS1161 ist RAB-3 im Motoneuron DA9 sichtbar zu machen (siehe Abbildung 1). Für andere axonale Frachten, insbesondere niedrig exprimierte Proteine, identifizieren Sie ein Neuron, in dem die Expressionsniveaus des analysierten Proteins am höchsten sind, indem Sie die CenGen-Webseite verwenden.
      HINWEIS: Das CenGen-Projekt (cengen.org) bietet eine großartige Online-Ressource zur Schätzung des Expressionsniveaus für ein Protein, das in vielen Neuronen des Fadenwurms von Interesse ist, basierend auf einem großen transkriptomischen Datensatz, der alle 302 Neuronen des Nervensystems von C. elegans abdeckt^12,13.

2. Umgang mit Schnecken und Vorbereitung für die Bildgebung

1. Pflegen Sie Nematoden auf einem Rasen mit Bakterien (Stamm: OP50), die bei 20 °C auf Nematodenwachstumsmittelplatten ausgesät und für die Bildgebung bis zu einem Alter von 1 Tag bis ins Erwachsenenalter herangewachsen sind.
   HINWEIS: Die Messung des axonalen Transports in einem definierten Altersstadium ist wichtig, da die Transportraten mit zunehmendem Alter über verschiedene axonale Frachten, Neuronenklassen und Organismen hinweg konsistent abnimmt. 14,15,16,17,18-Nematoden im Larvenstadium L4 oder 1 Tag im Erwachsenenalter wurden in den meisten Arbeiten verwendet und bieten daher die größten Datensätze für Vergleiche.
2. Nematoden für die Bildgebung lebender Zellen vorbereiten: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte mit einem Stereomikroskop durch, um die Würmer zu visualisieren und zu behandeln.
   1. Übertragen Sie Nematoden mit einem Platindrahtpickel auf einen Tropfen 0,5 mM Levamisol und inkubieren Sie die Nematoden 20 Minuten lang in dem Tröpfchen.
   2. Montieren Sie vorsichtig 10-20 Nematoden aus dem Levamisol-Tröpfchen in ein 12-μl-Tröpfchen M9-Medium auf einem 10%igen Agarose-Pflaster (gelöst in M9-Medium) auf einem Objektträger, indem Sie einen Haarspickel verwenden. Ein detailliertes Verfahren zur Herstellung eines 10%igen Agarosepflasters finden Sie im Protokoll von S.Niwa⁷.
      HINWEIS: Die Montage einer geringen Anzahl von Nematoden ist ausreichend, da nur wenige Tiere pro Objektträger abgebildet werden, bevor die Tiere an Hypoxie zu leiden beginnen.
   3. Legen Sie einen Deckglas (22 mm x 22 mm oder 18 mm x 18 mm) auf das Tröpfchen. Für den Bildtransport im DA9-Axon positionieren Sie das Axon in der Nähe des Deckglases. Drehen Sie dazu das Deckglas um 45°, nachdem Sie es auf das Agarpflaster gelegt haben, um die Tiere auf den Rücken zu rollen.
   4. Versiegeln Sie den Raum zwischen dem Deckglas und dem Objektträger mit einem viskosen Gel wie Vaseline. Dadurch wird verhindert, dass das Agarosepflaster austrocknet, was dazu führen kann, dass die Nematoden aus dem Bildgebungsfeld abdriften.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Tiere so schonend wie möglich zu behandeln. Zu hohe Konzentrationen von Levamisol oder physische Schäden am Wurm können den axonalen Transport beeinträchtigen. Leichtes Zucken des Schwanzes während der Bildgebung ist ein gutes Zeichen dafür, dass das Tier in einem gesunden Zustand bleibt. Die Tiere bleiben gesund und können sich nach der Bildgebung sogar von dem Agarose-Pflaster erholen.

3. Lebendzellmikroskopie

HINWEIS: Die genauen Werte der Erfassungsparameter können je nach Mikroskop unterschiedlich sein. Die Trends für jeden Erfassungsparameter sollten jedoch unabhängig vom verwendeten Mikroskop sein. In diesem Protokoll wurde ein konfokales Spinning-Disc-Mikroskop verwendet, das mit einer separaten Laserlinie für das Bleaching ausgestattet war (Details zum Mikroskop siehe Materialtabelle ). Die grüne Fluoreszenz wurde durch einen 488 nm Laser angeregt und die Emission durch einen ET525/36 Emissionsfilter gefiltert. Das Bleaching wurde mit einer 488 nm Laserlinie durchgeführt.

1. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Raumes oder, falls eine Temperaturregelung verfügbar ist, auf eine konstante Temperatur eingestellt ist. Bei Nematoden stellen Sie die Temperatur auf 20 °C ein.
2. Montieren Sie den Objektträger und verwenden Sie ein Objektiv mit 4x-20-facher Vergrößerung, um die Nematoden auf dem Objektträger zu lokalisieren und sich die Positionen zu merken. Wechseln Sie für die Bildaufnahme zu einem Objektiv mit 63-facher Vergrößerung.
3. Nehmen Sie ein einzelnes Bild auf, um die anfänglichen Erfassungsparameter zu überprüfen. Verfolgen Sie die Signalintensitäten im Sichtfeld mit dem Intensitätshistogramm der Erfassungssoftware. Die Intensitätswerte sollten das unterste Drittel des maximalen Signals abdecken, das die Kamera erfassen kann. Vermeiden Sie Pixelsättigung. Erhöhen Sie die Intensität des Anregungslasers, wenn die Signalintensität zu gering ist.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine zu hohen Anregungslaserintensitäten, da das fluoreszierende Protein im Zeitraffer gebleicht wird.
4. Ändern Sie hier den Erfassungsparameter und die Schritte, um die Fluoreszenzsignaldetektion zu optimieren.
   1. Durchführung eines Bleaching-Schritts: Bleichen Sie den Bereich des Axons, der mit einer 488-nm-Laserlinie (Leistung: 15 mW) für den Bleaching-Schritt analysiert werden soll. Streben Sie eine Bleicheffizienz von mindestens 90 % an. Bestimmen Sie die Bleicheffizienz, indem Sie die Signalintensität der Region vor und nach dem Bleichschritt vergleichen.
      HINWEIS: Beim Bleichen wird das Signal von sich bewegenden Partikeln verstärkt, indem es das Signal, das von stationären Partikeln ausgeht, sowie das Signal, das von der zytoplasmatischen Fraktion des Proteins im Hintergrund ausgeht, verringert. Membranöse Fracht, wie z. B. RAB-3 auf synaptischen Vesikelvorläufern, haben eine niedrige zytoplasmatische Fraktion, so dass der Bleichschritt das Signal des Transportpakets gegenüber dem zytoplasmatischen Hintergrund nur geringfügig verbessert (Abbildung 2A,D). Das Bleichen verbessert jedoch die Verfolgung einzelner Transportereignisse über längere Strecken und ermöglicht die Quantifizierung von Pausenzeiten (Abbildung 2A).
   2. Binning: Verwenden Sie 2 x 2 Binning, um die Signalintensität einzelner Transportereignisse zu erhöhen. Beim Binning werden Pixelarrays zu einem größeren Pixel kombiniert. Dies verringert die räumliche Auflösung, erhöht aber die Signalintensität einzelner Transportereignisse und ist besonders hilfreich für schwache Teilchen (Abbildung 2B,D).
   3. Belichtungszeit: Erhöhen Sie die Belichtungszeit, um die Signalintensität zu erhöhen. Die Erhöhung der Belichtungszeit erhöht die Signalintensität der Probe auf Kosten einer geringeren zeitlichen Auflösung für die Transportereignisse. Verwenden Sie für das Experiment hier eine zeitliche Auflösung von 300 ms bis 700 ms zwischen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (100-500 ms Belichtungszeit), um einzelne Transportereignisse von RAB-3 zu verfolgen. (Abbildung 2C,D)
5. Zeitrafferaufnahme: Machen Sie einen Zeitraffer von mindestens 1-3 Minuten, abhängig von der Signalintensität des Proteins sowie der Häufigkeit einzelner Transportereignisse. Sobald ein Zeitraffer aufgenommen wurde, gehen Sie zum nächsten Tier. Tiere auf einem Objektträger sollten nicht länger als 30 Minuten abgebildet werden, um sicherzustellen, dass sich die aufgenommenen Tiere in einem gesunden Zustand befinden.
   HINWEIS: Leichte Zuckungen des Schwanzes der Tiere während der Aufnahme sind ein Indikator dafür, dass das Tier noch am Leben ist.

4. Analyse der axonalen Transportdaten

HINWEIS: Verwenden Sie ImageJ/Fiji¹⁹ für die nachfolgenden Bildanalyseschritte. Fiji ist in der Lage, Daten mit allen gängigen Mikroskopie-Softwarepaketen zu lesen.

1. Generierung von Kymographen
   1. Daten importieren: Importieren Sie die Zeitraffer-Datendatei nach Fidschi. Falls die Daten nicht nach Fidschi importiert werden können, exportieren Sie die Zeiterfassung als TIFF-Datei aus dem Softwarepaket und laden Sie sie anschließend nach Fidschi.
   2. Driftkorrektur: Prüfen Sie, ob sich das Tier-/Axonsegment während der Bildaufnahme bewegt oder leicht verschoben hat. Korrigieren Sie die Bewegung oder das Treiben von Tieren, indem Sie das Plugin StackReg²⁰ ausführen. Wählen Sie beim Ausführen des Plug-ins die Transformation "Steifer Körper " aus.
   3. Manuelle Generierung eines Kymographen: Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung ist in Abbildung 3 dargestellt. Verwenden Sie den driftkorrigierten Film, um den Kymographen zu generieren. Verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie und passen Sie die Linienbreite an den Axondurchmesser an, indem Sie mit der linken Maustaste auf das Symbol für die segmentierte Linie doppelklicken, um eine Linie entlang des Axonsegments zu zeichnen, das analysiert werden soll. Führen Sie das ImageJ/Fiji-Plugin Kymoreslicewide aus, um den Kymographen zu generieren und den maximalen Intensitätswert über die Breite der Linie in den Parametereinstellungen zu verwenden.
      HINWEIS: Die Konsistenz der Strichrichtung (z. B. immer proximal zum distalen Axon oder umgekehrt) vereinfacht die Rückverfolgung der Bewegungsrichtung in den Kymographen.
2. Analyse der Transportparameter
   1. Berechnen Sie die Transportparameter: Ereignisnummer, Geschwindigkeit, Lauflänge und Pausendauer aus dem Kymographen, indem Sie die folgenden Schritte befolgen.
      1. Verfolgen von Transportereignissen im Kymographen: Verwenden Sie das Werkzeug "Geradlinige Linie", um einzelne Transportereignisse auf dem Kymographen zu verfolgen. Speichern Sie jede Zeile im ROI-Manager und verfolgen Sie alle Transportereignisse im Kymographen. Wählen Sie die folgenden Messparameter in ImageJ/Fiji: Fläche, Begrenzungsrechteck, Mittlerer Grauwert, Feret-Durchmesser.
      2. Transportparameter berechnen: Fügen Sie die Ergebnistabelle in eine Tabelle ein und verwenden Sie die folgenden Spalten der Ergebnisabschnitte für die Berechnung:
         Lauflänge: Multiplizieren Sie die Breite (in Pixel) mit der Auflösung der Kamera (z.B. x μm/pxl), um die Lauflänge in μm zu bestimmen.
         Geschwindigkeit: Lauflänge/Laufdauer. Um die Dauer eines Bewegungsereignisses in Sekunden zu bestimmen, multiplizieren Sie die Höhe (in Pixel) mit der Erfassungszeit zwischen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (z. B. x s/Pixel).
         Pausenzeit: Laufdauer zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bewegungen, bei denen die Geschwindigkeit 0 ist.
         Ereignisnummer: Die Gesamtzahl der Ereignisse kann auf die Gesamtlänge des Kymographen normalisiert werden, um die Ereigniszahl pro Minute und das Axonlängensegment zu bestimmen. Die Ereignisse können weiterhin in anterograde und retrograde Transportereignisse eingeteilt werden. Um die Richtungsabhängigkeit der einzelnen Bewegungsereignisse zu bestimmen, verwenden Sie das Werkzeug Feret-Winkel. In Kymographen, die ursprünglich durch Zeichnen der segmentierten Linie von proximal nach distal erzeugt wurden und bei denen die anterograden Transportereignisse im Kymographen von rechts nach links zeigen, zeigt ein Feret-Winkel < 90° ein anterogrades und >90° ein retrogrades Ereignis an, andernfalls ist es umgekehrt.

Results

Überblick über das Modellsystem und das Messverfahren
Um den axonalen Transport von synaptischen Vesikelvorläufern sichtbar zu machen, verfolgten wir endogen GFP-markiertes RAB-3. Hier verwenden wir einen kürzlich generierten GFP::Flip-on::RAB-3 Stamm⁶, in dem die Expression der Rekombinase Flippase unter einem zellspezifischen Promotor (glr-4p) endogenes RAB-3 im Motoneuron DA9 markiert. DA9 ist ein bipolares Motoneuron, dessen Zellkörper sich im hinteren Teil des Tieres auf der ventralen Seite in der Nähe des Anus befindet (Abbildung 1A). Es enthält einen kurzen Dendriten, der anterior entlang des ventralen Nervenstrangs verläuft, und ein langes Axon, das nach posterior verläuft, eine Kommissur bildet und dann anterior entlang des dorsalen Nervenstrangs verläuft, wo es en passant Synapsen bildet, die den dorsalen Muskel und das VD-Neuron^innervieren 22,23,24. Wir visualisieren den axonalen Transport in der asynaptischen Region; Die meisten Transportereignisse können mit einer einzigen Fokusebene erfasst werden (Abbildung 1A). Ein erster Photobleichschritt wird durchgeführt, um den Hintergrund der stationären Vesikel in diesem Bereich zu reduzieren, die oft dazu neigen, in diesem Bereich zu pausieren (Abbildung 1B). Zeitraffervideos werden über 3 Minuten aufgezeichnet und das RAB-3-Signal entlang der asynaptischen Region wird in einen Kymographen eingetragen, um einzelne Transportereignisse zu extrahieren (Abbildung 1C).

Anpassung des Erfassungsparameters zur Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports
Um die geringe Signalintensität vieler endogen fluoreszierender markierter Proteine zu überwinden, müssen die Erfassungsparameter des Mikroskops optimiert werden. Für eine robuste Quantifizierung von Transportereignissen muss die Signalintensität einzelner Transportereignisse über dem zytoplasmatischen Hintergrund oder der pausierenden, stationären Fracht so hell wie möglich sein. Synaptische Vesikelvorläufer pausieren oft in der asynaptischen Region in unterschiedlichen Vesikelpools, was die Detektion neuer ankommender Vesikel stört und es schwierig macht, ihre Transportspuren zu verfolgen⁷.

Ein einziger anfänglicher Fluoreszenzbleichschritt kann das Fluoreszenzsignal, das von den Vesikelpools ausgeht, stark reduzieren, um die Bewegungserkennung neuer eingehender Vesikel zu verbessern (Abbildung 2A). Der Bleichschritt verstärkte das Signal der Bewegung von RAB-3-Vesikeln über die zytoplasmatische Hintergrundintensität nur geringfügig, wahrscheinlich weil der zytoplasmatische Anteil von RAB-3 sehr gering ist (Abbildung 2D).

Die Verwendung von Binning bietet eine zusätzliche Schicht, um das Signal über den Hintergrund einzelner Transportereignisse zu verbessern, indem ein Array von Pixeln zu einem einzigen Pixel kombiniert wird. Ein 2 x 2 Binning halbiert die räumliche Auflösung (hier von 108,33 nm/Pixel auf 216,7 nm/Pixel), was immer noch ausreicht, um einzelne RAB-3-Transportpartikel zu verfolgen (Abbildung 2B), aber die Signalintensität einzelner Vesikel stark verbessert (Abbildung 2D). Sofern keine sehr hohe räumliche Auflösung erforderlich ist, kann Binning auch zur Visualisierung vieler anderer axonaler Frachten angewendet werden.

Als nächstes fragten wir, wie Änderungen in der Expositionszeit die Signalintensität einzelner Transportereignisse verbessern können. Wir haben insbesondere die Expositionszeit in die Analyse einbezogen, um auch zu zeigen, dass eine Expositionszeit von bis zu 500 ms mit 700 ms zwischen den nachfolgenden Bildgebungszeitpunkten immer noch eine zeitliche Auflösung bietet, bei der synaptische Vesikelvorläufer verfolgt werden können (Abbildung 2C,D).

Generierung und Analyse von Kymographen mit Fidschi
Um einen Kymographen zu generieren und einzelne Transportereignisse zu analysieren, führen Sie die Schritte in Abbildung 3 aus.

Abbildung 1: Überblick über das Modellsystem zur Visualisierung des axonalen Transports von endogen fluoreszierendem RAB-3. (A) Oberes Bild: Überblick über den Fadenwurm mit angedeuteter posterior-anteriorer und ventral-dorsaler Achse. Das Motoneuron DA9 ist blau markiert. Mittleres Fenster: Vergrößern Sie den im oberen Bereich gezeigten Boxed-Bereich mit angezeigter DA9-Kompartimentierung. En passant Synapsen sind grün dargestellt, * zeigt den Anus an. Beachten Sie, dass sich das Axon im dorsalen Nervenstrang fortsetzt, bis es die Vulva passiert. Das rote Feld zeigt den Bereich der aynaptischen Zone an. Unteres Bild: Konfokale Mikroskopieaufnahme von endogenem GFP, markiert RAB-3 im proximalen Axon in einer einzigen Fokusebene. Beachten Sie, dass es Vesikelsenken mit länger pausierendem RAB-3 im asymmetrischen Bereich gibt, obwohl die meisten RAB-3-Signalcluster im synaptischen Bereich vorhanden sind. Die asynaptische Region ist rot umrandet. Maßstab: 20 μm. (B) Repräsentative Bilder einer Zeitrafferaufnahme zur Visualisierung des axonalen Transports. Um die Rückverfolgbarkeit einzelner Transportteilchen über stationäre Partikel zu verbessern, wird der asymmetrische Bereich zunächst photogebleicht. Die unteren Felder im violetten Bereich zeigen ein Beispiel für ein anterogrades (orangefarbene Pfeilspitze) und ein retrogrades (blaue Pfeilspitze) Bewegungsereignis. Die Felder von oben nach unten stellen aufeinanderfolgende Zeitpunkte dar. (C) Die Zeitrafferaufnahme in (B) wurde als Kymograph aufgezeichnet (2D-Darstellung der Zeit über der Position). Diagonale Linien stellen Bewegungsereignisse dar, bei denen die Steigung die Geschwindigkeit angibt. Vertikale Linien zeigen stationäre Ereignisse. Das violette Feld ist ein Vergrößern des Kymographen, um die Transportereignisse hervorzuheben, die auch in (B) dargestellt sind, und die anterograden (orange) und retrograden (blau) Transportereignisse werden verfolgt. Gestrichelte vertikale Linien zeigen die pausierenden Ereignisse an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Optimierung von Erfassungsschritten und -parametern zur Verbesserung der Visualisierung der endogenen axonalen Fracht. Endogene GFP::RAB-3 wurden in der aynaptischen Zone des DA9-Axons sichtbar gemacht, indem Bilder einer einzelnen Fokusebene auf einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop aufgenommen wurden. Es wurden Kymographen erworben, um einzelne Transportereignisse in anterograder (von rechts nach links) und retrograder (von links nach rechts) Richtung (A-C) sichtbar zu machen. (A) Kymographen zeigen RAB3-Transportereignisse ohne (linke Kymographen) oder mit integriertem Bleichschritt. Beachten Sie, dass der Bleichschritt die Visualisierung von Pausierungsereignissen (gekennzeichnet durch gelbe Pfeilspitzen) zwischen aufeinanderfolgenden Transportereignissen (orangefarbene Pfeilspitzen) verbessert. (B) Die Implementierung von 2 x 2 Binning trägt dazu bei, die Signalintensität von schwachen RAB3-Transportereignissen zu verbessern. Die Bilder wurden bei einer Belichtungszeit von 300 ms aufgenommen und tragen mit (C) einer schrittweisen Erhöhung der Belichtungszeit (von 100 ms ganz links auf 500 ms ganz rechts) dazu bei, die Signalintensität einzelner Transportereignisse zu verbessern. Die Bilder wurden mit 2 x 2 Binning und unter Verwendung eines ersten Photobleaching-Schritts aufgenommen. Alle Kymographen zeigen eine Gesamtdauer von 3 min an und sind im gleichen Maßstab gezeichnet, so dass Kymographen mit weniger Erfassungszeitpunkten aufgrund eines längeren Zeitraffers zwischen aufeinanderfolgenden Bildpunkten eine kürzere Gesamtlänge des Kymographen aufweisen. (D) Quantifizierung der Signalintensität pro Transportereignis nach Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz von Kymographen in (A-C). Beachten Sie, dass das Binning und der Photobleichschritt bei einer Belichtungszeit von 300 ms aufgenommen wurden. Statistischer Vergleich mit n Ereignissen für 100 ms (n_Ereignisse = 27 in n_Tieren = 2), 200 ms (n_Ereignisse = 30 in n_Tieren = 2), 300 ms (n_Ereignisse = 88 in n_Tieren = 6), 500 ms (n_Ereignisse = 12 in n_Tieren = 1), 300 ms ohne (w.o.) Binning (n_Ereignisse = 31 in n_Tieren = 3), 300 ms mit (w) Binning (n_Ereignisse = 88 in n_Tieren = 6) und 300 ms, 2 x 2 Binning mit Bleiche (n_Ereignisse = 88 bei n_Tieren = 6) und ohne Bleichen. Jeder Datenpunkt repräsentiert die Signalintensität eines einzelnen RAB-3-Transportereignisses nach der Subtraktion des Hintergrunds (Zytoplasma des Axons) zu einem einzigen Zeitpunkt entlang seiner Spur, der zufällig ausgewählt wurde. Die Belichtungszeit wurde mit einem Kruskal-Wallis-Test verglichen, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleich, Binning und Photobleaching wurden mit einem paarweisen Mann-Whitney-Test verglichen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise zur Erstellung eines Kymographen und zur Messung einzelner Transportereignisse . (A) Nach dem Laden der Videoaufzeichnung nach Fidschi wird das segmentierte Linienwerkzeug verwendet, um eine Linie entlang der Länge des zu analysierenden axonalen Segments zu verfolgen. (B) Ein Kymograph (rechtes Fenster) wird mit dem Kymoreslicewide-Plugin mit den im linken Feld dargestellten Parametern generiert. (C) Einzelne Transportereignisse werden mit dem Linearlinienwerkzeug nachverfolgt und im ROI-Manager gespeichert. Im rechten Bereich werden die Messeinstellungen angezeigt, die zum Generieren der Ergebnistabelle verwendet werden. (D) Die Ergebnisse in der Tabelle werden zur Berechnung der Transportparameter verwendet. Kästchen zeigen wichtige Parameter an, die im Abschnitt "Methoden" des Protokolls beschrieben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Grenzen der Methode und alternative Methoden
In diesem Protokoll haben wir die Akquisitionsparameter optimiert, um den axonalen Transport von endogen markiertem RAB-3 zu visualisieren, das mit synaptischen Vesikelvorläufern assoziiert ist. Um RAB-3 sichtbar zu machen, haben wir einen kürzlich veröffentlichten FLIP-on::GFP::RAB-3 Stamm⁶ verwendet und die Rekombinase Flippase unter einem zellspezifischen Promotor (glr-4p)²⁵ exprimiert. Diese Strategie ermöglicht es uns, RAB-3 mit einem einzigen GFP-Fluorophor zu markieren. RAB-3 ist relativ einfach zu visualisieren, da es stark exprimiert und an synaptischen Vesikelvorläufern stark angereichert ist, so dass einzelne Transportereignisse eine helle Signalintensität gegenüber einem niedrigen Signal aufweisen, das aus dem zytoplasmatischen Hintergrund stammt. Andere axonale Proteine könnten zusätzliche Optimierungsstrategien außerhalb der Mikroskopie-Einstellungen erfordern, um die Visualisierung von Transportereignissen zu ermöglichen. Insbesondere für niedrig exprimierte Proteine bietet das Split-GFP-System eine gute Alternative. In diesem System wird GFP₁₁ in den endogenen Locus des interessierenden Proteins eingefügt und GFP_1-10 wird von einem zellspezifischen Promotor exprimiert. Ein großer Vorteil dieses Systems ist die geringe Größe des DNA-Reparatur-Templates (ca. 70 Nukleotide), das genomisch eingefügt werden muss, was die homologe Rekombination im Vergleich zum Insertionieren des ORF des gesamten Fluoreszenz-Tags^26,27 effizienter macht. Aufgrund seiner geringen Größe können mehrere GFP_11-Fragmente an das endogene Protein eingefügt werden, wodurch die Anzahl der rekonstituierten GFP-Fluorophore pro Protein amplifiziert und somit das Fluoreszenzsignal des endogenen Proteins und damit des Transportpakets²⁸ verstärkt wird.

Neben der Markierung des Proteins mit einem Split-GFP- oder GFP-Ansatz können auch andere genetisch kodierte Fluorophore verwendet werden, die einzigartige Vor- und Nachteile hinsichtlich ihrer photochemischen Eigenschaften aufweisen, die kürzlich verglichen wurden²⁹. Darüber hinaus können chemische Fluorophore mit photostabileren Eigenschaften verwendet werden, indem das interessierende Protein endogen mit einem HALO- oder SNAP-Tag³⁰ markiert wird.

Insbesondere für zytoplasmatische Proteine, die im gesamten Axon reichlich vorhanden sind, könnte ein bedingter Markierungsansatz erforderlich sein. Wir haben kürzlich eine solche Fracht, endogenes Spectrin, durch Fluoreszenzmikroskopie mit zeitlich kontrollierter Markierung sichtbar gemacht, um nur neuartige synthetisierte Spektrenproteine sichtbar zu machen. Für die bedingte Markierung mit Einzelneuronenauflösung kombinierten wir die hitzeschockgetriebene Expression einer Rekombinase mit einem Split-GFP-System³¹.

Wenn das Forschungsziel darauf abzielt, den Transport von Organellen zu verstehen, kann die Expression einer Proteindomäne, die mit der Organelle assoziiert ist, eine Alternative zur ektopischen Expression des Proteins in voller Länge darstellen.

Kritische Schritte im Protokoll
Eine sorgfältige Vorbereitung zur Optimierung der Visualisierung des Proteins auf der Grundlage der erwarteten Expressionsniveaus sowie zur Auswahl der optimalen Markierungsstrategie sind besonders entscheidend für die erfolgreiche Visualisierung endogener markierter Proteine. Die Expressionsniveaus für die meisten Proteine in vielen Neuronen können auf der Grundlage des transkriptomischen Datensatzes von Cengen¹³ abgeschätzt werden. Die erwartete geringe Signalintensität von Transportereignissen für niedrig exprimierte oder zytoplasmatische Proteine kann durch das Anhängen mehrerer Kopien des Fluorophors verbessert werden. Es ist jedoch zu beachten, dass bei jedem Markierungsexperiment darauf geachtet werden muss, dass die Funktion des markierten Proteins nicht gestört wird. Falls es einen bekannten Phänotyp für die entsprechende Mutante gibt, ist es wichtig zu überprüfen, dass die Markierung diesen Phänotyp nicht erzeugt. In Fällen, in denen kein Phänotyp bekannt ist, sind alternative Ansätze erforderlich, die von Fall zu Fall variieren würden.

Ein kritischer Schritt bei der Bildgebung axonaler Transportereignisse ist der Gesundheitszustand des Tieres. Die Tiere sollten sowohl bei der Bildvorbereitung als auch bei der Bildgebung so schonend wie möglich behandelt werden (z. B. Verwendung eines Haarstochers anstelle eines Metalldrahtes zum Transfer gelähmter Tiere, Minimierung der Inkubationszeit im Lähmungsmittel, Minimierung der Bildgebungszeit, um Phototoxizität zu vermeiden).

Modifikationen und Fehlerbehebung
Während wir beabsichtigen, die axonale Transportvisualisierung endogener Proteine zu optimieren, sind die Optimierungsstrategien für Akquisitionsparameter auch auf ektopisch exprimierte Proteine anwendbar. Insbesondere wenn die endogenen Expressionsniveaus zu gering sind, um Transportereignisse sichtbar zu machen, kann die ektopische Expression des Proteins eine Alternative darstellen.

Falls trotz einer starken Signalintensität des endogenen markierten Proteins keine Transportereignisse aufgezeichnet werden können, befinden sich die Tiere möglicherweise in einem ungesunden Zustand. Dies kann gelöst werden, indem die Tiere unter schonenderen Präparationsverfahren für die Mikroskopie vorbereitet werden (z. B. Verkürzung der Inkubationszeit im Lähmungsmittel). Alternativ können Transportereignisse selten sein, und eine 3-minütige Videoaufzeichnung reicht möglicherweise nicht aus, um Ereignisse zu erfassen. Die Erfassung seltener Transportereignisse kann optimiert werden, indem die Dauer der Videoaufzeichnung verlängert wird, indem die Anzahl der abgebildeten Tiere erhöht wird oder indem die Tiere in einem anderen Entwicklungsstadium abgebildet werden, in dem Transportereignisse häufiger auftreten könnten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Deckgläser (22 mm x 22 mm, Nr. 1); Gold Seal Cover Glas	Thomas Scientific	6672A14
Levamisol	ChemCruz	sc-205730
Mikroskop: Nikon Ti2 inverses Mikroskop, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS Kamera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA Öl-Immersionsobjektiv, Nikon Photostimulationsscanner bei 488nm mit ET525/36 Emissionsfilter	Nikon		Spinning Disc Konfokales Mikroskop
NIS-elements AR	Nikon		Software für die Nikon Ti2
Thermo	Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Wird bei CGC (https://cgc.umn.edu/) hinterlegt