Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Müller-Zellen (MCs) sind die wichtigsten und am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Netzhautgewebe. Sie sind die Hauptakteure bei der Gewährleistung der strukturellen Integrität und der Stoffwechselfunktionen in der Netzhaut¹. Die strategische Struktur der MCs erstreckt sich über die gesamte Netzhautdicke und bietet so Unterstützung für die Netzhaut. Zusätzlich zu ihren gerüstartigen Eigenschaften haben sie metabolische Funktionen für retinale Neuronen und versorgen sie mit Energiesubstraten, darunter Glukose und Laktat. Diese Funktionen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung einer gesunden neuronalen Funktion. Es wurde berichtet, dass beeinträchtigte MCs zu verschiedenen Netzhauterkrankungen beitragen, darunter altersbedingte Makuladegeneration, diabetische Retinopathie und Glaukom ^2,3. MCs können endogene zelluläre Quellen für die regenerative Therapie in der Netzhaut sein¹. Sie machen auch einen bedeutenden Teil der Netzhaut aus, und es gibt starke Hinweise darauf, dass diese Zellen bei mehreren Spezies stimuliert werden können, um fehlende Neuronen zu ersetzen². Sie arbeiten vorteilhaft mit Neuronen zusammen, und die konisch verzweigten Endfüße der Müller-Zellen schließen die Blutgefäße dicht aus und verbinden die neuronalen Komponenten der Netzhaut. Um die neuronale Entwicklung und die neuronale Plastizität aufrechtzuerhalten, fungieren Müller-Zellen als weiches Substrat für Neuronen und schützen sie vor mechanischen Traumata³. Darüber hinaus können sich Müller-Zellen unter pathologischen Umständen in neurale Vorläuferzellen oder Stammzellen differenzieren, die die verlorenen Photorezeptoren und Neuronen replizieren oder regenerieren ^2,3,4. Müller-Zellen behalten die Eigenschaften retinaler Stammzellen bei, einschließlich unterschiedlicher Potenziale zur Selbsterneuerung und Differenzierung ^5,6. Die Müller-Gliazelle hat eine bedeutende retinale Abstammung, die neurotrophe Faktoren produziert, Neurotransmitter aufnimmt und recycelt, Ionen räumlich puffert und die Blut-Netzhaut-Schranke aufrechterhält, um die Netzhaut in Homöostase zu halten ^7,8,9. Dies unterstreicht das Potenzial von Müller-Zellen als vielversprechendes Werkzeug in zellbasierten Therapien zur Behandlung von Krankheiten, die mit Netzhautdegeneration in Verbindung stehen. Müller-Zellen sind die primären Gliazellen, die über die Netzhaut verteilt sind und sowohl mit Neuronen als auch mit Blutgefäßen verbunden sind. Sie spielen eine entscheidende schützende Rolle und bieten eine wesentliche strukturelle und metabolische Unterstützung, um die Lebensfähigkeit und Stabilität der Netzhautzellen zu erhalten. Leider gibt es in der Literatur nur sehr wenige Protokolle für die primäre Müller-Zell-Isolierung aus der Netzhaut^10,11.

Wir stellen einen verbesserten Ansatz zur zuverlässigen Isolierung und Kultivierung von primären Müller-Zellen der Maus vor. Dieses Protokoll wurde in unserer Gruppe verwendet, um Müller-Zellen aus den Wildtyp-Mäusen C57BL/6 und transgenen Mäusen^12,13 zu isolieren. Für dieses Protokoll werden Mäuse im Alter zwischen 5 und 11 Tagen ohne Geschlechtspräferenz verwendet. Die Zellen wurden bis zu 4 Mal durchquert; Bei P4 halten sie sich jedoch nicht mehr an den Kolben, und es wird schwierig, eine gesunde Kultur aufzubauen. Die Kultur ist oft mit retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) kontaminiert, daher sollten die Zellen mindestens einmal durchgelassen werden, bevor weitere Experimente an der Zelllinie durchgeführt werden. Die Passage ermöglicht eine weitere Isolierung von Verunreinigungen. Daher bietet das vorgestellte Protokoll eine schnelle und effektive Möglichkeit, Müller-Zellen der Maus zu isolieren, die dann als zuverlässige Plattform zur Erforschung therapeutischer Ziele und zur Bewertung potenzieller Behandlungen für Netzhauterkrankungen verwendet werden können¹⁴.

Alle Tierversuche entsprachen der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung und wurden nach unserem Tierprotokoll durchgeführt, das vom Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) und den Richtlinien der Universität Oakland (Protokollnummer 2022-1160) genehmigt wurde

1. Vorbereitung von Medien und Lösungen

1. Bereiten Sie die Müllerzell-Augenlösung her, indem Sie das Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Details in der Materialtabelle) mit Penicillin/Streptomycin in einer Verdünnung von 1:1000 ergänzen. Fügen Sie beispielsweise für 10 ml DMEM 10 μl Penicillin/Streptomycin hinzu.
   HINWEIS: Dies ist ein einfaches, serumfreies Medium, das vorbereitet wurde. Erwärmen Sie außerdem das gesamte Medium in einem 37 °C heißen Wasserbad, bevor Sie es für Zellkulturen verwenden.
2. Bereiten Sie das komplette primäre Müller-Zellwachstumsmedium vor, indem Sie DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, hitzeinaktiviert) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen. Zum Beispiel (500 ml DMEM-Medien + 50 ml FBS + 5 ml Penicillin/Streptomycin).
3. Bereiten Sie eine 0,05%ige Trypsin-EDTA-Lösung mit Kollagenase IV in einer Konzentration von 200 U/ml vor (Trypsin-EDTA wird verwendet, um die berechnete Menge an Kollagenase-IV-Pulver aufzulösen, um die erforderliche Konzentration zu erreichen).

2. Enukleation

1. Ethische Einschläferung der Maus durch Inhalation von CO₂ gemäß den IACUC-Richtlinien.
   1. Setzen Sie das/die Tier(e) kurz in die CO₂ -Kammer, um 100 % CO₂ bei einer Füllrate von 30-70 % der Kammer Vol/min mit CO₂ einzuführen, um das Ziel einer schnellen Bewusstlosigkeit innerhalb von 2-3 Minuten mit minimalem Stress für die Mäuse zu erreichen.
   2. Da sich Mäuse in einem jungen Alter (~10 Tage) befinden, führen Sie als sekundäre Methode eine Gebärmutterhalsluxation durch, um eine angemessene Euthanasie zu gewährleisten.
2. Nachdem Sie den Arbeitsbereich mit 70%igem Ethanol sterilisiert haben, legen Sie die Maus auf ein steriles Unterpolster.
3. Extrahieren Sie die Augen, indem Sie die Arme der Pinzette auf den hinteren Teil des Auges legen, sanft aus dem Orbitabereich ziehen und die Augen enukleieren, indem Sie mit einer 5/45-Pinzette Druck auf den Orbitalbereich ausüben, um eine Proposis zu verursachen.
   HINWEIS: Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge vor der Dissektion mit 70% Ethanol, gefolgt von Phosphatpuffer-Kochsalzlösung.
4. Stellen Sie sicher, dass der Sehnerv noch mit dem Auge verbunden ist, indem Sie das Auge langsam enukleieren. Achte darauf, den Sehnerv (visuell als weißer Strang erkennbar) hinter das Auge zu ziehen.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss nicht unter einem Mikroskop durchgeführt werden, sondern kann auf einer sterilisierten Bank durchgeführt werden.

3. Behandlung der enukleierten Augen

1. Decken Sie ein 15 mL Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ab und füllen Sie das Röhrchen mit 10 mL der Müller Cell Eye Lösung.
2. Legen Sie die präparierten Augen in das 15-ml-Röhrchen mit der Müller-Zell-Augenlösung und lassen Sie sie über Nacht oder etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur ruhen.
3. Nach 18 h die Augenlösung umfüllen und die Augen kurz mit 2-3 mL erwärmter (37 °C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ausspülen.
4. Dekantieren Sie das PBS und bringen Sie die Augen in eine 100 mm Petrischale mit 10 ml Trypsinlösung. (vorbereitet in Schritt 1.3).
   HINWEIS: Trypsin wird auf das gesamte enukleierte Auge aufgetragen und wirkt als dissoziatives Mittel, um die Zelltrennung von den Netzhautschichten während der Dissektion zu erleichtern. Die präparierte Netzhaut enthält viele Zellen, darunter auch RPE-Zellen, die klebrig sind und am ehesten die Müller-Zellkultur^{kontaminieren können 14}. Die mikroskopische Untersuchung zeigte eindeutig, dass sich nach 5 Tagen Isolation (während des ersten Medienwechsels) RPE-Zellen von der Platte lösten und¹³ Jahre starben. Das für die RPE-Isolierung verwendete Medium ist DMEM/F-12 mit einer anderen Zusammensetzung als DMEM (wird bei der Isolierung von Müller-Zellen verwendet und enthält Natriumpyruvat und niedrige Glukose.
5. Stellen Sie das Gericht in einen Inkubator und inkubieren Sie es 1,5 bis 2 h bei 37 °C und 5 % CO₂.
6. Nach der Inkubation werden die Augen in eine 60-mm-Petrischale mit etwa 5 ml vollständigem primärem Müller-Zell-Wachstumsmedium gegeben.

4. Präparieren

HINWEIS: Dieses Verfahren muss in der sterilen Umgebung der Kulturhaube durchgeführt werden. Daher ist es unerlässlich, die Oberflächen der Haube zusammen mit allen Werkzeugen und dem Seziermikroskop gründlich mit 70%igem Alkohol zu sterilisieren. Es ist erwähnenswert, dass das Video außerhalb der Motorhaube aufgenommen wurde, um eine bessere Sichtbarkeit und klarere Demonstrationszwecke zu gewährleisten.

1. Legen Sie ein kleines Stück sterilisiertes Gewebe in Laborqualität in die Schale, um die Augen während der Dissektion zu stabilisieren. Lege die Augen unter ein Präpariermikroskop, um die Dissektion zu starten.
   HINWEIS: Die Verwendung von Gewebe in Laborqualität erleichtert das Manövrieren der Augen in einer mit Flüssigkeit gefüllten Schale (vollständiges Medium) und gewährleistet eine präzise Dissektion.
2. Verwenden Sie eine Vannas-Schere und eine Pinzette im M5S-Stil, um das Bindegewebe, die extraokulären Muskeln und den Sehnerv zu entfernen.
   1. Fassen Sie das Auge mit einer Pinzette im M5S-Stil und machen Sie mit einer Vannas-Schere oder einer Spritzennadel einen Schnitt in den Ora-Serrata-Bereich.
      HINWEIS: Zwischen dem vorderen und hinteren Teil des Auges befindet sich eine hellblaue kreisförmige Linie, die als Ora serrata bezeichnet wird und als Orientierungspunkt für eine genaue Richtung während der Dissektion verwendet werden kann.
   2. Fassen Sie den Schnitt mit einer Pinzette im M5S-Stil und ziehen oder reißen Sie die Hornhaut aus dem hinteren Teil des Auges. Ziehen Sie in kleinen Schritten, um sicherzustellen, dass die Integrität der Netzhaut intakt bleibt.
      HINWEIS: Bei diesen Schritten wird der vordere Teil des Auges (Hornhaut, Iris und Linse) vom hinteren Teil der Augenmuschel (neurale und pigmentierte Netzhaut) entfernt.
   3. Um die Integrität der Netzhautschichten zu erhalten, ziehen Sie vorsichtig und entfernen Sie das pigmentierte Epithel der Netzhaut aus der Neuralnetzhaut. Die neuronale Netzhaut sollte frei von schwarzen Flecken sein, um die Reinheit der Isolierung so weit wie möglich zu gewährleisten, da die RPE-Schicht in der Regel klebrig und mit der neuronalen Netzhaut verbunden ist.
   4. Schneiden Sie die präparierte neurale Netzhaut in kleine Stücke, bevor Sie sie in einer Platte sammeln, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Platte zu gewährleisten.
3. Die neurale Netzhaut wird in einen T25-Kolben mit 4 ml vollständigem primärem Müllerzell-Wachstumsmedium eingefüllt.
4. Zum Schluss wird der Kolben in einen Brutschrank gestellt und bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.

5. Kultivierung von primären Müller-Gliazellen

1. Bewegen Sie den Kolben 3-5 Tage lang nicht, um das Zellwachstum zu fördern.
2. Wechseln Sie das Medium nach dem fünften Tag und danach jeden zweiten Tag, bis die Zellen zu 90 % konfluiert sind.

6. Passage von primären Müller-Gliazellen

1. Aspirieren Sie das Müller-Zellkulturmedium, gefolgt von 2 mL Wash in PBS, und aspirieren Sie das PBS heraus. Fügen Sie 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA (1x) hinzu oder genug, um die Platte zu bedecken.
2. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen unter dem Mikroskop von der Platte lösen. Entnehmen Sie dann die Zellsuspension und geben Sie 4 ml vorgewärmtes (37 °C) vollständiges primäres Müller-Zellwachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.2) in das Entnahmeröhrchen.
4. 7 min bei 300 x g zentrifugieren. Nach dem Aspirieren des Überstands resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL vollständigem primären Müller-Zell-Wachstumsmedium. Da die Zellzahl je nach Anzahl der präparierten Augen variieren kann, ist es besser, die Zellen vor der Aussaat und Inkubation zu zählen. Die empfohlene Aussaatdichte beträgt 3,0 x 10⁶ Zellen in einem T75-Kolben.
   HINWEIS: Die Zellen können bis zu 4-5 Mal durchlaufen werden. Die konsistentesten Versuchsergebnisse finden sich jedoch nach 1-2 Passagen.

7. Immunfluoreszenz

HINWEIS: Verwenden Sie das Immunfluoreszenzprotokoll, um die Müller-Zellspezifität zu färben und zu validieren. Hier finden Sie einen kurzen Überblick über das Immunfluoreszenzprotokoll. Dieser Schritt wird nach der ersten Passage¹² ausgeführt.

1. Aussäen Sie die Zellen in einen Zellkulturkammer-Objektträger (30.000 Zellen pro Well für einen 8-Well-Kammer-Objektträger).
2. Die isolierten Zellen werden 24-48 h lang in einem vollständigen Müller-Zellkulturmedium (hergestellt in Schritt 1.2) bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
3. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie den Kammerobjektträger mit 250-300 μl 1x PBS auf jeder Vertiefung, wenn die Zellen zu 80-90 % konfluent sind.
4. Befestigen Sie den Objektträger 10 bis 15 Minuten lang in 250-300 μl 4%igem Paraformaldehyd auf jeder Vertiefung, anschließend mit PBS/TX-100 (jeweils 5 Minuten/3x) waschen.
5. Blockierenden Puffer für 1 h bei 37 °C zugeben (siehe Materialtabelle).
6. Aspirieren Sie die Blockierungslösung und fügen Sie dann die für Müller-Zellen spezifischen Primärantikörper hinzu, um die Reinheit der isolierten Zellen unter Verwendung von Glutaminsynthetase und Vimentin ^5,12 zu bestätigen. 3 h bei 37 °C inkubieren (mit einer Antikörperkonzentration von 1:100-1:200 in Blockierungspuffer in einem Volumen von 150-200 μl/Objektträger). Waschen Sie den Objektträger mit PBS/TX-100-Wäschen (jeweils 5 und 10 Minuten).
   HINWEIS: Diese Antikörper wurden ausgewählt, da sie Kennzeichen für die Identifizierung von Müller-Zellen und die Sicherstellung des Erfolgs und der Reinheit der Müller-Zellkultur sind.
7. Den Sekundärantikörper (mit einer Antikörperkonzentration von 1:1000 in Blockierungspuffer in einem 150-200 μl/Objektträger) zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren. Dann dreimal (jeweils 5-10 Minuten) mit PBS/Triton X-100 waschen.
8. Tragen Sie einen Tropfen DAPI-Eindeckmedium auf, um die Kerne zu markieren, bevor Sie den Objektträger mit einem Deckglas abdecken. Vermeiden Sie Luftblasen beim Anbringen des Deckglases.
9. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um den Objektträger zu überprüfen und Bilder aufzunehmen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Zellen werden mit DAPI bei ex/em 359/461 bei 10-facher Vergrößerung lokalisiert, um Zellen zu lokalisieren. Durch eine höhere Vergrößerung können Zellen eingefangen werden. Andere Wellenlängen hängen von der gewählten Farbe ab. Grüne Farbe (GFP)- ex/em 488/510. Rote Farbe (Cy3)- ex/em 555/569.

Validierung der Spezifität, Reinheit und Barrierefunktion von isolierten Müller-Zellen
Um die Lebensfähigkeit, Morphologie und charakteristischen Eigenschaften der isolierten Müller-Zellen zu bestätigen, wurden die Zellen unter einem Lichtmikroskop untersucht. Es wurden P0- und P1-Bilder aufgenommen (Abbildung 1A). Um die Kontamination der isolierten Müller-Zellen mit RPE-Zellen zu überprüfen und ihre Reinheit zu bestätigen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung (IF) mit Antikörpern durchgeführt, die spezifisch für den RPE-Zellmarker RPE65 sind. Als Positivkontrolle wurden humane retinale pigmentierte Zellen (ARPE -19) verwendet. RPE65-gefärbte RPE-Zellen (rot und blau für die Kernfärbung) sind in Abbildung 1B (unteres Bild) dargestellt. RPE65-spezifische Antikörper färbten die isolierten Müller-Zellen nicht (Abbildung 1B, oberes Bild). Die Tatsache, dass das RPE65 die ARPE-19-Zellen (rot) gefärbt hat und die isolierten Zellen nicht gefärbt hat, deutet darauf hin, dass es sich bei den isolierten Zellen nicht um RPE-Zellen handelt. Das Vorhandensein von Pyruvat und niedriger Glukose in den Medien schafft ungünstige Bedingungen für das Wachstum von RPE-Zellen. Folglich lösen sie sich auch im Falle einer Kontamination der RPE-Zellen schließlich vom Kolben.

Darüber hinaus wurde zur Bestätigung der Identität isolierter Zellen eine Müller-Zell-Immunfluoreszenzfärbung für Müller-Zell-spezifische Marker verwendet, um die erfolgreiche Isolierung von Müller-Zellen zu bestätigen. Das Zytoskelett-Zwischenfilamentprotein namens Vimentin wurde verwendet12,13. Darüber hinaus wurde auch die Glutaminsynthetase (GS) verwendet, die die Reaktion der Kondensation von Glutamat und Ammoniak zu Glutamin katalysiert, als Schlüsselfunktion der retinalen glialen Müller-Zellen.

Insgesamt wurden die isolierten Zellen negativ für RPE65 (rot, Abbildung 1B), positiv für Vimentin (grün, Abbildung 1C) und GS (grün, Abbildung 1D) gefärbt. Die IF-Färbung bestätigt die erfolgreiche Isolierung (Reinheit und Spezifität) der isolierten Müller-Zellen. Abbildung 1E zeigt eine Negativkontrolle für Vimentin (oberes Feld) und GS (unteres Feld), die die Spezifität der Antikörper bestätigt.

Abbildung 1: Validierung der Müller-Zellisolierung (Reinheit und Spezifität). (A) Lichtmikroskopisches Bild für die Passagen: Passage Null(P0)und (P1)Morphologie. (B) RPE65-Immunfärbung in Kombination mit DAPI-Kernfärbung. (C) Vimentin-Immunfärbung mit DAPI-Kernfärbung bei hoher Vergrößerung. (D) GS-Immunfärbung bei gleicher hoher Vergrößerung. (E) Negativkontrollen zur Bestätigung der Spezifität der Vimentin- und GS-Antikörperfärbung. Maßstabsleiste = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm bzw. 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären, die für den Inhalt dieses Artikels relevant sind.