Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-basierter Nachweis und Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA

Summary

Der auf der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Nachweis und die Quantifizierung der DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) ist eine empfindliche und genaue Methode zur Diagnose und Überwachung von HBV-Infektionen. Hier stellen wir ein Protokoll für den HBV-DNA-Nachweis und die Viruslastmessung einer Probe vor.

Abstract

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist weltweit eine der Hauptursachen für Lebererkrankungen. Es kann zu akuten oder chronischen Infektionen führen, was die Menschen sehr anfällig für tödliche Leberzirrhose und Leberkrebs macht. Der genaue Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA im Blut sind für die Diagnose und Überwachung einer HBV-Infektion unerlässlich. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von HBV-DNA ist die Echtzeit-PCR, mit der das Virus nachgewiesen und die Viruslast beurteilt werden kann, um das Ansprechen auf eine antivirale Therapie zu überwachen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Das Kit verwendet Primer und Sonden, die auf die hochkonservierte Kernregion des HBV-Genoms abzielen und alle HBV-Genotypen (A, B, C, D, E, F, G, H, I und J) genau quantifizieren können. Das Kit enthält auch eine endogene interne Kontrolle zur Überwachung einer möglichen PCR-Hemmung. Dieser Assay läuft über 40 Zyklen und sein Cutoff liegt bei 38 Ct. Für die Quantifizierung von HBV-DNA in klinischen Proben wird ein Satz von 5 Quantifizierungsstandards mit dem Kit geliefert. Die Standards enthalten bekannte Konzentrationen von HBV-spezifischer DNA, die gegen den 4^. Internationalen Standard der WHO für HBV-DNA für den Nukleinsäuretest (NIBSC-Code 10/266) kalibriert sind. Die Standards werden verwendet, um die Funktionalität der HBV-spezifischen DNA-Amplifikation zu validieren und eine Standardkurve zu erstellen, die die Quantifizierung von HBV-DNA in einer Probe ermöglicht. HBV-DNA mit einem Gehalt von nur 2,5 IE/ml wurde mit dem PCR-Kit nachgewiesen. Die hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Kits machen es zu einem leistungsstarken Werkzeug in klinischen Labors, das medizinisches Fachpersonal bei der effektiven Diagnose und Behandlung von HBV-Infektionen unterstützt.

Introduction

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein teilweise doppelsträngiges DNA-Virus aus der Gattung Orthohepadnavirus und der Familie der Hepadnaviridae ¹. Es kann eine chronische Infektion auslösen, die ein Leben lang anhält und möglicherweise zu Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom führt ^2,3,4. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) lebten im Jahr 2019 schätzungsweise 296 Millionen Menschen mit einer chronischen Hepatitis-B-Infektion, und^{jedes Jahr} infizierten sich 1,5 Millionen Menschen neu 5.

Protocol

An dieser Studie wurden keine menschlichen Teilnehmer oder klinischen Proben beteiligt. Das einzige biologische Material, das verwendet wurde, war der 4^. Internationale Standard der WHO für HBV-DNA für Nukleinsäuretests (NIBSC-Code 10/266). Bei dieser Norm handelt es sich um ein öffentlich zugängliches Referenzmaterial, das keine personenbezogenen oder identifizierbaren Daten enthält. Daher war für diese Studie keine ethische Genehmigung erforderlich.

1. DNA-Extraktion

1. Extrahieren Sie die virale DNA aus einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe. Lagern Sie die extrahierte DNA bei -20 °C bis zur weitere....

Results

Ein schematisches Diagramm des Arbeitsablaufs zum Nachweis und zur Quantifizierung von HBV-DNA aus menschlichem Plasma/Serum ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Verstärkungsdiagramm von Standard 2 (als PC verwendet) und NTC für HBV und IC ist in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Amplifikationskurven für eine HBV-positive, eine HBV-negative Probe und eine Probe mit PCR-Inhibition. Die Amplifikationskurve, der Ct-Wert für.......

Discussion

Dem NIBSC-Code 10/266 wurde eine Einheit von 9.55.000 IE/ml zugewiesen, wenn er in 0,5 ml nukleasefreiem Wasser gemäß den Lieferanteninformationen²¹ rekonstituiert wird. Dies kann als hochbelastete HBV-positive Probe betrachtet werden. Die HBV-Viruslast, die mit dem in dieser Studie verwendeten Viruslast-Kit bestimmt wurde, betrug 6.65.900 IE/ml (Abbildung 4). Da die DNA-Extraktionseffizienz eines DNA-Extraktionskits nicht 100 % beträgt, geht während des Reinigungspro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th Internationaler WHO-Standard für Hepatitis-B-Virus-DNA	NIBSC	NIBSC-Code: 10/266	Der 4. Internationale Standard der WHO für die DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV), NIBSC-Code 10/266, ist für die Kalibrierung von Sekundärreferenzreagenzien vorgesehen, die in HBV-Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) verwendet werden.
ABI real-time PCR-Maschinen	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	Dies ist ein Echtzeit-PCR-Gerät
HBV, HCV und HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC-Code: 14/198	Hierbei handelt es sich um ein sehr niedriges positives Triplex-Reagenz für NAT-Assays, die Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV) und humanes Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) enthaltenQIAGEN
real-time PCR-Gerät	Qiagen	Rotor-Gene Q	Dies ist ein real-time PCR-Gerät
TRUPCR HBV Viruslast-Kit	Kilpest India Limited	3B294	Dies ist ein Echtzeit-PCR-basiertes Kit, das in dieser Studie für den HBV-DNA-Nachweis und die Bestimmung der Viruslast verwendet
TRUPCR Virales Nukleinsäure-Extraktionskit	Kilpest India Limited	3B214	Dies ist ein DNA-Extraktionskit, das für die Extraktion von HBV-Virus-DNA aus NIBSC:10/266 und NIBSC:14/198 verwendet wird