Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität

Zusammenfassung

Dieses Verfahren beschreibt, wie Acanthamoeba spp. visualisiert, verfolgt und quantifiziert wird.Motilität.

Zusammenfassung

Die Akanthamöben-Keratitis ist eine schwere Augeninfektion, die eine Herausforderung für die Behandlung darstellt und zur Erblindung führen kann. Trotz seiner Allgegenwart und der potenziellen Kontamination von Kontaktlinsen nach Wasserkontakt bleibt das natürliche Verhalten dieses Erregers schwer fassbar. Das Verständnis der Bewegungsmuster von Akanthamöben kann uns Aufschluss darüber geben, wie sie Kontaktlinsen besiedelt und die Hornhaut des Patienten kontaminiert. Es ist ein Glück, dass Acanthamoeba spp. sind mittels Hellfeldmikroskopie ab 4-facher Vergrößerung sichtbar. Bisherige Techniken wurden entwickelt, um die Motilität von Akanthamöben im Hinblick auf zytopathische Effekte oder Unterexposition gegenüber dem elektrischen Feld zu quantifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verfolgung und Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität langfristig (Stunden bis Tage), ein Protokoll, das auf mehrere Amöbenstämme, Oberflächen und den Ernährungszustand von Amöben anwendbar ist. Dieses Verfahren ist wichtig für die Bestimmung vieler Quantifizierungen der Kernmotilität, wie z. B. Entfernung, Geschwindigkeit, Einschluss und Richtung, die zur Überwachung verschiedener Stadien der Infektion, Proliferation oder Verhaltensänderung erforderlich sind.

Einleitung

Die Akanthamöbenforschung hat in den letzten Jahren aufgrund der zunehmenden Prävalenz der Akanthamöben-Keratitis (AK), einer parasitären Infektion nach der Anheftung von Akanthamöben an die Hornhaut, dramatisch zugenommen¹. Während Ausbrüche von AK auf eine unsachgemäße Kontaktlinsenpflege oder unwirksame Kontaktlinsenpflegelösungen zurückzuführen sind 2,3,4,5, gibt es derzeit keine Anforderungen zum Nachweis der Desinfektionswirksamkeit von Akanthamöben für irgendein Produkt auf dem Markt. In der wissenschaftlichen Gemeinschaft und innerhalb der Normungsorganisationen gibt es jedoch laufende Bemühungen, die Protokolle zu untersuchen, die zur Quantifizierung der Desinfektionswirkung von Kontaktlinsenpflegeprodukten erforderlich sind ^6,7. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Akanthamöben aufgrund ihrer Ähnlichkeit in zellulären und funktionellen Aspekten mit menschlichen Makrophagen eine bedeutende Rolle bei der Beherbergung und Verbreitung anderer menschlicher Krankheitserreger^{spielt 8}, zusätzlich zu der Pathogenität, die die Amöbe selbst mit sich bringt.

Neuere Techniken wurden beschrieben, die in der Lage waren, die Motilität von Akanthamöben - die im Allgemeinen nicht stark der Brownschen Bewegung unterliegt ^9,10 - im Hinblick auf zytopathische Effekte oder eine Unterexposition gegenüber dem elektrischen Feld ^9,11 zu quantifizieren, sowie Fortschritte in der Motilitätsanalyse in der Riesenvirusforschung unter Verwendung von Akanthamöben als verfolgbarem viralen Vektor ^{12, 13}. Schadenfreude In den letzten 20 Jahren gab es auch konstante und signifikante Verbesserungen bei der Zell- und Partikelverfolgung unter Verwendung neuer Softwareprogramme wie der hier verwendeten Bildgebungssoftware sowie neuer Algorithmen und Deep-Learning-Technologien¹⁴. Dies ist jedoch ein relativ neues und wachsendes Wissenschaftsgebiet in Bezug auf Tischforschung, klinische Anwendung und industrielle Standards, und es gibt einen Mangel an veröffentlichten Daten zu Methoden zur Visualisierung und Verfolgung dieser Amöbe, insbesondere zur Quantifizierung von Verhaltensänderungen nach dem Ankleben von Kontaktlinsen oder während oder nach der Kontaktlinsendesinfektion. Andere Bereiche, die sich auf die langfristige visuelle Überwachung ausweiten, haben diese Bemühungen unterstützt ^15,16,17. Aufgrund der inhärenten Herausforderung von Akanthamöben - einschließlich einer allgemeinen Resistenz gegen Plasmide (die Fluoreszenz verleihen können), der Fähigkeit der Amöbe, Standard-Zellfarbstoffe zu konsumieren und zu zerstören, und einer einzigartigen äußeren Proteinzusammensetzung, die das Markieren von Antikörpern erschwert - waren Methoden, die anderen Zellen zur Verfügung stehen und sie in anderen Umgebungen als der Hellfeldbildgebung sichtbar machen, in diesem Organismus unbrauchbar. Die Quantifizierung der Motilität dieser Amöbe hat somit eine bedeutende Bereicherung für das Feld dargestellt. Mit der hier beschriebenen Methode konnten wir feststellen, dass Amöben ohne Nährstoffe mindestens 12 h lang beweglich bleiben¹⁸ und dass Amöben, die mit einem Desinfektionsprozess konfrontiert sind und während der Desinfektion ihre Beweglichkeit einstellen, ihre Beweglichkeit nach der Desinfektion wiedererlangen können, wenn sie nicht vollständig lysiert werden¹⁹.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Motilität von Amöben mikroskopisch visuell verfolgt und quantifiziert werden kann. Die Hauptschritte bestehen darin, Amöben im Hellfeld mit dem richtigen Fokus und Timing zwischen den Bildern aufzunehmen, die Bilder mit Hilfe einer Bildgebungssoftware in Binärbilder umzuwandeln und dann das Tracking-Plugin einer Bildgebungssoftware zu verwenden, um die experimentellen Parameter einzustellen und jeder Amöbe zu folgen, um die erforderlichen Messungen wie Geschwindigkeit, Entfernung und Einschluss zu bestimmen. Im Anschluss daran ist es möglich, die Chemotaxis einer Amöbe oder einer Amöbenpopulation zu quantifizieren, um die Richtungsabhängigkeit zu definieren. Der wichtigste Beitrag dieser Methode besteht darin, das Verhalten von Amöben während verschiedener Zustände der Ernährungsunterstützung, der Oberflächenadhärenz, der Desinfektionsherausforderung oder anderer Umweltveränderungen wie dem Zusammenleben mit Säugetierzellkulturen zu visualisieren und zu quantifizieren.

Protokoll

1. Akanthamöben-Zubereitung

HINWEIS:Dieses Protokoll wurde für ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 und PRA-411 verifiziert. Dies ist ein BSL2-Erreger und sollte in einer BSL2-Haube und einem Labor gearbeitet werden.

1. Erzeugen Sie eine Masterkultur aus einem Probenfläschchen oder einem vorbereiteten Stopfen²⁰ , indem Sie einen T75-Kolben mit 30 mL AC6-Medium füllen und aseptisch einen Stopfen oder den Inhalt eines Probenfläschchens hinzufügen. Der Kolben wird 3-5 Tage lang bei 26-30 °C inkubiert, bis der Kolben zu 50 % bis 80 % konfluiert ist.
2. Passieren Sie die Zellen am Vortag, bevor sie benötigt werden, um eine homogene Population von Trophozoiten zu bilden.
   1. Je nach Bedarf des Stammes die Masterkultur 2x schütteln und/oder kräftig anschlagen, um anhaftende Trophozoiten zu entfernen.
   2. Füllen Sie einen T75-Kolben mit 30 mL AC6-Medium. Geben Sie 2 mL der Masterkultur in die Passage. Den Kolben 18-24 h bei 26-30 °C inkubieren.
3. Vor der Ernte die Trophozoitenpopulation unter 4-facher Vergrößerung am Mikroskop visuell untersuchen. Stellen Sie sicher, dass die Trophozoiten haftend und einheitlich sind.
4. Schlagen Sie den Kolben 2x zügig an, um anhaftende Trophozoiten zu entfernen. Gießen Sie den Inhalt in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
5. Drehen Sie das Röhrchen bei 500 x g für 5 min in einer ausgeglichenen Zentrifuge, um die Amöbe zu pelletieren. Gießen oder pipettieren Sie das überstehende Medium ab und entsorgen es. Verdünnen Sie das Pellet in 2-10 ml 1/4 Ringer-Lösung.
6. Die Probe verwirbeln. Geben Sie 10 μl Probe in ein Einweg-Hämozytometer und zählen Sie die KBE/ml der Akanthamöbe.
7. Basierend auf der Hämozytometerzahl verdünnen Sie das Amöbenpellet auf eine Konzentration von 7,5 x 10³ Zellen/ml in 1/4 Ringer-Lösung.
8. Samenamöbe auf einer Oberfläche, die aus Glas, Kunststoff oder Nicht-Nährstoff-Agar bestehen kann, und eine Vielzahl von Vertiefungsformen, abhängig von den experimentellen Anforderungen, wie unten beschrieben.
   1. 96-Well-Platte: Jede Vertiefung mit 200 μl Akanthamöben-Suspension aussäen und die Platte mit dem Deckel umschließen.
   2. 48-Well-Platte: Jede Vertiefung mit 1 ml Akanthamöben-Suspension aussäen und die Platte mit dem Deckel umschließen.
   3. Durchflusszelle: Geben Sie langsam 4 ml Akanthamöbensuspension durch die sterilen Öffnungen einer sterilen Aluminium-Durchflusszelle, um Blasen in der Kammer zu vermeiden. Klemmen Sie die Anschlüsse zu, nachdem die Aufhängung hinzugefügt wurde.
9. Lassen Sie die Amöbe vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten an der Oberfläche haften, bevor Sie mit der mikroskopischen Aufnahme beginnen.

2. Akanthamöben visualisieren und aufzeichnen

1. Visualisieren Sie die Amöbe bei 4-facher Vergrößerung im Hellfeld. Der Hintergrund sollte hellgrau erscheinen und die Amöbe sollte schwarz sein. Passen Sie das Licht und den Fokus so an, dass die Amöbe durchgehende dunkle Ringe statt durchscheinend sind (also leicht unscharf, Abbildung 1).
   HINWEIS: Die optimale Vergrößerung ist aus mehreren Gründen 4x für die Verfolgung: Amöben, die das Sichtfeld während der Verfolgung verlassen oder betreten, sollten nicht in die Datenanalyse einbezogen werden, daher unterstützt die niedrigere Vergrößerung am besten die maximale Anzahl von Amöben, die in einem bestimmten Zeitraum in die Analyse einbezogen werden. Amöben sollten als durchgehende schwarze Kreise im Hellfeld erscheinen, um sie für die Tracking-Analyse in binäre Kreise umzuwandeln. Dies ist am einfachsten bei einer geringeren Vergrößerung zu erreichen, da bei höheren Vergrößerungen die durchscheinende Natur und die inneren Strukturen der Amöbe leicht sichtbar werden. Im Allgemeinen können mehr Amöben in einem einzigen Sichtfeld in geringerer Vergrößerung erfasst werden, was eine robustere Datenanalyse ermöglicht.
2. Stellen Sie die Aufnahmeprogramme in der Bildgebungssoftware so ein, dass in regelmäßigen Abständen ein Bild aufgenommen wird, um die Amöbe zu verfolgen. Die längste Zeit zwischen den Bildern, die eine genaue Verfolgung ermöglicht, beträgt 30 s, die optimale Zeit für Dateigröße und Tracking-Details wird entweder bei 12 s oder 24 s empfohlen.
3. Amöben können mehrere Tage am Stück verfolgt werden, aber seien Sie sich der Dateigröße bewusst, die diese Art der Aufnahme erzeugt, und der inhärenten Schwierigkeit, extrem große Dateien zu manipulieren. Um dies zu vermeiden, nehmen Sie Amöben abschnittsweise in bestimmten Abständen auf. Nehmen Sie zum Beispiel 5 Tage lang alle 12 Stunden 1 Stunde auf.
4. Wenn das Mikroskop und das Programm es zulassen, können Sie mehrere Wells in einer einzigen Sitzung mit den XY-Koordinaten der Platten-Wells oder mehreren Positionen einer Durchflusszelle aufzeichnen. Fügen Sie bei Bedarf mehrere Abschnitte einer Vertiefung oder Durchflusszelle zusammen, um ein größeres Sichtfeld bei 4-facher Vergrößerung zu erzeugen.
   HINWEIS: Die einzige Einschränkung für die Anzahl der Aufnahmeorte besteht darin, wie schnell sich der Mikroskoptisch innerhalb des Bildintervalls zwischen den Positionen bewegen kann (z. B. alle 12 s, 24 s usw. ein Bild aufnehmen). Dies ist jedoch nicht erforderlich, und das Verfolgen von Videos, die von einem einzigen Standort aus erstellt wurden, kann immer noch eine ausreichende Anzahl von Spuren für eine robuste statistische Analyse aufweisen. In dieser Studie wurde ein Nikon Eclipse Ti-U-Mikroskop verwendet, und der automatisierte bewegliche Tisch wurde verwendet, um Bilder in mehreren Vertiefungen gleichzeitig aufzunehmen. Jedes Mikroskop mit einer programmierbaren Aufnahmefunktion funktioniert jedoch. Das Mikroskop muss an einen Computer angeschlossen werden können und in der Lage sein, Bilder auf einem Programm oder einer Festplatte aufzuzeichnen.

3. Analyse der Amöbengröße

1. Öffnen Sie die Mikroskopdatei in der Bildgebungssoftware. Die Importoptionen für Bioformate werden geöffnet. Stellen Sie im Dialogfeld sicher, dass Folgendes zutrifft: Stack-Anzeige; Ansicht mit: Auswahl-Hyperstack; Speicherverwaltung: Aktivieren Sie Virtuellen Stack verwenden; Farbmodus: Standard.
2. Stellen Sie sicher, dass keines der anderen Dropdown-Menüs oder Kontrollkästchen aktiviert ist. Klicken Sie auf OK.
3. Optionen für Bioformat-Serien öffnen. Wählen Sie aus, welche Serie benötigt wird. Wenn jeweils nur ein Standort aufgezeichnet wird, gibt es hier wahrscheinlich nur eine Option. Klicken Sie auf OK.
4. Wählen Sie Bild > Duplizieren , um das einzelne Well, mit dem jeweils gearbeitet wird, zu duplizieren, indem Sie nur einen C-Kanal und nur einen Z-Kanal auswählen.
5. Von hier an arbeiten Sie nur noch mit dem duplizierten Bild zur Manipulation und Analyse, nicht mit dem Original. Wählen Sie Image > geben Sie > 8-Bit ein. Wählen Sie "Prozess" > "Hintergrund subtrahieren".
6. Stellen Sie die rollende Kugel auf 10,0 ein. Überprüfen Sie den hellen Hintergrund. Aktivieren Sie Gleitparaboloid.
7. Wählen Sie "Prozess" > "Kontrast verbessern". Legen Sie gesättigte Pixel auf 0,1 % für Trophozoiten oder 0,3 % für eine Gruppe von Zellen und Aggregaten fest.
8. Wählen Sie Bild > >Schwellenwert anpassen (Standardeinstellung > S/W). Der Make Binary-Prozess wird geöffnet. Wählen Sie Standard und aktivieren Sie Schwarzer Hintergrund (von Binärmasken).
9. Wählen Sie den Schwellenwert aggressiv so, dass die meisten Hintergrundflecken nicht sichtbar sind, aber ein Teil jeder Amöbe sichtbar ist.
10. Wenn die Imaging-Software das Bild invertiert hat und der Hintergrund weiß und die Amöbe schwarz ist, gehen Sie zu Bearbeiten > Invertieren , um sie auf einen schwarzen Hintergrund und weiße Amöbe zu fixieren.
11. Wählen Sie Prozess> Binär > Schließen, falls die Zellen aufgrund von Unschärfe oder Motilität der Zelle einen geringen Platz in der äußeren Membran haben.
12. Wählen Sie Prozess > Binär > Löcher füllen. Entfernen Sie Nicht-Amöben-Artefakte, indem Sie die Formzeichnungswerkzeuge und die Option "> Füllung bearbeiten" verwenden. Wenn der Hintergrund zu diesem Zeitpunkt weiß und die Amöbe schwarz ist, wählen Sie "Bearbeiten" > "Invertieren". An dieser Stelle sollte das Bild die binären Bilder in Abbildung 2 darstellen.
13. Um die Größe jeder Amöbe aufzuzeichnen, wählen Sie "Analysieren" > "Partikel analysieren". Setgröße: 10-Infinitiy, Rundheit: 0-1, Zeige: Nichts. Aktivieren Sie Nur Ergebnisse anzeigen und zusammenfassen.
14. Speichern Sie die angezeigten CSV-Dateien. Wählen Sie Datei > Speichern unter > Tiff und bearbeiten Sie den Namen in der gewünschten Spezifikation.

4. Vorbereitung der Mikroskopdateien für das Tracking (Motilitätsanalyse)

1. Öffnen Sie die Mikroskopdatei in der Bildgebungssoftware. Die Importoptionen für Bioformate werden geöffnet.
2. Stellen Sie im Dialogfeld sicher, dass Folgendes zutrifft: Stack-Anzeige; Ansicht mit: Auswahl-Hyperstack. Aktivieren Sie für die Speicherverwaltung die Option Virtuellen Stack verwenden. Klicken Sie auf OK.
3. Die Optionen für Bioformate-Serien werden geöffnet. Wählen Sie aus, welche Serie benötigt wird. Wenn jeweils nur ein Standort aufgezeichnet wird, gibt es hier wahrscheinlich nur eine Option. Klicken Sie auf OK.
4. Wählen Sie Bild > Duplizieren. Von hier an arbeiten Sie nur noch an dem duplizierten Abschnitt des Videos, anstatt an der Originaldatei.
   HINWEIS: Duplizieren Sie den Abschnitt des Videos, der zu diesem Zeitpunkt verfolgt wird. Dazu muss man die Frames kennen, die den für das Experiment benötigten Minuten entsprechen. Wenn man zum Beispiel die 1^. Stunde verfolgen möchte und alle 24 s Bilder aufnimmt, sollte es in der 1^. Stunde 150 Bilder geben. Daher ist die 1^. Stunde die Frames 1-150, die 2^. Stunde 151-300 und so weiter.
5. Wählen Sie Image > geben Sie > 8-Bit ein. Wählen Sie "Prozess" > "Hintergrund subtrahieren". Setzen Sie die rollende Kugel auf 10,0.
6. Überprüfen Sie den hellen Hintergrund. Aktivieren Sie Gleitparaboloid. Wählen Sie "Prozess" > "Kontrast verbessern" und stellen Sie den Wert auf 0,1 % ein.
7. Aktivieren Sie Alle x#-Slices (z. B. alle 150 Slices). Deaktivieren Sie Normalisieren. Wählen Sie Bild > >Schwellenwert anpassen (Standardeinstellung > S/W).
8. Der Make Binary-Prozess wird geöffnet. Wählen Sie Standard aus. Überprüfen Sie den schwarzen Hintergrund (von Binärmasken).
9. Schwellenwert aggressiv, so dass die meisten Hintergrundflecken nicht sichtbar sind, aber einige Teile der Amöbe sichtbar sind. Wenn in diesem Schritt der Hintergrund weiß und die Amöbe schwarz ist, wählen Sie Bearbeiten > Invertieren aus. Der Hintergrund sollte schwarz sein und die Amöbe sollte weiß sein.
10. Wählen Sie Verarbeiten > Binärdatei > Schließen. Wählen Sie Prozess > Binär > Löcher füllen. Wählen Sie Datei > Speichern unter > Tiff und bearbeiten Sie den Namen in der gewünschten Spezifikation. Die Datei ist nun bereit für die Nachverfolgung.

5. Analyse der Motilität durch Tracking

1. Gehen Sie in der Imaging-Software mit der TIFF-Datei, die zum Verfolgen des Öffnens benötigt wird, zu Plugins > Tracking > Trackmate. Die Version von Trackmate wird geöffnet.
2. Wählen Sie Next (Weiter) aus. Wählen Sie den LoG-Detektor aus dem Dropdown-Menü des Detektors aus. Legen Sie den geschätzten Blob-Durchmesser fest: 35,0 Mikrometer, Schwellenwert 1,0. Deaktivieren Sie Medianfilter verwenden und Subpixel-Lokalisierung durchführen.
3. Klicken Sie am ersten, mittleren und letzten Slice auf Vorschau . Stellen Sie sicher, dass alle Amöben von einem violetten Kreis erfasst werden und dass Hintergrunddefekte oder Artefakte nicht enthalten sind.
4. Wählen Sie Next (Weiter) aus. Die Verarbeitung beginnt und dieser Schritt kann einige Minuten dauern. Eine Erkennungsleiste am oberen Rand des Bildschirms zeigt an, wie viel des Vorgangs abgeschlossen ist.
5. Wählen Sie Weiter aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Wählen Sie bei der anfänglichen Schwellenwerterstellung erneut Weiter aus, ohne etwas auszuwählen. Wählen Sie Hyperstack Displayer aus, wenn Sie eine Ansicht auswählen. Wählen Sie Next (Weiter) aus.
6. Setzen Sie den Filter auf Spots und wählen Sie Weiter , ohne etwas auszuwählen. Wählen Sie einen Tracker aus. Wählen Sie dazu LAP Tracker (anstelle von Simple LAP Tracker). Wählen Sie Next (Weiter) aus.
7. Legen Sie bei der Frame-to-Frame-Verknüpfung den maximalen Abstand auf 40 μm fest. Auf dem Gleissegment Lückenschluss aktivieren Lückenschluss zulassen. Stellen Sie dafür den maximalen Abstand auf 100 μm und den maximalen Rahmenabstand auf 4 ein. Wählen Sie nichts für die Aufteilung von Spursegmenten oder das Zusammenführen von Spursegmenten aus.
8. Wählen Sie Next (Weiter) aus. Die Ausführung der Nachverfolgung kann viel Zeit in Anspruch nehmen. Wenn es abgeschlossen ist, sollte das Fenster unten anzeigen: Tracking done in x s. Wählen Sie Next (Weiter) aus.
9. Wählen Sie erneut Weiter aus, wenn die Nachverfolgung abgeschlossen ist. Filter für Tracks festlegen: Wähle das + -Zeichen unten links aus, um einen Filter für die Anzahl der Spots in Tracks hinzuzufügen. Legen Sie den Filter für mindestens 93 % der Frames auf "Oben" fest (z. B. wären für 150 Frames mindestens 140 Spots erforderlich).
   HINWEIS: Bei einigen Versionen dieser Software muss das entgegengesetzte Äquivalent ausgewählt werden, z. B. Unter mindestens 7 %, was durch Ziehen einer Linie nach links oder rechts erfolgen kann, um die gewünschte Zahl zu erreichen.
10. Wählen Sie Next (Weiter) aus. Die Anzeigeoptionen werden angezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Spuren in jedem Frame nicht verformt oder seltsam in der Art und Weise sind, wie sich die Amöbe bewegt, bevor Sie die Trackmate-XML-Datei oder die Tracks CSV-Datei speichern.
11. Wenn ein Track gelöscht werden muss, klicken Sie auf TrackScheme. TrackScheme zeigt alle Spuren und Berührungspunkte für die Amöbe in allen Frames an.
    HINWEIS: Mögliche Gründe für das Löschen einer Spur sind, dass eine Amöbe während der Aufnahme auf/aus dem Sichtfeld gelaufen ist, eine Spur im Vergleich zum tatsächlichen Weg der Amöbe unangemessen geformt ist oder aus irgendeinem Grund die Spur oder die Amöbe gemäß den experimentellen Parametern ein Ausreißer in den Daten ist usw.
12. Klicken Sie auf die Amöbe, um den Fleck auf dem Bildschirm grün zu markieren, und in Trackscheme wird der Fleck von einem grünen Quadrat umgeben. Dies zeigt an, welche Spur oder Stelle entfernt werden muss.
13. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Spur, die entfernt werden soll, und wählen Sie Gesamte Spur aus. Drücken Sie die Entf-Taste .
14. Nachdem Sie alle Tracks überprüft haben, speichern Sie die Tracking-Datei, indem Sie unten links im Popup-Fenster der Tracking-Software auf Speichern klicken. Speichern Sie die XML-Datei mit dem Videonamen. Klicken Sie auf Fortsetzen , um zum Popup-Fenster der Tracking-Software zurückzukehren.
15. Klicken Sie auf Tracks und wählen Sie links Tracks aus. Klicken Sie auf In CSV exportieren und speichern Sie die CSV-Datei.
16. Wenn die Tabelle die resultierende CSV-Datei nicht erkennt, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Öffnen Sie die gespeicherte CSV-Datei im Editor. Klicken Sie auf Strg + A und Strg + C , um den gesamten Inhalt zu kopieren.
    2. Öffnen Sie die Tabelle, und klicken Sie auf Strg + V , um sie in die Tabelle einzufügen. Alle Daten befinden sich in einer Zelle.
    3. Wenn die Zellen mit den Daten noch markiert sind, wechseln Sie zu Daten > Text in Spalten. Wählen Sie Delimited > Next aus. Wählen Sie Komma > Weiter > Fertig stellen. Speichern Sie diese Datei als neue CSV-Datei.
17. In der Tracking-CSV-Datei stehen viele Parameter für die Analyse zur Verfügung (Abbildung 3). Kopieren Sie die gewünschten Parameter, und fügen Sie sie zur Analyse in eine neue CSV-Datei ein (Abbildung 4). Die hier verwendeten Parameter werden im Folgenden beschrieben.
    1. Gesamtstrecke: Gesamtstrecke, die eine Amöbe zurücklegt, in μm.
    2. Max. zurückgelegte Entfernung: die maximale Entfernung auf dem Weg einer Amöbe von ihrem Startpunkt - dies muss nicht unbedingt der Endpunkt sein
       
       Wobei dij die Entfernung zu jedem Punkt I zu jedem Punkt j auf der Strecke ist.
    3. Confinement Ratio: Das Confinement Ratio gibt an, wie effizient eine Amöbe es war, sich von ihrem Startpunkt zu entfernen: bewegte sie sich in einer geraden Linie von ihrem Startpunkt weg (ein Wert nahe 1) oder blieb sie relativ nahe an ihrem Startpunkt (ein Wert nahe 0).
       
    4. Mittlere Geschwindigkeit verfolgen: Durchschnittliche Geschwindigkeit der Amöbe über die gesamte zurückgelegte Strecke in Mikrometern pro Sekunde.
       
    5. Spurverschiebung: Der Abstand zwischen dem Startpunkt einer Amöbe und dem Endpunkt in Mikrometern.
       HINWEIS: Alle Analyseparameter der Bildgebungssoftware und ihre Definitionen finden Sie hier: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Denken Sie daran, dass jede gespeicherte Datei eine Zusammenfassung der zu diesem Zeitpunkt analysierten Tracks ist. Um eine robuste Datenanalyse zu erstellen, muss man die Ergebnisse aus mehreren Replikaten, Stunden usw. angemessen kombinieren, wie es für die Daten geeignet ist (Abbildung 5 und Abbildung 6).

Ergebnisse

Um mit dieser Methode erfolgreich zu sein, gibt es mehrere entscheidende Gesamtaspekte zu berücksichtigen. Die erste ist die physische Einrichtung der Amöbe und des Mikroskops, die zweite ist die ordnungsgemäße Nutzung der Bildgebungssoftware und die dritte ist das Exportieren und Analysieren der Bildgebungsdaten auf sinnvolle Weise.

Bevor mit der mikroskopischen Aufnahme begonnen wird, muss unbedingt sichergestellt werden, dass die Amöbe auf dem Mikroskoptisch richtig fokussiert ist (Abbildung 1). Anstatt sich auf die Amöbe in der optimalen Z-Ebene für einzelne Details zu konzentrieren, ist es hier ideal, sie ganz leicht unscharf zu betrachten, so dass sie zu soliden schwarzen Punkten werden, im Gegensatz zu ihrem durchscheinenden Zustand, wenn sie im Detail betrachtet werden. Auf diese Weise können die Bildgebungssoftware und die Tracking-Software jede einzelne Amöbe viel leichter finden, wenn die Datei in eine Binärdatei konvertiert wird (Abbildung 2). Zu wissen, was das Ziel in der Bildgebungssoftware ist - das heißt, dass jede Amöbe als klar definierter weißer Kreis erscheint, kann dem Leser helfen, den richtigen Fokus zu finden, wenn er die Originalbilder im Hellfeld aufnimmt. Wenn dann jeder Kreis klar definiert ist, kann die Tracking-Software die Beweglichkeit jeder Amöbe richtig verfolgen und die individuellen Motilitätsmetriken für sie sammeln.

Nachdem Sie die Schritt-für-Schritt-Anweisungen im oben aufgeführten Protokoll für die Bildgebungssoftware und die Tracking-Software befolgt und sich auf das zugehörige Video bezogen haben, um die entscheidenden ersten Schritte der Nutzung der Bildgebungssoftware zu unterstützen, ist es an der Zeit, die Daten der Bildgebungssoftware zur Quantifizierung und Datenanalyse zu exportieren. Die Rohausgabe der Tracking-Software ähnelt der in Abbildung 3 gezeigten. Hier ist es wichtig zu überprüfen, ob die Anzahl der Spots in den exportierten Spuren den Erwartungen entspricht (z. B. wenn 93 % der Frames in jeder Spur vorhanden sein sollen und das Video insgesamt 100 Frames enthält, sollte jede exportierte Spur mindestens 93 Spots haben). Wenn die Spots nicht den Anforderungen entsprechen, muss man möglicherweise die Schritte der Tracking-Software erneut durchlaufen, um sicherzustellen, dass die erforderlichen Parameter korrekt eingestellt wurden.

Beginnen Sie beim Rohexport mit der Erstellung des Datenanalyseblatts (Abbildung 4). Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Spur eine singuläre Amöbe innerhalb eines singulären Replikats darstellt. Daher müssen, wie in Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6 zu sehen ist, alle Spuren für ein Frameset oder einen Zeitpunkt gemittelt werden (Abbildung 4), und dieser Vorgang muss für jedes Frameset oder jeden Zeitpunkt in einer gesamten Serie durchgeführt werden (d. h. wenn insgesamt 3 Stunden Video aufgenommen werden und die Datenpunkte durch die Stunde geteilt werden, dann gibt es drei Framesätze/Stunden, die pro Replikat analysiert werden müssen ( Abbildung 5). Schließlich müssen aus dieser Kombination von Durchschnittswerten in jedem Framesatz in jedem Replikat die gemittelten Daten aus jedem Replikat in einem Raum kombiniert werden, damit die Daten über mehrere Replikate hinweg analysiert werden können, um den wahren Durchschnitt und die Standardabweichung pro Zeitpunkt zu bestimmen (Abbildung 6).

Die Durchschnittswerte aus jedem Replikat werden für die Datenanalyse verwendet, und der kombinierte Durchschnitt und die Standardabweichung oder der Standardfehler aus allen Replikaten werden für die grafische Darstellung verwendet (wie in einem Beispiel in Abbildung 7 zu sehen). Wenn Sie Daten analysieren, wie wir es hier getan haben, d. h. mehrere Stichproben, die über mehrere Zeitpunkte verfolgt werden, ist es am besten, sie mit einer 2-Wege-ANOVA mit Wiederholungsmessung und einem Post-hoc-Tukey-Test zu analysieren. Dies ermöglicht es uns, die Unterschiede zwischen den Proben zu jedem Zeitpunkt und auch die Unterschiede innerhalb jeder Probe im Laufe der Zeit zu bestimmen.

Abbildung 1: Amöben erscheinen in der Hellfeldmikroskopie als undurchsichtige dunkle Formen. Vergrößertes repräsentatives Bild der Amöbe mit 4-facher Vergrößerung, leicht unscharf, um als durchgehende dunkle Ringe zu erscheinen. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Amöben, die in der Hellfeldmikroskopie abgebildet wurde, in ein Doppelsystem umgewandelt und verfolgt wurde. Die Amöbe mit 4-facher Vergrößerung im Hellfeld (links) wurde in binär umgewandelt, wobei Artefakte entfernt wurden (Mitte) und nach der Verfolgung ausgewählte Spuren angezeigt wurden (rechts). Obere Reihe: ein ganzes Bild, das durch Zusammenfügen von 4 Bildern aufgenommen wurde, Maßstabsleiste = 1000 μm. Untere Reihe: die Größe eines einzelnen Bildes vor dem Zusammenfügen, Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die unmittelbare Datenanalyseausgabe der Bildgebungs- und Tracking-Software enthält eine Vielzahl von Datentypen. Die repräsentative Ausgabe der Nachverfolgung ist in Abbildung 2 dargestellt, bei der es sich um ein einzelnes Video handelt. Notieren Sie sich die Spurnummern (roter Pfeil) und die Skip-Nummern, die darauf hinweisen, dass die Tracking-Software Spuren, die nicht mit den Parametern übereinstimmten, korrekt entfernt hat. In diesem Beispiel wurden nur 71 von 5385 identifizierten Spuren mit den Parametern ausgerichtet. Dieses Verhältnis ist bei solch strengen Richtlinien normal. Diese Anzahl von Spuren stimmt auch mit der Anzahl der Amöben überein, die in diesem Protokoll verwendet werden (wenn z. B. eine 96-Well-Platte mit 200 μL von 7,5 x 10³ KBE/ml pro Vertiefung besiedelt wird, dann sollte man mit etwa 1.500 Amöben in der Vertiefung rechnen und ungefähr so viele, die in einem 4-Stich-Sichtfeld sichtbar sind. Es wird wahrscheinlich viel mehr Spuren geben, als es Amöben gibt, da Amöben auf und aus dem Sichtfeld wandern und neue Spuren erzeugen). Diese Spurnummer ist auch in Abbildung 2 zu sehen, wo im Vergleich zu einer großen Anzahl von Punkten nur wenige Spuren sichtbar sind. Überprüfen Sie immer die Anzahl der Plätze in der Spur (rotes Kästchen), um sicherzustellen, dass nur die richtigen Spurlängen enthalten sind. Zum Beispiel beziehen wir hier mehr als 93 % der Frames ein, und es gab 127 Frames in diesem Abschnitt, sodass alle Spots über 118 liegen sollten. Gelb hervorgehoben sind die Messungen, die im Protokoll erwähnt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Daten wurden nach der ersten Datenausgabe nach Bedarf neu organisiert. Organisation der gewünschten Daten nach dem Export. (A) Die zur Quantifizierung ausgewählten relevanten Messungen wurden aus dem Export der Tracking-Software kopiert (Abbildung 3) und in eine neue Tabelle eingefügt. (B) Nachdem die gewünschten Messungen in der neuen Tabelle organisiert wurden, sollte der Durchschnitt jeder Spur berechnet werden. In diesem repräsentativen Beispiel wurden also die Gesamtdistanz, die maximale Entfernung, der Einschluss, die mittlere Geschwindigkeit und die Verschiebung jeder nutzbaren Spur in diesem einzelnen Video für jede Messung auf eine singuläre Zahl gemittelt. Beachten Sie auch hier, dass insgesamt 71 Spuren die Parameter für die Frames 1-127 erfüllten. Es wird wahrscheinlich eine unterschiedliche Anzahl geeigneter Spuren für jedes analysierte Video- oder Frameset geben, wie in Abbildung 5 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Sequenzielle Frames, die für die Analyse einer ganzen Bildserie oder eines Videos festgelegt sind. Dies ist ein repräsentatives Bild für die Hinzufügung von sequenziellen Videos zur Datenanalyse. Unter der Annahme, dass die Bilder 1-127 Stunde 1 des Videos darstellen (hier besteht 1 Stunde aus der Aufnahme eines Bildes alle 28 s). Die Frames 128 bis 254 sind die Stunde 2 des Videos und die Frames 255 bis 381 die Stunde 3 des Videos. Kombinieren Sie die exportierten Daten (wie in Abbildung 3 exportiert) aus allen Stunden in einem Blatt, um mit allen gleichzeitig zu arbeiten. Wie in Abbildung 4 dargestellt, werden die Daten aller verwendbaren Spuren für jedes Frameset/h gemittelt. Alles in Abbildung 5 sind die Daten aus einem Replikat oder einer Stichprobe. Wenn 3 Replikate vorhanden sind, gibt es 3 identisch angeordnete separate Tabellenkalkulationsregisterkarten, und die Daten aus diesen werden in eine neue Registerkarte eingespeist, wie in Abbildung 6 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Zusammengesetzte Daten aller Amöben in jedem Frameset, die zur Darstellung eines einzelnen Replikats verwendet werden. (A) Alle Durchschnittswerte aus jedem in Abbildung 5 dargestellten Frame müssen an einem zentralen Ort erfasst werden, damit die abschließende Datenanalyse abgeschlossen werden kann. In diesem repräsentativen Bild werden die Durchschnittswerte der Gesamtentfernung aus den ersten drei Frame-Sets (oder Stunden) angezeigt. Dies muss für jedes ausgeführte Beispiel/jede Bedingung/jedes Replikat wiederholt werden. Anschließend müssen die Durchschnittswerte aus jedem Sample aus jedem Frame-Set gemittelt werden (gelbes Feld). Dies ist der letzte Datenpunkt, von dem aus die Standardabweichung und der Standardfehler berechnet werden können. Die einzelnen Durchschnittswerte aus jeder Stichprobe (hier die Zahlen in B3, B4 und B5 für die Gesamtdistanz Stichprobe 1; C3, C4 und C5 für Total Distance Sample 2 usw.) wird verwendet, um die statistische Analyse durchzuführen. Dieser Vorgang wird für alle erforderlichen Messungen (Maximale Entfernung, Einschluss, mittlere Geschwindigkeit, Verschiebung usw.) wiederholt. (B) Um eine grafische Darstellung der Quantifizierung zu erstellen, verwenden Sie die Zahlen im gelben Feld als Datenpunkte, die für das endgültige Diagramm verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Rohe Motilitätsdaten für ATCC 30461 und ATCC 50370. Rohdaten (hier dargestellt als Mittelwert ± SE pro Stunde) wurden zuvor für frühere Studien erhoben und nicht veröffentlicht^18,19. Diese Motilitätsquantifizierung zeigt, dass diese beiden Amöben in ihren ersten 6 Stunden Motilität (gemessen an der Gesamtstrecke in Mikrometern, die in dieser Stunde zurückgelegt wurde) in 1/4 Ringer's Lösung auf einer Glasoberfläche ähnlich sind. Jeder Zeitpunkt repräsentiert drei separate Replikate, die jeweils aus 20-200 Amöbenspuren bestehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Möglichkeit, die Motilität von Amöben wie Akanthamöben zu verfolgen und zu quantifizieren, bei denen es sich um anhaftende mikroskopische Organismen handelt, die von der Brownschen Bewegung mit niedriger Geschwindigkeit nicht beeinflusst werden ^9,10, enthüllt eine beträchtliche Menge an Informationen über das Verhalten von Amöben und kann die Aufklärung über AK-Präventionsmethoden erheblich verbessern. Dieses Protokoll wurde in neueren Veröffentlichungen detailliert beschrieben, und die Daten wurden durch andere ähnliche Datenanalysen bestätigt oder mit ihnen kombiniert^18,19. Wir stellen hier fest, dass die Geschwindigkeit der Amöben, die mit dieser Methode detailliert wird, ähnlich ist wie die, die von anderen Gruppen veröffentlicht wurde. Dieses Protokoll zeichnet sich dadurch aus, dass es auf praktisch jeder Oberfläche oder Amöbenbehandlung verwendet werden kann, die lichttransparent ist, aber es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll zwar möglicherweise modifiziert werden könnte, um mit anderen Organismen zu funktionieren, aber bisher nur für Akanthamöben optimiert wurde. Das obige Protokoll hat im Labor durchweg gut funktioniert, aber die folgenden Änderungen sind vorgesehen, um die Methode an andere Anforderungen anzupassen oder schwierige Situationen zu beheben.

Bestimmung der Tracking-Parameter: Im obigen Protokoll wurden die Frame-to-Frame-Verknüpfung, das Lückenschließen, der maximale Frame-Abstand und die Anzahl der Spots auf der Spur aufgelistet, die für neuere Veröffentlichungen am besten geeignet waren. Es ist jedoch möglich, dass andere Parameter für andere Anforderungen besser geeignet sind. Darüber hinaus kann es Parameter geben, die andere gerne verwenden würden, die hier aber nicht verwendet wurden (z. B. die maximale Entfernung eines Tracks unter Track-Filtern). Weitere Informationen zu den einzelnen Parametern und deren Beschreibung finden Sie hier auf der Website (siehe Referenz²¹). Wenn Sie entscheiden, welche Parameter und Filter für andere Experimente am relevantesten sind und wie sie eingestellt werden sollten, denken Sie darüber nach, was für ein bestimmtes Projekt statistisch rational ist. Würde man zum Beispiel Daten von einer Amöbe wollen, die aus dem Sichtfeld verschwindet und dann wieder zurückkehrt? Oder würde man die Daten von einer Amöbe behalten wollen, die sich nicht sehr viel bewegt hat, aber dennoch als Spur markiert wurde? und was für die Anzahl der Frames und die Zeitspanne zwischen den Frames, als die Bilder aufgenommen wurden, sinnvoll ist.

Änderung der Blob-Größe: Wir haben festgestellt, dass es mit jeder Software oder jedem Mikroskop-Setup - basierend auf aktuellen Technologien und Software, die Standardlaboren zur Verfügung steht - extrem schwierig ist, die Anzahl der Amöben in einem Aggregat genau zu verfolgen, während sie sich im Laufe der Zeit ändert. Wenn Sie die Größe eines Blobs verfolgen und versuchen, diese Größe mit der Anzahl der darin enthaltenen Organismen zu korrelieren, verwenden Sie eine Standardkurve, die nach wiederholten Experimenten erstellt wurde, um die Größe eines Aggregats mathematisch vorherzusagen. Zum Beispiel wurden Aggregate durch Aussaat von Vertiefungen mit einer Reihe von Amöbenanzahl, wie 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 und 2.000 Zellen pro Vertiefung, erzeugt. Es wurden Zeitrafferbilder zu verschiedenen Zeitpunkten jeder Vertiefung für 24 Stunden erstellt. Jedes Sphäroid (das eine bekannte Anzahl von Amöben aufwies) wurde auf einen zweidimensionalen Bereich analysiert, und es wurde eine Standardkurve als Funktion der Amöbenzahl im Vergleich zur Sphäroidengröße im Laufe der Zeit erstellt. Dieses Experiment wurde mindestens in dreifacher Ausfertigung wiederholt, um eine angemessene Standardabweichung jeder erzeugten Kurve zu erhalten.

Bestimmung der Richtungsabhängigkeit der Amöbe: Während dies für bestimmte Studien möglicherweise nicht notwendig ist, kann es hilfreich sein, die Richtungsabhängigkeit der Amöbe zu verstehen. Dies würde Daten über die chemotaktischen Effekte der Behandlung oder des Experiments liefern. Diese Daten können auch verwendet werden, um sowohl visuelle (grafische) als auch quantitative Daten zu erstellen. Dies ist über das Chemotaxis and Migration Tool möglich, ein kostenloses Plug-in für Imaging-Software. Es ist auf der Website zusammen mit dem Anwendungsleitfaden sowie Beispielbildern und -filmen verfügbar (siehe Materialtabelle).

Detaillierte Bewegungsdynamik: Andere Gruppen haben die Ausbreitungsdynamik und die diffusiven Flugbahnen mit hochentwickelten statistischen Analysen untersucht und statistische Analysen entwickelt, die über das hinausgehen, was hier diskutiert wird ^9,10,22. Diese können je nach den Bedürfnissen des Nutzers in Betracht gezogen werden.

Wie bei jeder erfolgreichen Methode hat das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll viele Runden der Fehlerbehebung durchlaufen, um Konsistenz zu erreichen. Während hervorragende, qualitativ hochwertige, verfolgbare Videos erstellt werden können, indem jede Sekunde ein Bild aufgenommen wird (oder so schnell wie das Mikroskop dazu in der Lage ist, kann es weniger als eine Sekunde sein), entstehen dadurch extrem große Dateien, mit denen es schwierig sein kann, zu arbeiten. Dies ist realistischerweise nur für sehr kurzfristige Videos geeignet, die maximal wenige Minuten lang aufgenommen wurden. Umgekehrt haben wir durch die Aufnahme eines Bildes alle paar Sekunden festgestellt, dass das Verhalten von Amöben basierend auf der Geschwindigkeit dieser Spezies immer noch sehr gut verfolgbar ist, und es ist möglich, über Stunden oder Tage hinweg brauchbare Videos zu erstellen. Wir haben festgestellt, dass die maximale Zeitspanne zwischen den Bildern 30 s beträgt, was der Zeit entspricht, die Amöben benötigen, um von einer Bildgebungssoftware genau verfolgt zu werden. Das Zeitintervall, das der Benutzer wählt, sollte unter Berücksichtigung der bekannten Einschränkungen betrachtet werden, wie schnell das Mikroskop Bilder aufnehmen kann, wie viele Bilder pro Vertiefung benötigt werden und wie viele Vertiefungen in jedem Intervall aufgezeichnet werden. In ähnlicher Weise wurden die in diesem Protokoll erwähnten Parameter in Bezug auf die maximale Verschiebung, die zulässigen Frame-Lücken, die minimal benötigten Frames und so weiter durch Versuch und Irrtum von diesem Labor bestimmt, um Spurinformationen zu erstellen, die die vollständigsten Amöbenspuren einschließen, und Rauschen zu ignorieren, das durch unvollständige Spuren erzeugt wird, Amöben, die sich mitten im Video der Bühne verbinden oder diese verlassen, oder Fehler, die durch Verwirrung der Bildgebungssoftware verursacht werden, wie z. B. wenn zwei Amöben sich in der Mitte der Spur treffen und sich dann trennen. Diese Art von Fehlern und unvollständigen Spuren sind verständlicherweise hoch, wenn extrem lange (Stunden bis Tage) Videos von mikroskopisch kleinen biologischen Organismen erstellt werden, die ständig miteinander interagieren und der Grund dafür sind, dass ein sehr großer Teil fehlerhafter Spuren zurückgewiesen werden muss. Es sollte beachtet werden, dass der Schritt zum Füllen von Löchern im Protokoll nach der Erfahrung dieses Labors wichtig ist, um Fehler bei der Verfolgung von Amöben durch die Bildgebungssoftware zu reduzieren. Indem sichergestellt wird, dass jede Amöbe ein fester Kreis ist, anstatt manchmal ein Donut oder eine C-Form, ist es viel wahrscheinlicher, dass die Software in der Lage ist, jede Amöbe erfolgreich zu verfolgen.

Darüber hinaus stehen einem Benutzer, wie bereits erwähnt, viele Parameter zur Analyse eines Bildes oder Videos zur Verfügung. Basierend auf den experimentellen Anforderungen haben wir durchweg am meisten von der Analyse der Gesamtdistanz, der maximalen Entfernung, der Geschwindigkeit und der Verschiebung profitiert. Diese werden in früheren Publikationen (einschließlich der Verwendung verschiedener Dehnungen und Oberflächen) mit grafischen Interpretationen ausführlich diskutiert ^18,19. Diese vier Parameter ermöglichen es einem Benutzer, die Fähigkeit einer Amöbe, lineare Entfernungen zurückzulegen, und die Zeit, die sie dafür benötigt, zu extrapolieren, was zum Verständnis ihres Verhaltens in Bezug auf Kontaktlinsenkontamination beiträgt. Das Abrufen und Analysieren dieser Parameter ist eine große Aufgabe, wie unsere Zahlen zeigen. Bei der Arbeit mit großen und zahlreichen Tabellenkalkulationen aus der Ausgabe von Imaging-Software haben wir unbeabsichtigte Fehler begrenzt, indem wir gesperrte Tabellenkalkulationsvorlagen erstellt haben, die alle erforderlichen Analysen automatisch berechnet haben. Eine mögliche Verbesserung dieser Methode besteht jedoch darin, ein Skript zu schreiben, das diese Daten verarbeiten und sortieren und analysieren kann.

Zusammenfassend wird hier eine zugängliche und genaue Methode zur Messung der Größe und Beweglichkeit von Akanthamöben unter vielen verschiedenen Bedingungen beschrieben. Wir haben gezeigt, dass diese Methode auf viele verschiedene Amöbenstämme angewendet werden kann, und skizziert, dass es zwar einfache Parameter für die Gewinnung von Motilitätsinformationen geben kann, dieser Versuchsaufbau jedoch stark auf alle spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
¼ Klingelton" s Lösung	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers Lösung Tabletten. Befolgen Sie die Anweisungen, um Ringer mit einer Viertelstärke anstelle von Ringern mit voller Stärke herzustellen.
10 & Mikro; L Pipette	Eppendorf Research	3123000039	2 µ L-20 & Mikro; L Einkanal
10 & Mikro; L Pipettenspitzen	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µ L Universal Barrier Tip
48-Well-Platte	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar TC-behandelte Mehrfach-Well-Platte: Polystyrolplatte, Vertiefungen mit flachem Boden, steril, mit Deckel
50 mL konische Röhrchen (1 für jede Probe, 1 für jeden Durchgang 2 Proben)	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen mit hoher Klarheit,
96-Well-Platte	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Corning Costar TC-behandelte Multi-Well-Platte: Polystyrolplatte, Vertiefungen mit flachem Boden, steril, mit Deckel
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	Dieses Protokoll wurde für ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 und PRA-411
Axenische Nährmedien (AC6) verifiziert.			g Vitamin B12 und 1 Glas5 mg  L-Methionin pro Liter destilliertem deionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 6,6-6,95 ein und autoklavieren Sie bei 121 & Grad; C für 20 min, bei Raumtemperatur bis zu 3 Monate lagern.
Zentrifuge und geeigneter Rotor	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	Jede gleichwertige Zentrifuge und jeder gleichwertige Rotor sind akzeptabel, solange sie konische 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min drehen können
Chemotaxis und Migration Tool			Kostenlose Software auf Basis von ImageJ, verfügbar bei https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Einweg-Hämozytometer	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer Verbessertes 2-Chip-Einweg-Hämozytometer, einzeln verpackte, pyrogene
ImageJ-Software mit Trackmate-Plugin (dieses Protokoll wurde mit Trackmate Version 6.0.2 geschrieben.)			Freie Software, die von den National Institutes of Health entwickelt wurde und unter imagej.net verfügbar ist. Trackmate-Plugin verfügbar bei https://imagej.net/plugins/trackmate/
Mikroskop, vorzugsweise mit automatisiertem beweglichem Tisch	Nikon, Tokio, Japan		In dieser Studie wurde ein Nikon Eclipse Ti-U-Mikroskop verwendet, und der automatisierte bewegliche Tisch wurde verwendet, um Bilder in mehreren Vertiefungen gleichzeitig aufnehmen zu können.
NIS-Elements Software	Nikon
Serologische Pipette	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro Pipettensteuerung
Serologische Pipettenspitzen	VWR	5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	VWR Serologische Pipette, pyrogenfrei
Sterile Aluminium-Transmissions-Durchflusszelle	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	Einkanal-Transmissions-Durchflusszelle aus eloxiertem Aluminium mit 96-Well-Plattenfläche für die Verwendung mit einem inversen Mikroskop
T75 Kolben	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	VWR Gewebekulturflasche, 182,5 cm, oberflächenbehandelt, Steckerdichtung, steril