Anpassung an den Extremen des Lebens: Experimentelle Evolution mit dem extremophilen Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein experimentelles Evolutionsprotokoll zur Anpassung bei Thermophilen vor, bei dem kostengünstige, energieeffiziente Tisch-Thermomischer als Inkubatoren verwendet werden. Die Technik wird durch die Charakterisierung der Temperaturanpassung bei Sulfolobus acidocaldarius, einem Archaeon mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 75 °C, demonstriert.

Zusammenfassung

Das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius hat sich als vielversprechendes thermophiles Modellsystem herauskristallisiert. Die Untersuchung, wie sich Thermophile an wechselnde Temperaturen anpassen, ist eine wichtige Voraussetzung, nicht nur für das Verständnis grundlegender evolutionärer Prozesse, sondern auch für die Entwicklung von S. acidocaldarius als Chassis für das Bioengineering. Ein großes Hindernis für die Durchführung experimenteller Evolutionsprozesse mit Thermophilen sind die Kosten für die Wartung der Ausrüstung und den Energieverbrauch traditioneller Inkubatoren für das Hochtemperaturwachstum. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird ein umfassendes Versuchsprotokoll für die Durchführung der experimentellen Evolution in S. acidocaldarius vorgestellt, bei dem kostengünstige und energieeffiziente Tisch-Thermomischer zum Einsatz kommen. Das Protokoll beinhaltet eine Batch-Kulturtechnik mit relativ kleinen Volumina (1,5 ml), die die Verfolgung der Adaptation in mehreren unabhängigen Linien ermöglicht. Diese Methode ist durch den Einsatz von zusätzlichen Thermomischern leicht skalierbar. Ein solcher Ansatz erhöht die Zugänglichkeit von S. acidocaldarius als Modellsystem, indem er sowohl die Anfangsinvestitionen als auch die laufenden Kosten für experimentelle Untersuchungen reduziert. Darüber hinaus ist die Technik auf andere mikrobielle Systeme übertragbar, um die Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen zu erforschen.

Einleitung

Frühes Leben auf der Erde könnte in extremen Umgebungen entstanden sein, wie z. B. in hydrothermalen Quellen, die durch extrem hohe Temperaturen und Säuregehalt gekennzeichnet sind¹. Mikroben bewohnen nach wie vor extreme Umgebungen, darunter heiße Quellen und vulkanische Solfatara. Die Charakterisierung der evolutionären Dynamik, die unter diesen extremen Bedingungen abläuft, könnte Aufschluss über die spezialisierten physiologischen Prozesse geben, die das Überleben unter diesen Bedingungen ermöglichen. Dies kann weitreichende Auswirkungen haben, vom Verständnis der Ursprünge der biologischen Vielfalt bis hin zur Entwicklung neuartiger Hochtemperaturenzyme mit biotechnologischen Anwendungen.

Das Verständnis der mikrobiellen Evolutionsdynamik in extremen Umgebungen ist trotz seiner entscheidenden Bedeutung nach wie vor begrenzt. Im Gegensatz dazu wurde ein bedeutender Wissensschatz über die Evolution in mesophilen Umgebungen durch die Anwendung einer Technik erworben, die als experimentelle Evolution bekannt ist. Die experimentelle Evolution beinhaltet die Beobachtung evolutionärer Veränderungen unter Laborbedingungen 2,3,4,5. Oft handelt es sich dabei um eine definierte Veränderungsumgebung (z. B. Temperatur, Salzgehalt, Einführung eines Toxins oder eines konkurrierenden Organismus)^7,8,9. In Kombination mit der Sequenzierung des gesamten Genoms hat uns die experimentelle Evolution ermöglicht, Schlüsselaspekte evolutionärer Prozesse zu testen, einschließlich Parallelität, Wiederholbarkeit und der genomischen Basis für die Anpassung. Bisher wurde jedoch der Großteil der experimentellen Evolution mit mesophilen Mikroben durchgeführt (einschließlich Bakterien, Pilzen und Viren 2,3,4,5, aber weitgehend ohne Archaeen). Eine Methode zur experimentellen Evolution, die auf thermophile Mikroben anwendbar ist, würde es uns ermöglichen, besser zu verstehen, wie sie sich entwickeln, und zu einem umfassenderen Verständnis der Evolution beitragen. Dies hat potenziell weitreichende Auswirkungen, von der Entschlüsselung der Ursprünge des thermophilen Lebens auf der Erde bis hin zu biotechnologischen Anwendungen mit "Extremozyten", die in Hochtemperatur-Bioprozessen¹⁰ und astrobiologischer Forschung¹¹ eingesetzt werden.

Das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ist ein idealer Kandidat als Modellorganismus für die Entwicklung experimenteller Evolutionstechniken für Thermophile. S. acidocaldarius vermehrt sich aerob mit einer optimalen Wachstumstemperatur bei 75 °C (Bereich 55 °C bis 85 °C) und einem hohen Säuregehalt (pH 2-3)4,6,12,13,14. Bemerkenswert ist, dass S. acidocaldarius trotz seiner extremen Wachstumsbedingungen Populationsdichten und Mutationsraten beibehält, die mit denen von Mesophilen^{vergleichbar sind} 7,15,16,17,18. Darüber hinaus besitzt es ein relativ kleines, gut annotiertes Genom (Stamm DSM639: 2,2 Mb, 36,7 % GC, 2.347 Gene)¹²; S. acidocaldarius profitiert auch von robusten Genom-Engineering-Werkzeugen, die eine direkte Bewertung des Evolutionsprozesses durch gezielte Gen-Knockouts ermöglichen¹⁹. Ein bemerkenswertes Beispiel dafür ist die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen von S. acidocaldarius, wie z. B. die auxotrophen Uracil-Stämme von MW001¹⁹ und SK-1²⁰, die als selektierbare Marker dienen können.

Es gibt erhebliche Herausforderungen bei der Durchführung experimenteller Evolution mit Thermophilen wie S. acidocaldarius. Eine längere Inkubation bei hohen Temperaturen, die für diese Studien erforderlich ist, erfordert eine erhebliche Verdunstung sowohl für flüssige als auch für feste Kultivierungstechniken. Ein längerer Betrieb bei hohen Temperaturen kann auch die herkömmlichen Schüttelbrutschränke beschädigen, die üblicherweise in der experimentellen Evolution in flüssigen Medien verwendet werden. Die Erforschung mehrerer Temperaturen erfordert eine erhebliche finanzielle Investition für die Anschaffung und Wartung mehrerer Inkubatoren. Darüber hinaus wirft der hohe Energieverbrauch erhebliche ökologische und finanzielle Bedenken auf.

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um die Herausforderungen bei der Durchführung experimenteller Evolution mit Thermophilen wie S. acidocaldarius zu bewältigen. Aufbauend auf einer von Baes et al. entwickelten Technik zur Untersuchung der Hitzeschockreaktion^14,21 verwendet die hier entwickelte Methode Tisch-Thermomischer für eine konsistente und zuverlässige Hochtemperaturinkubation. Seine Skalierbarkeit ermöglicht die gleichzeitige Bewertung mehrerer Temperaturbehandlungen, wobei die Kosten für die Anschaffung zusätzlicher Inkubationsgeräte reduziert werden. Dies erhöht die experimentelle Effizienz und ermöglicht eine robuste statistische Analyse und eine umfassende Untersuchung von Faktoren, die die Evolutionsdynamik bei Thermophilen beeinflussen²². Darüber hinaus reduziert dieser Ansatz die finanzielle Anfangsinvestition und den Energieverbrauch im Vergleich zu herkömmlichen Inkubatoren erheblich und bietet eine nachhaltigere und umweltfreundlichere Alternative.

Unsere Methode legt den Grundstein für die experimentelle Untersuchung der Evolutionsdynamik in Umgebungen, die durch extreme Temperaturen gekennzeichnet sind und in den frühen Stadien der Diversifizierung des Lebens auf der Erde eine Schlüsselrolle gespielt haben könnten. Thermophile Organismen haben einzigartige Eigenschaften, aber ihre extremen Wachstumsbedingungen und speziellen Anforderungen haben ihre Zugänglichkeit als Modellsystem oft eingeschränkt. Die Überwindung dieser Barrieren erweitert nicht nur die Forschungsmöglichkeiten zur Untersuchung der Evolutionsdynamik, sondern erhöht auch den breiteren Nutzen von Thermophilen als Modellsysteme in der wissenschaftlichen Forschung.

Protokoll

1. Zubereitung von S. acidocaldarius Wachstumsmedium (BBM⁺)

HINWEIS: Für die Kultivierung von S. acidocaldarius wird in diesem Protokoll das Basal Brock Medium (BBM⁺)²³ verwendet. Dies wird hergestellt, indem zunächst die unten beschriebenen anorganischen Stammlösungen zu BBM⁻ kombiniert werden, das im Voraus hergestellt werden kann. Anschließend wird BBM⁺ nach Bedarf durch Zugabe der Bio-Stammlösungen zu BBM⁻ aufbereitet. Rezepturen für Stammlösungen sind ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Medien und Stammlösungen sollten in doppelt destilliertem H₂O (ddH₂O) hergestellt werden.

1. Aufbereitung von anorganischen Stammlösungen für Wachstumsmedium
   1. Spurenelement-Stammlösung herstellen.
      1. Die Spurenelement-Stammlösung wird durch Zugabe von 9 g/l Natriumtetraborat-Decahydrat (Na₂B₄O 7,10H₂O) zu ddH₂O und anschließender Zugabe von 1:1 H₂SO₄ tropfenweise hergestellt, bis es sich aufgelöst hat.
      2. Nacheinander werden 0,44 g/l Zinksulfat-Heptahydrat (ZnSO_{4,7H 2}O), 0,1 g/l Kupfer(II)-chlorid-Dihydrat (CuCl 2,2H₂O), 0,06 g/l Natriummolybdat-Dihydrat (Na₂MoO_{4,2H 2}O), 0,06 g/l Vanadium(IV)-sulfat-Dihydrat (VOSO_{4,2H 2}O), 0,02 g/l Kobalt(II)-sulfat-Heptahydrat (CoSO_{4,7H 2}O) eingeführt. und 3,6 g/l Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat (MnCl_{2,4H 2}O). Die Lösung autoklavieren und bei 4 °C lagern.
   2. Die Fe-Stammlösung (1000x) wird durch Auflösen von 20 g/l Eisenchlorid-Hexahydrat (FeCl 3,6H ₂O) in ddH₂O hergestellt. Die Lösung wird durch Filtrieren durch einen 0,22-μm-Filter sterilisiert und bei 4 °C gelagert.
   3. Brock-Lösung I (1000x) wird durch Auflösen von 70 g/L Calciumchlorid (CaCl_{2,2H 2}O) in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) hergestellt. Autoklavieren und bei 4 °C lagern.
      ACHTUNG: Das Lösen von CaCl_{2,2H 2}O in Wasser ist ein exothermer Prozess. Führen Sie diesen Schritt mit Vorsicht aus. Tragen Sie Handschuhe mit thermischer Gefahr, die nach EN407 eingestuft sind, um sich vor Verletzungen zu schützen. Verschließen Sie das Gefäß nicht fest, da sich sonst Druck aufbauen kann.
   4. Die Brock-Lösung II/III wird durch Mischen von 130 g/l Ammoniumsulfat ((NH₄)₂SO₄), 25 g/l Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO 4,7H₂O), 28 g/l Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) und 50 ml der zuvor hergestellten Spurenelement-Stammlösung hergestellt. Mit 1:1 H₂SO₄ den pH-Wert der Stammlösung auf 2-3 einstellen. Autoklavieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
2. Aufbereitung von Bio-Stammlösungen für Wachstumsmedium
   1. Bereiten Sie D-Glucose-Stammlösung (100x) vor, indem Sie 300 g/L (30 % w/v) D-Glucose in ddH₂O auflösen und mit dem Filter sterilisieren (durch einen 0,22-μm-Filter). Bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Anstelle von D-Glukose können je nach experimenteller Anforderung andere Kohlenstoffquellen verwendet werden (z. B. D-Xylose).
   2. Bereiten Sie Pepton aus Kasein-Stammlösung (100x) vor, indem Sie Pepton aus Kasein bei 100 g/L in ddH₂O auflösen. Autoklavieren Sie die Stammlösung zum Sterilisieren und Lagern bei RT.
   3. Uracil-Stammlösung (100x) herstellen, indem 2 g/L Uracil in ddH₂O gelöst und mit dem Filter sterilisiert werden (durch einen 0,22-μm-Filter); Bei -20 °C lagern.
3. Aufbereitung von BBM⁺ Wachstumsmedium bei 1x Arbeitskonzentration
   1. Zuerst werden 988 mL steriles ddH₂O durch Autoklavieren hergestellt.
   2. Bereiten Sie 1 l BBM⁻ vor, indem Sie 1 mL Brock-Stammlösung I, 10 mL Brock-Stammlösung II/III und 1 mL Fe-Stammlösung zu den 988 mL sterilem ddH₂O hinzufügen, die zuvor autoklaviert wurden. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit 1:1 H₂SO₄ auf den Bereich von 2-3 ein.
      HINWEIS: BBM⁻ kann im Voraus hergestellt und bis zu 1 Monat bei RT gelagert werden.
   3. Um schließlich 1 l BBM⁺ herzustellen, kombinieren Sie jeweils 10 ml D-Glukose-Stammlösung, Pepton aus Kasein-Stammlösung und Uracil-Stammlösung mit 985 ml BBM⁻. Gut mischen und den mittleren pH-Wert auf 2-3 mit 1:1 H₂SO₄ einstellen.
      HINWEIS: BBM⁺ sollte bei Bedarf frisch zubereitet werden.
4. Aufbereitung von BBM⁺ Festmedium
   1. Herstellung von 1 M Stammlösungen von MgCl₂ und CaCl₂; Diese helfen bei der Verfestigung des BBM-Feststoffmediums. Für 1 M MgCl₂ fügen Sie 9,5 g zu 100 mL ddH₂O hinzu. Für 1 M CaCl₂ 11 g zu 100 mL ddH₂O hinzufügen. Zum Sterilisieren im Autoklav.
      ACHTUNG: Das Lösen von CaCl_{2,2H 2}O in Wasser ist ein exothermer Prozess. Führen Sie diesen Schritt mit Vorsicht aus. Tragen Sie Handschuhe mit thermischer Gefahr, die nach EN407 eingestuft sind, um sich vor Verletzungen zu schützen. Verschließen Sie das Gefäß nicht fest, da sich sonst Druck aufbauen kann.
   2. Mischen Sie 3% (w/v) Gellangummi (z. B. 30 g/L) in ddH₂O und autoklavieren Sie es zur Sterilisation.
      HINWEIS: Als Geliermittel wird hier Gellangummi (z.B. Gelrit) verwendet, da sich herkömmlicher bakteriologischer Agar bei 75 °C nicht verfestigen kann.
   3. Separat wird BBM⁺ für festes Medium hergestellt, das im Verhältnis 1:1 mit dem in Schritt 1.4.1 hergestellten sterilen Gellangummi gemischt werden soll.
      1. Bereiten Sie zunächst 1 L BBM⁻ wie in Schritt 1.3.2 vor. Kombinieren Sie 887 ml BBM⁻ mit 1 ml Fe-Stammlösung und je 20 ml D-Glucose-Stammlösung, Pepton aus Kasein-Stammlösung und Uracil-Stammlösung.
      2. Fügen Sie 40 mL von 1 M MgCl₂ und 12 mL von 1 M CaCl₂ hinzu. Gut mischen und den mittleren pH-Wert auf 2-3 mit 1:1 H₂SO₄ einstellen.
         HINWEIS: Die hier zugegebenen Mengen an Stammlösungen sind absichtlich größer als bei der Zubereitung von flüssigem BBM⁺ in Schritt 1.3. Dies ist zu berücksichtigen, dass im folgenden Schritt im Verhältnis 1:1 mit geschmolzenem Gellangummi gemischt wird.
   4. BBM⁺ auf festes Medium auf ca. 75 °C vorheizen und im Verhältnis 1:1 mit geschmolzenem Gellangummi in ddH₂O mischen. Gut mischen und in hitzestabilen Kunststoff (z. B. Polypropylen), Glas-Petrischalen oder Sechs-Well-Platten für das Wachstum vonS. acidocaldarius gießen. Verwenden Sie den Agar sofort nach dem Mixen, da er schnell fest wird.
      HINWEIS: Einige 90-mm-Petrischalen aus Polystyrol, die üblicherweise für die Mikrobiologie verwendet werden, verformen sich, wenn sie über einen längeren Zeitraum bei hohen Temperaturen inkubiert werden.
      VORSICHT: Treffen Sie die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen, wenn Sie mit heißen Flüssigkeiten umgehen. Tragen Sie Handschuhe mit thermischer Gefahr, die nach EN407 eingestuft sind, um sich vor Verletzungen zu schützen.

2. Wiederbelebung von S. acidocaldarius aus einer Tiefkühl-Stammkultur

1. Vorbereitung von belüfteten Wachstumsröhren, um eine ausreichende Belüftung und Sauerstoffverfügbarkeit zu gewährleisten.
   1. Bereiten Sie im Voraus durchstochene 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für das Sulfolobus-Wachstum vor. Erhitzen Sie stumpfen Draht (>0,7 mm, z. B. eine gerade Büroklammer) vorsichtig mit einer Bunsenbrennerflamme und stechen Sie in den Deckel des Rohrs, so dass ein kleines Loch von ca. 1 mm entsteht.
   2. Legen Sie die durchstochenen Röhrchen in ein autoklavierbares Gefäß (z. B. leere Pipettenspitzenbox) und autoklavieren Sie sie zur Sterilisation.
      ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe mit thermischer Gefahr nach EN407, um sich vor thermischen Verletzungen der Hände durch erhitztes Metall zu schützen. Erhitzen Sie den Draht nur für kurze Zeit (1-2 s), um eine Überhitzung zu vermeiden. Es dürfen nur Metalle mit einer hohen Schmelztemperatur (Stahl) verwendet werden.
2. Starterkulturen von S. acidocaldarius impfen.
   1. Füllen Sie die autoklavierten, durchstochenen 2-ml-Röhrchen mit 1,5 mL vorgewärmtem BBM⁺ (wie in Abschnitt 1 vorbereitet, mindestens 15 Minuten lang bei 75 °C vorinkubiert).
   2. Beimpfen Sie die mit BBM⁺ gefüllten Röhrchen mit einem Schaben (entspricht 50 - 60 mg) aus einem Glycerinstamm (25 % v/v Glycerin, gelagert bei -80 °C). Hier wird S. acidocaldarius Stamm DSM639 verwendet. Füllen Sie ein zusätzliches Röhrchen mit 1,5 mL BBM+ als Negativkontrolle.
3. Um zu verhindern, dass Aerosole aus dem durchstochenen 2-ml-Röhrchendeckel austreten und die Wachstumsumgebung (und alle anderen Proben) kontaminieren, und um die Variabilität der Kulturverdunstung in den Röhrchen zu verringern, platzieren Sie eine gasdurchlässige Membran auf dem Deckel, die erhöhten Temperaturen (65-85 °C) standhält und das Austreten/Infiltrieren von Mikroorganismen blockiert.
   HINWEIS: Durch die Verwendung von gasdurchlässigen Membranen zur Abdichtung von Rohren wird die Verdunstung erheblich reduziert. Während eines Zeitraums von 48 Stunden bei 75 °C weisen versiegelte Röhrchen einen durchschnittlichen Volumenverlust von 8,63 % auf (Bereich: 3,29-16,45 %, n = 24 technische Wiederholungen, zweimal wiederholt), im Gegensatz zu 25,05 % (Bereich: 11,92-62,91 %, n = 24 technische Wiederholungen, zweimal wiederholt) bei nicht abgeschlossenen Röhrchen.
4. Die inokulierten Röhrchen werden in einem Thermomischer bei 75 °C unter ständigem Schütteln bei 400 Umdrehungen pro Minute (U/min) für 48-72 h inkubiert oder bis ein Außendurchmesser_{von 600 nm} von 0,3 - 0,8 erreicht ist, gemessen mit dem Spektralphotometer.
   HINWEIS: Der durchstochene Deckel der 2 ml-Röhrchen und das Schütteln ermöglichen eine angemessene Belüftung für ein optimales Wachstum. Der Deckel des Thermomixers sollte aufgesetzt sein, um eine konstante Temperatur zu gewährleisten und die Verdunstung zu reduzieren.
5. Geben Sie den wiederbelebten Kulturen nach der Inkubationszeit eine zweite Wachstumsphase (Präkonditionierung).
   1. Pelletieren Sie die Kulturen, indem Sie die Röhrchen bei 5000 x g für 2 min bei RT drehen. Entsorgen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem 1,5 mL warmem BBM⁺.
      HINWEIS: In diesem Experiment wird der S. acidocaldarius Wildtyp-Stamm DSM639 verwendet, aber diese Methoden des Wachstums und der experimentellen Evolution können auf jeden Sulfolobus-Stamm und möglicherweise andere Thermophile angewendet werden.

3. Bestimmung der Populationsdichte, der Verdopplungszeit und der exponentiellen Wachstumsphase für S. acidocaldarius

1. Bestimmen Sie die Populationsdichte und die Zeit bis zur exponentiellen Wachstumsphase für die ausgewählten Selektionsbedingungen. Für jede zu prüfende Umgebungsbedingung sind drei Starterkulturen gemäß den Schritten 2.1 bis 2.5 vorzubereiten.
2. Verdünnen Sie die drei Kulturen in BBM⁺ auf einen OD_{600 nm} von 0,01. Stellen Sie mindestens 20 ml aus jeder Kultur her. Diese drei Kulturen stellen technische Replikate dar.
3. Führen Sie Replikationswachstumskurven von OD_{600 nm} über die Zeit mit destruktiver Probenahme durch.
   1. Bereiten Sie 24 durchstochene 2-ml-Röhrchen aus Schritt 2.1 vor, teilen Sie sie in drei Achtersätze auf und beschriften Sie diese technischen Repliken mit 1, 2 und 3 (z. B. acht Röhrchen mit der Bezeichnung Replik 1 usw.).
   2. Von jeder der drei verdünnten Kulturen aus Schritt 3.2 werden 1,5 ml in sieben vorbereitete Röhrchen pipettiert. Füllen Sie das verbleibende Röhrchen mit 1,5 mL BBM+ als Negativkontrolle.
4. Inkubieren Sie alle 24 Röhrchen in einem Thermomischer bei 75 °C und 400 U/min. Abdichtung mit einer gasdurchlässigen Membran. Entfernen Sie in regelmäßigen Abständen (z. B. 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 h) eine Röhre aus jeder der drei Repliken und messen Sie OD_{600 nm} mit einem Spektralphotometer, dann entsorgen Sie die Röhre. Ersetzen Sie die gasdurchlässige Membran, nachdem Sie einen Schlauch entfernt haben.
5. Bestimmen Sie parallel dazu die Beziehung zwischen OD_600nm und der Populationsdichte. Führen Sie serielle Verdünnungen (1 x ^10-1 bis 1 x ^10-6) in BBM⁺ Medium für mindestens drei Zeitpunkte (idealerweise Start, Mitte und Ende) durch. 100 μl jeder Verdünnung werden auf festem BBM⁺ -Medium (hergestellt wie in Schritt 1.4) beimpft.
   HINWEIS: Um ein gleichmäßiges Koloniewachstum und genaue Zählungen zu erzielen, ist es am besten, die verdünnte Kultur an einer Stelle auf feste Medien zu pipettieren, ohne mechanisches Verteilen durchzuführen, z. B. mit einem L-förmigen Spreizer oder Glasperlen. Die mechanische Ausbreitung scheint sich negativ auf die Koloniebildung auszuwirken.
6. Inkubieren Sie die Platten in einem statischen Inkubator bei 75 °C, bis die Bienenvölker erscheinen (5-7 Tage).
   1. Halten Sie den Inkubator während dieser Zeit feucht, um ein übermäßiges Austrocknen der Platten zu vermeiden, da sich sonst keine Kolonien bilden.
   2. Legen Sie dazu die Platten in eine geschlossene Polypropylenbox, die mit einem feuchten Tuch ausgelegt ist. Stechen Sie den Deckel der Box mindestens dreimal durch, um die Belüftung zu ermöglichen.
   3. Stellen Sie Eimer mit Wasser in den Inkubator, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen. Füllen Sie die Eimer täglich auf.
7. Sobald alle OD_{600nm-Messungen} gesammelt wurden, bestimmen Sie die Verdopplungszeit und die Zeit bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase, indem Sie eine logistische Kurve an die Beziehung zwischen OD_600nm und Zeit anpassen, z. B. mit SummarizeGrowth aus dem growthcurver-Paket in R.
8. Sobald sich sichtbare Kolonien auf festen Medien gebildet haben, zählen Sie Koloniebildende Einheiten (KBEs), wobei Sie versuchen, vom Verdünnungsfaktor aus zu zählen, um 50-100 Kolonien für die beste Genauigkeit zu erhalten.
9. Berechnen Sie die Zelldichte im Kulturmedium mit der Formel: KBE/ml = Anzahl der Kolonien/(volumenplattiertes Volumen × Verdünnungsfaktor).
10. Führen Sie eine lineare Log-Log-Regression durch, um die Beziehung zwischen log10 (CFU) und log10 (OD_600nm) zu bestimmen. Berechnen Sie also die vorhergesagte KBE/ml für eine gegebene OD aus der Steigung und dem Schnittpunkt des Regressionsmodells: vorhergesagte KBE = 10^{[Steigung × log10(OD600nm) + Schnittpunkt]}.
11. (Fakultativ) Führen Sie außerdem die Schritte 3.1-3.10 in einem Schüttelbrutschrank durch, um festzustellen, ob in Thermomischern ein vergleichbares Wachstum erzielt wird.

4. Initiierung unabhängiger Linien für die experimentelle Evolution

1. Tag 1: Um einzelne Kolonien zu erzeugen, führen Sie zunächst alle Schritte von Abschnitt 2 oben durch, um eine Startkultur zu erzeugen.
2. Tag 3: Messen Sie OD_{600 nm} der Kultur, um sicherzustellen, dass sie in der Exponentialphase eine ausreichende Dichte erreicht hat (OD_{600 nm} 0,3-0,8 mit dem Spektralphotometer).
3. Erstellen Sie serielle Verdünnungen der S. acidocaldarius DSM639-Kultur von 1 x ^10-1-1 x ^10-6 und verteilen Sie 100 μl aus jeder 1 x ^10-5 und 1 x ^10-6 Verdünnung in Vertiefungen einer 6-Well-Platte, die festes BBM⁺ -Medium enthält (Abschnitt 1 und Tabelle 1) in mehreren Replikaten. Inkubieren Sie die Platten bei 75 °C in einem statischen Inkubator wie in Schritt 3.5 für 5-7 Tage, damit einzelne Völker auftauchen können.
4. Tag 8-10 (5-7 Tage nach der Inkubation):
   1. Ermitteln Sie die Anzahl der sich entwickelnden Abstammungslinien aus einzelnen Kolonien. Für jede Abstammungslinie wählst du mit einer Impfschlaufe eine zufällige Kolonie aus den Platten aus. Die Kolonie wird in einem durchstochenen 2-ml-Röhrchen mit 1,5 ml vorgewärmtem BBM⁺ -Medium resuspendiert. Beschriften Sie das Rohr entsprechend.
   2. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Abstammungslinien. hier wurden sieben Linien etabliert und mit SA1-7 bezeichnet. Füllen Sie ein zusätzliches Röhrchen mit 1,5 mL BBM+ als Negativkontrolle.
   3. Die Oberseiten der Röhrchen mit einer atmungsaktiven Membran verschließen und in einem Thermomischer bei 75 °C, 400 U/min für 48-72 h inkubieren, bis die Kulturen trüb werden (entspricht OD_{600 nm} 0,3-0,8 per Spektralphotometer).
5. Tag 10-12 (7-9 Tage nach der Impfung):
   1. Schleudern Sie die klonalen Kulturen in einer Tischzentrifuge bei 5.000 x g für 1 Minute bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 200 μl flüssigem BBM⁺.
   2. Mischen Sie die 200 μl Zellsuspensionen mit 200 μl 50 % Glycerin (25 % v/v Glycerin), um Glycerinbrühen der sieben unabhängigen Linien herzustellen und bei -80 °C zu lagern. Dies sind die Ahnenpopulationen für die Evolutionsexperimente.

5. Durchführung des Temperaturentwicklungsexperiments

HINWEIS: Ein konzeptionelles Diagramm, das die Hauptaspekte des Versuchsprotokolls umreißt, ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Verwenden Sie die sieben Ahnenpopulationen, die in Abschnitt 4 generiert wurden, für das Evolutionsexperiment.
   1. Alle experimentellen Evolutionsassays sind in sterilen, durchstochenen 2-ml-Röhrchen durchzuführen, die mit einer permeablen Membran verschlossen sind (siehe oben, Abschnitt 2).
   2. Neben diesen Populationen sind separate durchstochene 2-ml-Röhrchen mit 1,5 ml BBM⁺ als kulturfreie Negativkontrollen zu halten, um eine (Kreuz-)Kontamination zu überwachen und einen Schwellenwert für OD festzulegen, der kein Wachstum der Kultur anzeigt.
2. Einrichtung von Temperaturbehandlungen: Durch den Einsatz von Thermomischern können mehrere Temperaturbehandlungen durchgeführt werden. Verwenden Sie hier die folgenden Temperaturbehandlungen: konstant 75 °C, konstant 65 °C und allmählich von 75 auf 65 °C abfallend, indem Sie die Temperatur alle 4 Tage um 1 °C senken ("Temperaturabfallbehandlung").
   HINWEIS: Diese Behandlungen können auf spezifische experimentelle Anforderungen zugeschnitten werden. Für jede Temperierung ist ein separater Thermomischer erforderlich.
3. Tag 1: Wiederbeleben Sie die angestammten Populationen aus ihren Glycerinvorräten (vorbereitet in Schritt 4.5) gemäß den in Abschnitt 2 beschriebenen Schritten.
4. Tag 3:
   1. Verdünnen Sie diese Kulturen auf einen OD_{600 nm} von 0,01 (gemessen mit dem Spektralphotometer) auf ein Gesamtvolumen von mindestens 6 mL vorgewärmtem BBM⁺. Aliquotieren Sie 1,5 ml aus jeder der sieben verdünnten Populationskulturen der Vorfahren in drei separate durchstochene 2-ml-Röhrchen, eines für jede in Schritt 5.2 festgelegte Temperaturbehandlung.
      ANMERKUNG: Dieser Aliquotierungsschritt stellt sicher, dass jede genetische Variation, die in jeder Vorfahrenpopulation vorhanden ist, bei allen Temperaturbehandlungen zu Beginn des Evolutionsexperiments vorhanden ist. Diese Kulturen fungieren als Transfer 0 (Tx0), um das Experiment zur Temperaturentwicklung zu beginnen.
   2. Verschließen Sie die Röhrchen mit der atmungsaktiven Membran und geben Sie jeden Satz von sieben Vorfahren in separate Thermomischer. Stellen Sie jeden Thermomixer auf die erforderliche Temperatur und 400 U/min ein, um das Evolutionsexperiment zu starten.
5. Tag 5:
   1. Nach 48 h wird Transfer 1 (Tx1) durchgeführt, indem 1,5 mL erwärmtes BBM⁺ -Medium in ein durchstochenes 2-ml-Röhrchen mit 15 μl Kultur aus jeder der Tx0-Kulturen inokuliert wird (Verdünnung 1:100). Um die Geschwindigkeit zu erhöhen, führen Sie diesen Schritt mit einer Mehrkanalpipette mit variabler Breite durch, um mehrere Transfers aus einem einzigen Experiment gleichzeitig durchzuführen und so die Zeit zu verkürzen, in der die Kulturen den Thermomischer verlassen.
   2. Verschließen Sie die Röhrchen wie zuvor, bevor Sie sie wieder in zufällige Positionen in ihre jeweiligen Thermomischer einsetzen. Führen Sie die Randomisierung manuell oder über die iMetaLab 96 Well-Randomizer durch.
6. Messen Sie den OD_{600 nm} von Tx0 in einem plattenbasierten Spektralphotometer (200 μl in 96-Well-Platten; das gleiche Volumen BBM⁺ wird als Blindwert verwendet), um das Wachstum der unabhängigen Linien zu verfolgen.
   HINWEIS: Der OD_600nm sollte nach dem Transfer auf ein frisches Medium gemessen werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Die optische Dichte kann auch auf andere Weise gemessen werden, z. B. mit einem Standard-Spektralphotometer. Die Verwendung eines plattenbasierten Spektralphotometers ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Kulturen, wodurch der Prozess rationalisiert wird.
7. Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6 an den Tagen 7, 9, 11 usw., entsprechend Tx2, Tx3, Tx4 usw. Halten Sie die Temperatur für die Behandlungen 75 °C und 65 °C konstant. Für die Temperaturabfallbehandlung senken Sie die Temperatur bei jedem zweiten Transfer um 1 °C (d. h. auf Tx2, Tx4, Tx6 usw.).
8. Bereiten Sie die Glycerinvorräte (Schritt 3.2.3) der Populationen nach jedem 10^. Transfer (d. h. Tx10, Tx20 usw.) vor und markieren Sie das Röhrchen mit dem Identifikator der angestammten Population (z. B. SA1 für die 1^. unabhängige Population) und der Transfernummer (z. B. Tx10 für den 10^{. Transfer).} Verwenden Sie diese Glycerinvorräte später, um Populationen wiederzubeleben, um zu untersuchen, wie sich die Populationen im Laufe der Zeit verändert haben, oder um das Experiment bei Bedarf neu zu starten (z. B. aufgrund von Kontamination oder unerwarteten Ereignissen, die zum Verlust von Kulturen führen).
9. Lassen Sie das Experiment entweder für eine vorgegebene Anzahl von Übertragungen oder so lange fortgesetzt werden, bis eine vorgegebene Anzahl von Generationen abgelaufen ist. Bereiten Sie bei der endgültigen Übertragung Glycerinvorräte aller Nachkommen vor.
   HINWEIS: Hier wurde das Experiment fortgesetzt, bis die Temperaturabfallbehandlung 65 °C erreichte, was bei Tx22 der Fall war. Dies entspricht etwa 150 Generationen (berechnet auf Basis des Verdünnungsfaktors von 100 in 4,6: log₂(100) = 6,64 Generationen pro Transfer). Die Länge der Evolutionsexperimente kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden.

6. Wachstumsassays nach der Evolution: Vorfahren vs. entwickelte Abstammungslinien

HINWEIS: Ein konzeptionelles Diagramm, das das Wachstums-/Fitness-Assay-Protokoll skizziert, ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Bereiten Sie durchstochene 2-ml-Röhrchen mit 1,5 mL BBM⁺ vor. Bereiten Sie genügend Röhren vor, um alle Nachkommen und jeden der angestammten Stämme wachsen zu lassen.
2. Wiederbelebung der angestammten Populationen und jeder in Schritt 5.9 gelagerten Nachkommenpopulation nach dem abschließenden Transfer des Evolutionsexperiments unter Verwendung der in den Schritten 2.2 bis 2.5 beschriebenen Methode, jedoch mit Inkubation bei der Temperatur, die jede Population bei den letzten beiden Transfers des Evolutionsexperiments erfahren hat, d. h. 75 °C für die Behandlung mit einer konstanten 75 °C und 65 °C für die Experimente mit einer 65 °C-Konstante und einem Temperaturabfall. Um vergleichbare Populationsdichten zu erreichen, führen Sie die 75 °C-Inkubation für 72 Stunden und die 65 °C-Inkubation für 120 Stunden durch.
3. Messen Sie OD_{600 nm} der gezüchteten Kulturen mit einem plattenbasierten Spektralphotometer.
4. Durchführung von Wachstumsassays jeder Nachkommenpopulation und jedes Stammes bei beiden Temperaturen (d. h. 75 °C und 65 °C) in drei Replikaten. Bereiten Sie durchstochene 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 mL BBM⁺ vor. Bereiten Sie sechs Röhrchen für jede entwickelte Abstammungslinie und jeden Stamm vor. Beschriften Sie die Röhren mit dem Namen der Abstammung (SA1-7 oder Vorfahre), der Wachstumstemperatur (75 °C oder 65 °C) und der Replikations-ID (1, 2 oder 3).
   HINWEIS: Wenn weniger als sechs Thermomischer verfügbar sind, kann der Wachstumsassay über mehrere Tage in mehreren Versuchsblöcken repliziert werden. In diesem Fall ist es wichtig, jede Abstammungslinie und jeden Vorfahren in jedem Versuchsblock zu messen, damit Blockeffekte geschätzt und statistisch berücksichtigt werden können.
5. Beimpfen Sie das frische Medium in den sechs vorbereiteten Röhrchen mit 15 μl Kultur aus jeder Nachkommenlinie und jedem Stamm.
6. Stellen Sie drei Thermomischer auf 75 °C und drei Thermomischer auf 65 °C ein, wobei Sie jedem Thermomischer eine Replikations-ID zuweisen. Legen Sie die Röhrchen entsprechend der Temperatur und der Replikations-ID in den Thermomischer. Stellen Sie sicher, dass die Abstammungslinien und Vorfahren in jedem Thermomischer nach dem Zufallsprinzip platziert werden, um die Heterogenität zu kontrollieren.
7. Verschließen Sie jeden Satz von 24 Röhrchen mit einer durchlässigen Membran. 48 Stunden inkubieren.
8. Übertragen Sie 200 μl aus jeder Kultur in eine 96-Well-Platte. Messen Sie OD_{600 nm} mit einem Spektralphotometer.
   HINWEIS: Eine Mehrkanalpipette mit variabler Breite kann verwendet werden, um den Transfer zwischen Mikrozentrifugenröhrchen und 96-Well-Platten zu erleichtern.
9. Plotten und analysieren Sie Daten mit statistischer Software (z. B. R).

7. Sequenzierung des gesamten Genoms evolutionärer Abstammungslinien und Identifizierung von Mutationen

1. Die in Schritt 5.9 gespeicherten Nachkommen werden in vorgewärmtem BBM⁺ bei 75 °C von 48-72 h wiederbelebt, indem ein Eiskratzer von jeder gefrorenen Population in BBM⁺ inokuliert wird, wie in Abschnitt 2, Schritte 2.2-2.5. Bereiten Sie zwischen 1 und 10 ml Kulturvolumen vor, um eine ausreichende Menge an genomischer DNA zu erhalten. Das genaue benötigte Volumen hängt von der Option ab, die in den Schritten 7.2 oder 7.3 (unten) für die Sequenzierung gewählt wurde.
   HINWEIS: Es empfiehlt sich, auch den Stamm zu sequenzieren, der zur Initiierung der Ahnenpopulationen verwendet wurde. Damit soll korrekt festgestellt werden, ob Mutationen, die in den Nachkommen entdeckt wurden, während des Evolutionsexperiments entstanden sind und nicht vorher.
2. (Möglichkeit 1) Extrahieren Sie genomische DNA und bereiten Sie Illumina-Sequenzierungsbibliotheken für die Illumina-Sequenzierung vor.
   1. Extrahieren und reinigen Sie genomische DNA mit einem kommerziellen genomischen DNA-Extraktionskit für Bakterien.
   2. Stellen Sie sicher, dass die extrahierte genomische DNA die Quantitäts- und Qualitätsanforderungen des Sequenzierungsanbieters erfüllt, indem Sie vom Anbieter empfohlene kommerzielle Kits verwenden.
   3. Führen Sie die Vorbereitung der genomischen DNA-Bibliothek mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Es wird ein Paired-End-Protokoll mit 250 bp empfohlen. Lagern Sie die extrahierte genomische DNA bei -20 °C, bis die Proben an den Sequenzierer gesendet werden können.
3. (Möglichkeit 2) Alternativ können Sie die Proben an einen kommerziellen Anbieter senden, der DNA-Extraktion, genomische DNA-Qualitätsprüfungen, die Vorbereitung der Illumina-Bibliothek und die Illumina-Sequenzierung als kombinierten Service durchführt.
4. Analysieren Sie sequenzierte Genome, um Mutationen zu identifizieren.
   1. Empfangen Sie FASTQ-Dateien und, falls nicht bereits vom Sequencing-Provider durchgeführt, führen Sie das Adaptertrimmen mit Trimmomatic mit einem gleitenden Qualitätsgrenzwert von Q15 durch.
   2. Führen Sie mit den getrimmten FASTQ-Dateien die breseq-Pipeline (Version 0.38.1) aus, um Mutationen zu erkennen, und vergleichen Sie die genomischen DNA-Lesevorgänge mit der Referenzsequenz für den ausgewählten Stamm. Für S. acidocaldarius DSM639 ist dies die RefSeq ID NC_007181.

8. (Optional) Bewertung des Energieverbrauchs von Thermomischer vs. Inkubator

1. Um den Energieverbrauch eines Inkubators mit einem Thermomixer für das Wachstum zu vergleichen, messen Sie den Energieverbrauch jedes Geräts über 24 Stunden mit einem Energieüberwachungsstecker.
2. Verwenden Sie zwei Stecker, um den Energieverbrauch beider Geräte gleichzeitig zu messen. Alternativ können Sie den Energieverbrauch an aufeinanderfolgenden Tagen messen.
3. Trennen Sie den Inkubator oder Thermomixer von der Steckdose. Stecken Sie den Energiemonitoring-Stecker in die Steckdose und initialisieren Sie ihn gemäß den Anweisungen des Herstellers, einschließlich der Installation der Überwachungs- und Steuerungssoftware.
4. Stecken Sie den Inkubator oder Thermomixer in den Stecker der Energieüberwachung und lassen Sie ihn mindestens 2 Stunden (idealerweise aber 24 Stunden oder länger) laufen, um eine gute Schätzung des typischen Energieverbrauchs zu erreichen. Erfassen Sie den Energieverbrauch jedes Geräts.

Ergebnisse

Messungen der Wachstumskurve
Die Wachstumskurven für S. acidocaldarius DSM639 sind in Abbildung 3A dargestellt. Beim Vergleich der Inkubation mit Thermomischern mit dem in herkömmlichen Inkubatoren zeigte sich ein ähnliches Wachstum. Die Parameter der durchschnittlichen Wachstumsrate wurden geschätzt, indem eine logistische Kurve an jede replizierte Wachstumskurve angepasst und der mittlere und der Standardfehler berechnet wurden. Die Zeiten bis zur mittleren exponentiellen Phase auf dem Thermomischer und dem Inkubator betrugen 27,2 h ± 1,1 h bzw. 31,1 h ± 1,9 h. Die geschätzten anfänglichen Verdopplungszeiten für den Thermomischer und den Inkubator bei 75 °C betrugen 4,29 h ± 0,28 h bzw. 4,19 h ± 0,44 h, was mit den zuvor veröffentlichten Werten^{übereinstimmt 24}. Die Beziehung zwischen log₁₀ (OD_600nm) und log₁₀ (CFU) wurde durch ein lineares Modell gut charakterisiert (adjustiert R² = 0,82, F(1,22) = 104, p < 0,00001, Steigung = 1,73 ± 0,17, Achsenabschnitt = 9,73 ± 0,14). Das Verhältnis zwischen OD_600nm und KBE ergibt sich somit aus der Formel KBE = 10^{(1,73 × log10(OD600nm) + 9,73)}. Ein OD_600nm von 0,3 entspricht somit etwa 6,7 × 10⁸ KBE/ml (Abbildung 3B).

Experiment zur Temperaturentwicklung
Drei Temperaturbedingungen, konstant 75 °C, konstant 65 °C und Temperaturabfall (75-65 °C, alle zwei Transfers um 1 °C abnehmend), wurden unter Verwendung von sieben unabhängigen Linien initiiert, die von S. acidocaldarius DSM639 abgeleitet sind. OD_{600nm-Messungen} wurden nach jedem Transfer über die 45 Tage des Experiments (ca. 150 Generationen bei 75 °C) durchgeführt und sind in Abbildung 4 dargestellt. OD_{600-nm-Messungen} , die über Tage hinweg durchgeführt werden, sind von Natur aus verrauscht, da sie subtilen Unterschieden unterworfen sein können, z. B. in Bezug auf die Wachstumsperiode, die Temperatur usw. Messungen über Tage hinweg können jedoch immer noch nützlich sein, um die Lebensfähigkeit der Population zu beurteilen und einen Hinweis darauf zu geben, ob sich die Fitness im Laufe der Zeit verbessert. Die Abstammungslinien von der konstanten 75 °C-Bedingung stiegen in OD_{600 nm} von einem anfänglichen Bereich von 0,125-0,3 auf einen Bereich von 0,248-0,471 bis zum Ende des Experiments. Dies deutet darauf hin, dass sich die Fitness durch diese Behandlung verbessert hat. Im Gegensatz dazu zeigten Abstammungslinien aus der konstanten 65 °C-Behandlung einen Abfall des OD_{600 nm}, von einem anfänglichen Bereich von 0,018-0,087 auf 0,008-0,04 zum endgültigen Zeitpunkt. Dies deutet darauf hin, dass die Populationen nicht in der Lage waren, sich an die konstante Temperatur von 65 °C anzupassen, obwohl die Tatsache, dass lebensfähige Organismen wiederhergestellt werden konnten, zeigt, dass die Populationen nicht durch sukzessive Verdünnungen ausgewaschen wurden, was auf ein gewisses Maß an Anpassung hindeutet. Schließlich stiegen die Populationen in der Temperaturabfallbehandlung von dem anfänglichen OD-Bereich von_{600 nm} von 0,099 bis 0,279 auf 0,3 bis 0,39 bei Tx6 (entsprechend 288 h und 73 °C bei dieser Behandlung), gefolgt von einer stetigen Abnahme auf einen Bereich von 0,003 bis 0,024 zum endgültigen Zeitpunkt.

Wachstums-/Fitness-Assays
Fitness-Assays wurden für jede Nachkommenpopulation nach den Evolutionsexperimenten durchgeführt. OD_{600 nm} wurde nach 48 Stunden Wachstum für alle sieben unabhängigen Linien untersucht, gefolgt von der Anpassung linearer Modelle in R für jede Assay-Temperatur, mit "Selektionsumgebung" als Haupteffekt und "Replikat/Thermomixer" als Blockeffekt. Das Wachstum des Stammes wurde als Referenzniveau für die Behandlungskontraste verwendet. Die Daten sind in Abbildung 5 dargestellt.

Bei einer Untersuchung bei 75 °C gab es im Durchschnitt signifikante Steigerungen der Fitness gegenüber dem angestammten Stamm für Abstammungslinien aus den Behandlungen mit konstanten 75 °C (t-Test: t₂₁₀=3,64, p=0,0003) und konstanten 65 °C (t-Test: t₂₁₀=2,8, p=0,005), jedoch nicht durch die Behandlung mit Temperaturabfall (t-Test: t₂₁₀=-0,87, p=0,38). Bei einer Untersuchung bei 65 °C zeigten die Abstammungslinien aller Behandlungen im Durchschnitt eine Steigerung der Fitness (konstante 75 °C-Abstammungslinien; t-Test: t₂₁₀=4,68, p<0,0001, konstante 65 °C-Linien; t-Test: T₂₁₀, = 4,24, S<0,0001, Temperaturabfall-Linien; t-Test: T₂₁₀=3,15, p=0,002). Bei beiden Assay-Temperaturen gab es jedoch erhebliche Unterschiede zwischen den Abstammungslinien in ihrer Fitness (Abbildung 5). Einige Abstammungslinien unterschieden sich nicht wesentlich von den Vorfahren oder hatten an Fitness abgenommen; Dies zeigte sich besonders deutlich bei Abstammungslinien aus der Temperaturabfallbehandlung.

Es ist erwähnenswert, dass sich die Beziehung zwischen OD_600nm und KBE/ml während des Evolutionsexperiments geändert haben könnte. Dies kann durch die Bestimmung von Wachstumsparametern für evolutionäre Abstammungslinien beurteilt werden (nach den Schritten 3.1-3.10).

Ergebnisse der Gesamtgenomsequenzierung
Die Gesamtgenomanalyse wurde mit breseq (Version 0.38.1)²⁵ an den sieben Linien aus der konstanten 75 °C-Bedingung unter Verwendung des Referenzgenoms von S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq-Beitritt NC_007181.1) durchgeführt. Es wurde eine Vielzahl von Mutationen entdeckt, die Insertionen, Deletionen und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) in den Genomen aller Nachkommen betreffen (Tabelle 2). Mehrfache Insertion und nicht-synonyme Mutationen fanden in proteinkodierenden Genen sowie in intergenen Regionen statt, die die Genexpression aufgrund von Frameshifts in den Promotorregionen der Gene beeinflussen können. Einige der Mutationen waren über mehrere Nachkommen hinweg konsistent in Genen, die an verschiedenen Funktionen wie Zellwandbiosynthese, Transkription, Stoffwechsel, zellulärem Transport und katalytischer Aktivität beteiligt sind (Tabelle 2). Zu diesen Mutationen gehörte eine große Deletion von 54.667 Basenpaaren in fünf der sieben Linien; Dies wurde durch ein Diagramm mit fehlender Abdeckung für jede Population bestätigt (Häufigkeit zwischen 93,2 % und 100 %). Die deletierte Region entspricht einem Verlust von 53 Genen; Die Rolle dieser Gene bei der Anpassung wird in zukünftigen Studien untersucht. Es wurden einige Unterschiede zwischen dem verwendeten Isolat von DSM639 und der veröffentlichten Referenzsequenz festgestellt (siehe ergänzende Tabelle 1).

Energieverbrauch des Schüttelinkubators im Vergleich zum Thermomixer
Der Energieverbrauch eines Schüttelinkubators wurde mit dem eines Thermomischers verglichen, der einen kommerziell erhältlichen intelligenten Stecker für die Energieüberwachung über einen Bereich gängiger Inkubationstemperaturen und die hier verwendete Temperatur von 75 °C verwendet. Bei 75 °C verbrauchte der Thermomischer etwa 1/40^{der Energie} eines herkömmlichen Schüttelinkubators (Abbildung 6), was auf Thermomischer als potenzielles Mittel zur Reduzierung des mit der experimentellen Evolution verbundenen CO2-Fußabdrucks hindeutet.

Abbildung 1: Flussdiagramm, das das Evolutionsexperimentprotokoll über drei Temperaturbehandlungen hinweg veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Flussdiagramm, das die Schritte des Wachstums-/Fitness-Assay-Protokolls veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bestimmung der wichtigsten Wachstumsparameter und Vergleich der Inkubationsgeräte für S. acidocaldarius DSM639. Drei Replikatkulturen wurden bei 75 °C in 7 separaten Röhrchen gezüchtet. Destruktive Probenahme wurde verwendet, um (A) OD_600nm zu messen (bedeutet ± Standardfehler von n=3 technischen Replikaten; einige Fehlerbalken sind kleiner als Plotsymbole); Die Kurven stellen angepasste logistische Wachstumsmodelle und (B) koloniebildende Einheiten (KBE) dar; Die Linien stellen angepasste lineare Logarithmus-Regressionsmodelle dar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse für optische Dichten (OD_600nm), die in Evolutionsexperimenten erzielt wurden. Optische Dichten unabhängiger Linien, gemessen während der Evolutionsexperimente unter drei Temperaturbehandlungen (konstant 65 °C, konstant 75 °C, Abfall 75 °C-65 °C), die über etwa 150 Generationen durchgeführt wurden. Kurven zeigen die Glättung von Lös im Zeitverlauf für jede unabhängige Linie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für Wachstumsassays. Wachstumsassays für unabhängige Abstammungslinien, die von S. acidocaldarius DSM639 abgeleitet wurden, nach Temperaturentwicklungsexperimenten (konstant 65 °C, konstant 75 °C, Abfall 75 °C-65 °C) im Vergleich zum Stamm der Vorfahren. Für alle Abstammungslinien wurde das Wachstum bei 65 °C und 75 °C untersucht. Farbige Punkte zeigen den mittleren ± Standardfehler technischer Replikate (grau dargestellt, n = 12 für den Vorfahren und n = 3 für jede entwickelte Linie). Der graue Balken zeigt den mittleren ± Standardfehler der Ahnenfitness an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Energieverbrauch von herkömmlichen Inkubatoren im Vergleich zu Thermomixern. Der Energieverbrauch wurde mit einem handelsüblichen Smart-Plug für das Energiemonitoring über 2 h gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Medienrezepturen und Stammlösungen, die für die Züchtung von S. acidocaldarius erforderlich sind. Alle Medien und Stammlösungen sollten mit doppelt destilliertem H₂O (ddH₂O) hergestellt und dann entweder durch Autoklavieren oder Filtersterilisation durch einen 0,22-μm-Filter sterilisiert werden, wie angegeben. In Abschnitt 1 des Protokolls finden Sie eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung aller Medien und Stofflösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Repräsentative Ergebnisse für die Gesamtgenomsequenzierung von Nachkommenlinien . Mutationen, die in Nachkommen von S. acidocaldarius DSM639 gefunden wurden, die bei einer konstanten 75 °C-Behandlung durchgeführt wurden. Die Mutationen deuten auf Veränderungen relativ zum direkten Vorfahren der Linie hin, der mehrere Veränderungen relativ zur Referenzsequenz für S. acidocaldarius DSM639 aufweist (RefSeq NC_007181; Mutationen im Vorfahren sind in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt). n gibt die Anzahl der Abstammungslinien an, in denen eine Mutation gefunden wurde. → Gen auf dem "Forward Reading Frame"; ← Gen auf dem "Reverse Reading Frame". †Diese Änderungen sind relativ zu einer (A)10→11-Frameshift, die im Isolat von S. acidocaldarius DSM639 vorhanden ist (Ergänzende Tabelle 1). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Mutationen im Isolat von S. acidocaldarius DSM639 im Vergleich zur Referenzsequenz (RefSeq-Beitritt NC_007181.1). → Gen auf dem "Forward Reading Frame"; ← Gen auf dem "Reverse Reading Frame". ‡SACI_RS04020 ist in NC_007181.1 als Pseudogen annotiert, aber die hier beobachtete Δ1 bp-Frameshift-Mutation stellt vermutlich ihre Funktion wieder her, da sie mit der Mutation ein Protein mit 100%iger Identität zum rgy-reversen Gyrase-Gen kodiert (RefSeq-Beitritt WP_176586667.1). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Arbeit wurde ein experimentelles Evolutionsprotokoll für Thermophile entwickelt, das hier auf das Archaeon S. acidocaldarius zugeschnitten ist, aber an andere Mikroben mit hohen Anforderungen an das Wachstum angepasst werden kann. Dieses Protokoll baut auf Techniken auf, die ursprünglich für mesophile Bakterien entwickelt wurden, wurde jedoch speziell modifiziert, um die technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit dem aeroben Wachstum bei hohen Temperaturen zu bewältigen 2,4,5,24. Die Entwicklung dieser Methode wird die Erforschung bisher uncharakterisierter evolutionärer Dynamiken ermöglichen, die unter extremen Temperaturbedingungen stattfinden, die den Bedingungen ähneln, die möglicherweise in den frühesten Stadien der Evolution des Lebens existierten¹.

Es gibt mehrere kritische Aspekte des Protokolls, die beachtet werden müssen, um zuverlässige Ergebnisse aus Evolutionsexperimenten zu erzielen. Die erste ist die Unabhängigkeit zwischen den Abstammungslinien, die erreicht wird, indem man sich vor Beginn des Experiments auf einzelne Kolonien konzentriert. Dies ist zwingend erforderlich, um sicherzustellen, dass alle gemeinsamen Mutationen, die in verschiedenen Abstammungslinien gefunden werden, unabhängigen Ursprungs sind. Wenn stattdessen eine flüssige Bulk-Kultur aliquotiert wird, um die Abstammungslinien zu initiieren, können gemeinsame genetische Varianten auf jede Population verteilt werden. Ein zweiter wichtiger Aspekt ist die Kontrolle auf Kontamination, die durch die Aufrechterhaltung einer kulturfreien Negativkontrolle und die Überwachung des Wachstums erreicht wird. Im Gegensatz zu Experimenten mit Mesophilen ist es unwahrscheinlich, dass extremophile Evolutionsexperimente von externen Quellen kontaminiert werden, aber es kann immer noch zu Kreuzkontaminationen zwischen den Linien kommen. Die Aufrechterhaltung eines Gleichgewichts zwischen Belüftung und Verdunstung ist ein weiterer wichtiger Aspekt. S. acidocaldarius ist ein obligater Aerobe und benötigt daher Sauerstoff für das Wachstum^10,23. Das manuelle Durchstechen von Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen und das Verschließen mit einer gasdurchlässigen Membran^21,25 war der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Belüftung ohne übermäßige Verdunstung. Diese Verringerung ist wahrscheinlich auf die Beibehaltung einer einheitlichen Umgebung innerhalb der versiegelten Röhrchen zurückzuführen (Daten nicht gezeigt).

Zwei Aspekte der Methode können eine Anpassung oder Fehlerbehebung entsprechend den spezifischen Umgebungsbedingungen erfordern, die für das Evolutionsexperiment verwendet wurden: der Verdünnungsfaktor und die Zeit zwischen den Transfers. Bei dieser Methode wurde bei jedem Transfer eine Verdünnung von 1:100 durchgeführt, was einen Durchschnitt von log₂(100) = 6,64 Verdopplungen erforderte, um zur gleichen Populationsgröße zurückzukehren. Dies bietet ein gutes Gleichgewicht zwischen dem Anpassungspotenzial (ein optimaler Verdünnungsfaktor wird von Wahl und Gerrish²⁶ berechnet) und der experimentellen Beherrschbarkeit. Im Prinzip würde ein starker Verdünnungsfaktor das Auftreten von mehr Generationen pro Tag ermöglichen, da mehr Verdopplungen erforderlich sind, um zur gleichen Populationsdichte zurückzukehren (z. B. erfordert 1:1000 log₂(1000) = durchschnittlich 9,97 Verdoppelungen). Wenn jedoch weniger Verdopplungen erreicht werden, als zwischen den Transfers erforderlich sind, werden die Populationen allmählich durch Verdünnung ausgewaschen, es sei denn, es tritt eine vorteilhafte Mutation auf, die die Verdopplungszeit verkürzt. Bei Populationen, die alle 48 h umgesiedelt werden, ist es erforderlich, dass die Verdopplungszeiten weniger als 8 h betragen, was mit der geschätzten Verdopplungszeit und den zuvor veröffentlichten Werten für das heterotrophe Wachstum bei S. acidocaldarius bei 75 °C (4-6 h) ^{übereinstimmt23,27}. Die allmähliche Abnahme des OD_{600 nm} im Laufe der Zeit für die konstanten 65 °C und Temperaturabfallbehandlungen deutet jedoch darauf hin, dass dies möglicherweise nicht lange genug ist, um die erforderliche Anzahl von Verdopplungen zu erreichen, und dass eine längere Transferperiode von Vorteil wäre.

Es werden mehrere wichtige Vorteile der Verwendung von Thermomischern gegenüber herkömmlichen Schüttelinkubatoren für die experimentelle Evolution festgestellt, insbesondere bei der Untersuchung der Anpassung an die Temperatur. Thermomischer stellen eine kostengünstige Alternative zu Schüttelbrutschränken dar, mit dem zusätzlichen Vorteil eines reduzierten Platzbedarfs. Diese Eigenschaften ermöglichen die effiziente Beurteilung mehrerer paralleler Temperaturbehandlungen. Thermomischer weisen auch einen geringeren Energieverbrauch auf als Schüttelinkubatoren, so dass ihr Einsatz möglicherweise die Umweltbelastung verringern kann, wenn eine bescheidene Anzahl von Röhrchen inkubiert wird (z. B. weniger als 100). Diese Diskrepanz im Energieverbrauch ist besonders deutlich bei Temperaturen, die für Thermophile relevant sind, gilt aber auch für ein Spektrum gemäßigterer Temperaturbereiche (Abbildung 6), was bedeutet, dass Thermomischer auch zur Verringerung der Umweltauswirkungen der experimentellen Evolution von Mesophilen eingesetzt werden könnten. Zusammengenommen deuten diese Attribute darauf hin, dass der Einsatz von Thermomischern in der experimentellen Evolution das Potenzial hat, die Zugänglichkeit dieser Forschungsmethode zu verbessern, insbesondere in ressourcenbeschränkten Umgebungen, wie z. B. Laboratorien in Entwicklungsländern und in der Primar- und Sekundarschulbildung.

Obwohl die derzeitige Methode einen Weg für die thermophile experimentelle Evolution bietet, weist sie einige Einschränkungen im Vergleich zur mesophilen experimentellen Evolution auf. Erstens ist die Anzahl der replikatunabhängigen Linien, die mit Hilfe von Thermomischern etabliert werden können, im Vergleich zu Hochdurchsatzmethoden mit Mikrotiterplatten, die bei Mesophilen weit verbreitet sind, gering⁴. Die Verdunstung bei hohen Temperaturen schließt derzeit die Verwendung von Mikrotiterplatten über das Zeitfenster aus, das erforderlich ist, um ein exponentielles Wachstum zu erreichen. Zweitens ist die Schätzung wichtiger Parameter der Wachstumskurve wie Wachstumsrate, Verdopplungszeit und Verzögerungszeit eine Herausforderung, da plattenbasierte Spektralphotometer, die bei hohen Temperaturen (>45 °C) betrieben werden können, derzeit nicht zum Kauf angeboten werden. Mit der hier skizzierten Methode erfordert die Charakterisierung der Wachstumskurve derzeit eine arbeitsintensive destruktive Probenahme und schränkt daher den Durchsatz ein. Schließlich sind Hochdurchsatztechniken zur Beurteilung der Wettbewerbsfähigkeit angepasster Isolate für Thermophile noch nicht vollständig entwickelt. Insbesondere die Entwicklung eines thermostabilen fluoreszierenden Proteins, das zur Unterscheidung zwischen Stämmen verwendet werden kann, würde Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie-basierte Fitness-Assays ermöglichen^28,29; Jüngste Entwicklungen von thermostabilen fluoreszierenden Proteinen mit unterschiedlichen Spektren machen dies zu einer potenziellen zukünftigen Entwicklung 30,31,32. Die Steigerung des Durchsatzes ist ein logischer nächster Schritt für die Weiterentwicklung experimenteller Evolutionstechniken für Thermophile, da sie es ermöglichen wird, evolutionäre Prozesse vollständiger zu beschreiben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm m Membranfilter mit Spritzenantrieb	StarLab	E4780-1226	Für die Filtersterilisation von Medienkomponenten, die nicht autoklaviert werden können.
1 μ L Impfschleifen	Greiner	731161, 731165 oder 731101	Zum Beimpfen von Kulturen. Es können auch andere Schlaufen verwendet werden.
1000 μ L Pipettenspitzen	StarLab	S1111-6811	Es können auch andere Pipettenspitzen verwendet werden.
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	StarLab	S1620-2700	Zur Kultivierung von S. acidocaldarius in Thermomischern.
200 μ L Pipettenspitzen	StarLab	S1111-0816	Es können auch andere Pipettenspitzen verwendet werden.
50 mL Polystyrolröhrchen mit konischem Boden	Corning	430828 oder 430829	Es können auch andere Röhrchen verwendet werden. Überprüfen Sie die Leistung bei 75 °C. Rohre mit Verschlusskappen ermöglichen möglicherweise keine ausreichende Belüftung; Vor Gebrauch prüfen.
50 mL Spritze	BD Plastipak	300865	Zur Verwendung mit spritzenbetriebenen Filtern.
96-Well-Mikrotiterplatten (unbehandelt, flacher Boden)	Nunc	260860	Zur Messung des Außendurchmessers bei 600 nm im Spektralphotometer.
Mehrkanalpipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS mit einstellbarer	Optional, spart aber Zeit beim Transfer zwischen Mikrozentrifuge und 96-Well-Platten.
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	Für Brock-Stammlösung I.
Autoklav	Priorclave	B60-SMART oder SV100-BASE	Es können auch andere Autoklaven verwendet werden.
Breathe-EASY gasdurchlässige Dichtungsbahn	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Zuschnitt für den Einsatz auf durchstochenen Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn Sie andere gasdurchlässige Memrbane ersetzen, stellen Sie sicher, dass die Leistung bei 75 μg angemessen ist. C
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Für Brock-Stammlösung I.
CELLSTAR Sechs-Well-Platten (suspensionsbezogen/unbehandelt)	Greiner	M9062	Sechs-Well-Platten anderer Hersteller können wahrscheinlich substituiert werden. Überprüfen Sie die Leistung bei hohen Temperaturen.
Kobalt(II)-sulfat-Heptahydrat (CoSO4· 7H2O)	Supelco	1025560100	Für Spurenelement-Stammlösung.
Kupfer(II)-chlorid-Dihydrat (CuCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	Für Spurenelement-Stammlösung.
Wasserfreie D-(+)-Glukose (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Andere Pentose- und Hexosezucker können ebenfalls verwendet werden (z. B. D-Xylose, D-Arabinose). Glukose ist keine bevorzugte Kohlenstoffquelle für S. acidocaldarius (SV Albers, persönliche Mitteilung)
Doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)
Gelrit	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrit (Gellangummi) wird aufgrund seines höheren Schmelzpunkts anstelle von Agar zur Herstellung fester Medien verwendet.
100 mm Petrischalen aus Glas	Marke	BR455742	Petrischalen aus Glas werden verwendet, da sich die meisten Standard-Petrischalen aus Polystyrol 90 mm bei 75 & Grad verformen; C (markenabhängig). Alternativ können auch Sechs-Well-Platten verwendet werden, da sich diese bei hohen Temperaturen nicht verformen.
Brutkasten	New Brunswick	Innnova 42R	Es können auch andere Brutschränke verwendet werden. Überprüfen Sie vor dem Kauf/Gebrauch die Betriebstemperatur der Geräte, da viele Inkubatoren keine Temperaturen von mehr als 65 °C aushalten können.
Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat (FeCl3· 6H2O)	Supelco	103943	für Fe-Stammlösung
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (Bittersalz) (MgSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	Für Brock-Stammlösung I.
Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat (MnCl2· 4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	Für Spurenelement-Stammlösung.
Mini Smart Wi-Fi Steckdose, Energieüberwachung	Tapo	Tapo P110	Zur Überwachung des Energieverbrauchs
N-Z-Amin A - Enzymatisches Hydrolysat aus Kasein	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amin-A wird als Quelle für Aminosäuren verwendet.
Büroklammer (oder anderer stabiler Draht)	keine	keine	Zum Durchstechen von 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
Kaliumdihydrogenphosphat (Monokaliumphosphat) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Für Brock-Stammlösung I.
Promega Wizard Aufreinigungskit für genomische DNA	Promega	A1120	Optional, um genomische DNA im Labor zu extrahieren
Natriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	Für Spurenelement-Stammlösung.
Natriumtetraborat-Decahydrat (Borax) (Na2B4O7· 10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	Für Spurenelement-Stammlösung.
Spektralphotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	Zur Messung des Außendurchmessers bei 600 nm. Es können auch andere Spektralphotometer verwendet werden, die den Außendurchmesser bei 600 nm ablesen können.
Schwefelsäure (im Verhältnis 1:1 mit Wasser verdünnt) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Wird verwendet, um den pH-Wert der Brock-Stammlösung II/III auf einen endgültigen pH-Wert von 2&2/3 einzustellen.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Andere Thermomischer können ebenfalls verwendet werden. Entscheidend ist die Fähigkeit, 65– 75 °C; C Temperaturen und 400 U/min
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Die Deletion von PyrE ist ein häufiger genetischer Marker, der in S. acidocaldarius verwendet wird. Deletionsstämme müssen für das Wachstum mit Uracil ergänzt werden. Eine Supplementierung ist für den Wildtyp-Stamm DSM639 nicht unbedingt erforderlich, wird aber hier berücksichtigt, da zukünftige Experimente Deletionsstämme beinhalten könnten.
Vanadylsulfat-Dihydrat (VOSO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	Für Spurenelement-Stammlösung.
Zinksulfat-Heptahydrat (ZnSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	Für Spurenelement-Stammlösung.