Abschätzung der strukturellen Empfindlichkeit von intrinsisch ungeordneten Regionen als Reaktion auf hyperosmotischen Stress in lebenden Zellen mit FRET

Summary

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind flexible Proteindomänen, die ihre Konformation als Reaktion auf Umweltveränderungen verändern. Der Ensemble-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) kann Proteindimensionen unter verschiedenen Bedingungen abschätzen. Wir präsentieren einen FRET-Ansatz zur Bewertung der strukturellen IDR-Sensitivität in lebenden Saccharomyces cerevisiae-Zellen unter hyperosmotischem Stress.

Abstract

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind Proteindomänen, die an entscheidenden zellulären Prozessen beteiligt sind. Unter Stressbedingungen ändern sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der zellulären Umgebung, was sich direkt auf das Konformationsensemble der IDRs auswirkt. IDRs reagieren von Natur aus empfindlich auf Umweltstörungen. Die Untersuchung, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Zelle das Konformationsensemble von IDRs regulieren, ist für das Verständnis der Umweltkontrolle ihrer Funktion unerlässlich. Hier beschreiben wir eine schrittweise Methode zur Messung der strukturellen Sensitivität von IDRs in lebenden Saccharomyces cerevisiae-Zellen als Reaktion auf hyperosmotische Stressbedingungen. Wir stellen die Verwendung des Ensemble-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) vor, um abzuschätzen, wie sich die globalen Dimensionen von IDRs während eines fortschreitenden Anstiegs des hyperosmotischen Stresses ändern, der Zellen mit einem beliebigen Osmolyten auferlegt wird. Darüber hinaus stellen wir ein Skript zur Verarbeitung von Fluoreszenzmessungen und zum Vergleich der strukturellen Empfindlichkeit für verschiedene IDRs zur Verfügung. Durch diese Methode können Forscher wertvolle Einblicke in die Konformationsänderungen gewinnen, die IDRs im komplexen intrazellulären Milieu bei wechselnden Umgebungen erfahren.

Introduction

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind kritische Komponenten in zellulären Prozessen¹. In Kombination mit strukturierten Domänen sind IDRs essentiell für Proteinfunktionen. Die Aminosäurezusammensetzung von IDRs ist verzerrt und wird hauptsächlich durch geladene, hydrophile und kleine Reste dargestellt. Aufgrund dieser Eigenschaft werden IDRs als Domänen mit geringer Komplexität betrachtet ^2,3. Zahlreiche IDRs haben Aufmerksamkeit erregt, vor allem, weil diese Regionen eine entscheidende Rolle bei pathologischen Zuständen spielen, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Krankheiten sind durch Selbstorganisation und anschließende extrazelluläre oder intrazelluläre Ablagerung von IDRs in Neuronen gekennzeichnet⁴. Beispiele für solche IDRs sind Amyloid-β (Aβ) bei der Alzheimer-Krankheit, Huntingtin (HTT) bei der Huntington-Krankheit und das TAR-DNA-bindende Protein-43 (TDP-43) und fusioniert im Sarkom (FUS) bei amyotropher Lateralsklerose und frontotemporaler Demenz⁴. Die Untersuchung der strukturellen Umlagerungen von IDRs im Zusammenhang mit Krankheiten wurde durch spektroskopische Methoden, einschließlich des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET), erheblich verbessert.

Die hydrophile und erweiterte Natur von IDRs macht sie extrem empfindlich gegenüber Änderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lösungsumgebung⁵. Der Grad, in dem das Konformationsensemble von IDRs durch die Umwelt modifiziert wird, wird als strukturelle Sensitivität bezeichnet ^5,6,7. Zur Untersuchung der Konformation und Dynamik von IDRs können verschiedene Techniken verwendet werden, darunter Zirkulardichroismus (CD) und Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS)^8,9. Leider benötigen CD und SAXS große Mengen an gereinigten Proteinen, so dass sie für Studien in Zellen nicht geeignet sind. Im Gegensatz dazu ist FRET eine Technik, die die Fluoreszenzintensität von zwei fluoreszierenden Molekülen misst, die spezifisch eine IDR markieren, was bedeutet, dass sie in komplexen Gemischen wie lebenden Zellen überwacht werden können¹⁰. Die dynamische Messung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs in lebenden Zellen ist notwendig, um zu verstehen, wie die Umgebung die Konformation und Funktion des ungeordneten Proteoms reguliert.

FRET ist eine leistungsstarke Methode zur Quantifizierung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs sowie von globulären und Multidomänenproteinen in lebenden Zellen. Die Methode erfordert ein Konstrukt, das aus einem IDR von Interesse besteht, der zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen (FP) eingebettet ist, einem sogenannten FRET-Paar. Für dieses Protokoll empfehlen wir die Verwendung von mCerulean3 als Spender-FP und Citrin als Akzeptor-FP aufgrund ihres großen Dynamikbereichs im Vergleich zu anderen FPs, die in einer früheren Studie über die Sensitivität von IDRs berichtet wurden⁶. FRET wurde zuvor genutzt, um die strukturelle Empfindlichkeit einer pflanzlichen IDR in verschiedenen zellulären Kontexten zu messen⁶. Darüber hinaus wurde diese Technik verwendet, um die Gesamtproteindimensionen von IDRs von verschiedenen Forschungsgruppen sowohl in vitro als auch in vivo zu charakterisieren ^5,11.

Hier beschreiben wir die Ensemble-FRET-Methode zur Untersuchung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs in lebenden Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae). Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf einer Pflanzen-IDR namens AtLEA4-5 basieren. AtLEA4-5 ist in Lösung ungeordnet, faltet sich aber zu α-Helix, wenn in vitro makromolekulares Crowding induziert wird ¹². AtLEA4-5 ist ein gutes Referenzmodell für diese Methode, da es relativ klein (158 Rückstände), ungeordnet und empfindlich gegenüber Umweltstörungen ist, wie in silico und in vitro berichtet ^6,12. Die hier vorgestellte Methode kann für Hochdurchsatzansätze skaliert werden, da Hefezellen leicht zu züchten sind und die Behandlung in kleinen Volumina angewendet wird. Darüber hinaus können kleine Modifikationen des Protokolls auf andere zelluläre Systeme wie Bakterien und Pflanzenzellen angewendet werden⁶. Das Protokoll kann in jedem molekularbiologischen Labor durchgeführt werden, das Zugang zu einem Mikroplatten-Reader mit Fluoreszenzmodus hat, ein Gerät, das in den meisten Forschungseinrichtungen verfügbar ist.

Protocol

1. Plasmid-Konstrukt

1. Amplifizieren Sie den offenen Leserahmen (ORF), der für die gewünschte IDR kodiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Schließen Sie das Stoppcodon nicht ein, da der ORF von den Genen flankiert wird, die für die fluoreszierenden Proteine kodieren. Für die Amplifikation werden Primer mit den Restriktionsstellen SacI (5') und BglII (3') entworfen.
   HINWEIS: Für den Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" haben wir AtLEA4-5 als ausgewählten IDR verwendet. Wir haben den ORF von AtLEA4-5 aus dem pTrc99A-AtLEA4-5-Plasmid¹² amplifiziert.
2. Das ORF-PCR-Produkt wird durch konsekutive Restriktion mit den Enzymen SacI und BglII¹³ verdaut.
3. Beziehen Sie das kommerzielle Plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) von Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
4. Führen Sie eine aufeinanderfolgende Restriktion unter Verwendung von Sac-I-und Bgl-II-Enzymen durch, um das AtLEA4-5-ORF aus dem pDRFLIP38-AtLEA4-5-Plasmid zu entfernen, wobei ein offenes Plasmid verbleibt, das das FRET-Paar¹³ enthält.
5. Die verdauten DNA-Fragmente werden durch Gelrückgewinnung aus einer Agarose-Gelelektrophorese¹⁴ gereinigt. Ligate die eingeschränkten Fragmente mit der DNA-Ligase¹⁵.
6. Die Klonierungsreaktion wird in kompetente Escherichia coli-Zellen (DH5α oder verwandte Stämme) umgewandelt und in Luria-Bertani (LB)-Platten mit 50 μg/ml Ampicillin¹⁶ selektiert. Über Nacht (ON) bei 37 °C anbauen.
7. Isolieren und züchten Sie mindestens fünf transformierte Kolonien in einer neuen Platte und einem neuen Genotyp durch PCR¹⁷. Aufreinigung der Plasmid-DNA aus einer positiv transformierten Kolonie mit Standard-Miniprep-Methoden¹⁸.
8. Überprüfen Sie die Extraktion und Integrität der Plasmid-DNA mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese¹⁹. Überprüfen Sie die korrekte Klonierung des Konstrukts mit der Sanger-Sequenzierung²⁰.

2. Plasmidexpression in Hefezellen

HINWEIS: Verwenden Sie aseptische Standardtechniken, um die folgenden Schritte auszuführen. Verwenden Sie eine Kultur-Laminar-Flow-Haube oder ein Feuerzeug.

1. Beimpfen Sie einen Streifen S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) in 3 ml Hefe-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) und wachsen Sie bei 30 °C und 200 U/min weiter.
   HINWEIS: BJ5465 ist ein Protease-defizienter (CH1) Stamm, der für die Arbeit mit IDRs empfohlen wird. Andere S. cerevisiae-Stämme können getestet und verwendet werden.
2. Zentrifugieren Sie 1 ml der über Nacht gesättigten (OD₆₀₀ ~ 3-4) Hefekultur bei 14.000 x g für 1 Minute. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
3. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH 7,5), indem Sie das Röhrchen vorsichtig schnippen. Bei 14.000 x g 1 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Lazy Bones-Puffer (40 % w/v PEG 3.350; 100 mM Lithiumacetat; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) durch Pipettieren. 25 μl gekochte (100 °C für 5 Minuten, gefolgt von 5 Minuten Abkühlen auf Eis) Lachsspermien-DNA (2 mg/ml) zu den resuspendierten Hefezellen geben.
5. Fügen Sie der Mischung 100 ng der Plasmid-DNA hinzu und wirbeln Sie die Mischung 1 Minute lang ein, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten. Lassen Sie die Mischung 1-2 h bei Raumtemperatur stehen.
6. Die Hefemischung bei 42 °C 12 min hitzeschocken, dann weitere 12 min auf Eis abkühlen lassen. Das Röhrchen wird 1 Minute lang bei 14 000 x g zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml TE-Puffer (pH 7,5). Platte 100 μl der transformierten Zellen auf Hefe-Synthetik-Dropout-Medium ohne Uracil (SD-ura) Platten ergänzt mit 15 g/L Agar.
8. Inkubieren Sie die Platten 2-3 Tage lang bei 30 °C (Abbildung 1). Streifen Sie mindestens fünf Hefe-Transformanten in einen neuen Teller und wachsen Sie weiter.

3. Validierung von Hefe-Transformanten

1. Wählen Sie einen kleinen Teil jedes Transformantenkandidaten aus, indem Sie 5 μl 20 mM NaOH vorsichtig abkratzen und in einzelne PCR-Röhrchen resuspendieren.
2. Die Probe wird 10 Minuten lang in einem Thermocycler auf 99 °C erhitzt, um die Zellen zu lysieren und die DNA in die Lösung freizusetzen. Dieser Schritt ist entscheidend für die Vorbereitung des DNA-Templates für die PCR.
3. 1 μl der gekochten Probe wird in ein separates PCR-Reaktionsgemisch überführt, das die entsprechenden Primer und PCR-Reagenzien für die Genotypisierung enthält. Wir haben die folgenden Primer verwendet: Forward Primer: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Umgekehrte Grundierung: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
4. Richten Sie eine PCR-Reaktion ein und validieren Sie das Vorhandensein des richtigen Plasmids mithilfe der Agarose-Gelelektrophorese. Wählen Sie einen Transformanten für weitere Experimente aus.

4. Vorbereitung der Hefezellkultur für den FRET-Assay

1. Beimpfen Sie einen Streifen des ausgewählten Hefetransformanten in 3 ml flüssiges 1x SD-Ura-Medium.
   Anmerkungen: Führen Sie diesen Vorgang in einer Laminar-Flow-Haube und sterilem Material durch.
2. Wachsen Sie bei 30 °C, 200 U/min für mindestens 12 Stunden, um die Sättigung zu erreichen. Messen Sie den OD₆₀₀. Das Wachstum sollte zwischen OD₆₀₀ = 1,0-2,0 liegen.
   HINWEIS: Wenn OD₆₀₀ niedriger als 1,0 ist, geben Sie den Zellen mehr Inkubationszeit zum Wachsen. Wenn OD₆₀₀ 2.0 überschreitet, fahren Sie nicht fort und starten Sie mit Schritt 4.1 neu.

5. Hefezellvorbereitung für FRET-Assay

1. Sammeln Sie 2 ml der Nachthefekultur und zentrifugieren Sie sie bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
2. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 50 mM 2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES)-Puffer (pH 6).
3. Bei Raumtemperatur bei 14.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
4. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3. Hefezellen in 2 ml MES-Puffer, pH 6, resuspendieren und das Volumen in ein Reagenzreservoir gießen.

6. Einrichten der Fluoreszenzmessungen

HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass der vorliegende Scan in einem Mikroplatten-Reader mit Fluoreszenzmodus durchgeführt wird.

1. Stellen Sie das Gerät für die Grundeinstellungen wie folgt ein: Messtyp: Fluoreszenzintensitätsspektrum (FI); Name der Mikroplatte: Greiner 96 F-Boden.
2. Stellen Sie das Gerät für die Optikeinstellungen wie folgt ein: Nein. Anzahl der Wellenlängen-Scanpunkte: 91; Anregungswellenlänge: 433 nm; Anregungsbandbreite: 10 nm; Emissionswellenlänge: 460 - 550; Schrittweite: 1 nm; Emissionsbandbreite: 10 nm; Brennhöhe durch Autofokus; Brennhöhe: 5 mm; Für die Verstärkung verwendete Wellenlänge: 490 nm.
3. Stellen Sie das Gerät für allgemeine Einstellungen wie folgt ein: Einschwingzeit: 0,1 s; Leserichtung: unidirektional, horizontal von links nach rechts, von oben nach unten.
   HINWEIS: Die manuell eingegebene Verstärkung muss für jede Messung mit dem Well angepasst werden, von dem erwartet wird, dass es die höchsten Fluoreszenzintensitätsstufen während des gesamten Wellenlängenscans anzeigt.

7. Herstellung hypertonischer Lösungen und Fluoreszenzmessungen

1. Bereiten Sie Lösungen von 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M und 2 M NaCl in einer 96-Well-Schwarzplatte mit klarem Boden vor. Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung beträgt 200 μl (150 μl Osmolytlösung + 50 μl Hefezellsuspension).
   HINWEIS: Andere Osmolyte können verwendet werden, um hyperosmotischen Stress zu induzieren. Alle Lösungen müssen in 50 mM MES-Puffer pH 6 hergestellt werden.
2. Laden Sie 150 μl 50 mM MES-Puffer, pH 6 in die ersten drei Vertiefungen der Reihe A (A1, A2, A3) und fügen Sie in den nachfolgenden Vertiefungen 150 μl der entsprechenden Lösung in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts hinzu (Abbildung 2). Um alle vorgeschlagenen Konzentrationen zu prüfen, wird die Beladung in Reihe B fortgesetzt.
   HINWEIS: Diese Einstellung berücksichtigt die Messungen von 3 technischen Replikaten für jede Konzentration.
3. Verwenden Sie eine 12-Kanal-Mikropipette, um 50 μl gewaschene Hefezellen in jede Vertiefung zu übertragen. Hefezellen neigen dazu, sich auf dem Boden des Reservoirs zu sedimentieren. Stellen Sie sicher, dass Sie die Hefesuspension gründlich resuspendieren, indem Sie auf und ab pipettieren, bevor Sie die Zellen übertragen.
4. Wägen Sie die Zellen in die 96-Well-Platte mit den verschiedenen Lösungen und mischen Sie sie gut, indem Sie mindestens 4x auf und ab pipettieren.
5. Messen Sie die Emissionsspektren der Fluoreszenzintensität sofort für die gewünschten Wells in einem Mikroplatten-Reader mit den Spezifikationseinstellungen von Schritt 6. Wiederholen Sie das Verfahren für jede IDR, die im FRET-Assay getestet werden soll.
6. Optionaler Schritt. Falls verfügbar, messen Sie ein reines Spenderkonstrukt (pDRFLIP38-mCerulean3) gemäß den hier beschriebenen Schritten.
   HINWEIS: Wir empfehlen, diesen Schritt durchzuführen, um die FRET-Effizienz jeder Bedingung zu berechnen. Wenn das Lesegerät diesen Schritt nicht ausführen kann, kann FRET mit der FRET-Verhältnis-Methode berechnet werden. Beide Methoden für FRET-Berechnungen werden in den Schritten 8 und 9 erläutert.
7. Führen Sie für jedes Konstrukt mindestens drei Replikationen an drei unabhängigen Tagen durch.

8. Datenverarbeitung mit der FRET-Effizienzmethode

HINWEIS: Für Leser mit Kenntnissen der Programmiersprache R stellen wir eine Reihe von R-Skripts zur Verfügung, um die in diesem Abschnitt beschriebene Datenverarbeitung durchzuführen. Skripte finden Sie unter https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Befolgen Sie die Anweisungen in der README-Datei.

1. Exportieren Sie Daten als .xlsx Dateien aus dem Mikroplatten-Reader.
2. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensitätswerte bei jeder Scanwellenlänge auf den isosbestischen Punkt des verwendeten FRET-Paares.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um die Spektren aller getesteten Bedingungen zu vergleichen. Der isosbestische Punkt des mCerulean3- und Citrin-FRET-Paares beträgt 515 nm. Ermitteln Sie beispielsweise das Verhältnis der Fluoreszenzintensitätswerte von 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm usw.
3. Berechnen Sie den Mittelwert für jedes technische Replikat, sobald die Fluoreszenzwerte normalisiert sind. Insgesamt sollte es für jeden Zustand von hyperosmotischem Stress eine Säule geben.
4. Visualisieren Sie alle Fluoreszenzintensitätsspektren im selben Diagramm (Abbildung 3). Jedes Spektrum sollte eine Kombination der Fluoreszenzemissionsspektren einzelner mCerulean3 und Citrin aufweisen. In seltenen Fällen, in denen der FRET-Wirkungsgrad 0 beträgt, wird nur das Donorfluoreszenzemissionsspektrum beobachtet, oder wenn der FRET-Wirkungsgrad 1 beträgt, wird nur die Akzeptorfluoreszenz beobachtet. Der Fluoreszenzemissionspeak für mCerulean3 (Donor) beträgt 475 nm und der Fluoreszenzemissionspeak für Citrin (Akzeptor) 525 nm.
5. Stellen Sie fest, ob die Fluoreszenzmessung eine typische FRET-Änderung als Reaktion auf hyperosmotischen Stress zeigt. Wenn die Konformation des IDR empfindlich auf die Behandlung reagiert, spiegelt sich dies als Änderung der FRET-Effizienz wider. Eine typische Änderung der FRET-Effizienz koppelt eine Abnahme der Fluoreszenzintensität des Donors mit einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des Akzeptors oder umgekehrt.
6. Quantifizieren Sie die FRET-Effizienz (E_FRET). Erhalten Sie die normalisierten Spender-Peakwerte (475 nm/515 nm) für das IDR-Konstrukt und das Nur-Donor-Konstrukt für jeden Zustand hyperosmotischer Belastung. Verwenden Sie die mittleren normalisierten Spitzenwerte der technischen Replikate. Führen Sie diesen Vorgang für jedes der drei unabhängigen Replikate aus. Berechnen Sie E_FRET mit der folgenden Formel:
   
   Dabei ist_{I DA} das Verhältnis 475 nm/515 nm aus dem IDR-Konstrukt (FRET-Paar-Konstrukt) und I_D das Verhältnis 475 nm/515 nm aus dem Nur-Donor-Konstrukt.
7. Vergleichen Sie die FRET-Wirkungsgrade. Normalisieren Sie die_E-FRET-Werte jeder hyperosmotischen Spannungsbedingung auf die_E-FRET-Werte der Nicht-Stressbedingung (z. B. 0 M NaCl). Vergleiche mit einem Boxplot oder einem Diagramm mit glatten Kurven. Führen Sie eine einfache ANOVA gefolgt von einem statistischen Post-hoc-Tukey-Test durch (p-Werte: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

9. Datenverarbeitung nach der FRET-Ratio-Methode

HINWEIS: Wenn keine reinen Spendermessungen erfasst werden können, führen Sie die FRET-Verhältnis-Methode durch. Diese Methode vergleicht das FRET-Verhältnis über die verschiedenen hyperosmotischen Stressbedingungen. Die Schritte 7.1 bis 7.5 sollten vor den Schritten dieses Abschnitts ausgeführt werden, um ein typisches FRET-Verhalten zu validieren. Für Leser mit Kenntnissen der Programmiersprache R stellen wir eine Reihe von R-Skripts zur Verfügung, um die in diesem Abschnitt beschriebene Datenverarbeitung durchzuführen. Skripte finden Sie unter https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Befolgen Sie die Anweisungen in der README-Datei.

1. Extrahieren Sie Daten bei 475 nm und 525 nm aus der xlsx-Datei, die zuvor vom Mikroplatten-Reader exportiert wurde. Diese Werte entsprechen der Fluoreszenzemissionsspitze für mCerulean3 (Donor, DxDm) und der Fluoreszenzemissionsspitze für Citrin (Akzeptor, DxAm) bei Anregung des Donorfluorophors (433 nm).
2. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensitätswerte bei 475 nm und 525 nm auf den isosbestischen Punkt des verwendeten FRET-Paares. Der isosbestische Punkt des mCerulean3- und Citrin-FRET-Paares beträgt 515 nm. Erhalten Sie das FRET-Verhältnis (DxAm/DxDm).
3. Vergleichen Sie FRET-Verhältnisse. Normalisieren Sie die DxAm/DxDm-Werte jeder hyperosmotischen Stressbedingung auf den Mittelwert DxAm/DxDm der Nicht-Stressbedingung (z. B. 0 M NaCl). Vergleiche mit einem Boxplot oder einem Diagramm mit glatten Kurven (Abbildung 4 und Abbildung 5). Führen Sie eine einfache ANOVA gefolgt von einem statistischen Post-hoc-Tukey-Test durch (p-Werte: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Results

Nach der Transformation von Hefezellen mit dem pDRFLIP38-AtLEA4-5-Plasmid wurde die Fluoreszenz der positiven Transformanten mit einem Blaulicht-Transilluminator und einem Filter beobachtet (Abbildung 1). Die Vorbereitung der verschiedenen Lösungen zur Induktion von hyperosmotischem Stress ist zeitaufwändig, daher empfehlen wir, der 96-Well-Vorlage in Abbildung 2 zu folgen. Unmittelbar nach der hyperosmotischen Stressbehandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumchlorid wurden die Fluoreszenzemissionsspektren erfasst (Abbildung 3). Die Fluoreszenzemissionsspektren jeder Bedingung wurden erhalten, um ein typisches FRET-Änderungsverhalten zu validieren. Eine Normalisierung der Fluoreszenzintensitätswerte auf den isosbestischen Punkt ist erforderlich, um experimentelle Fehler zu korrigieren. Für diese repräsentativen Ergebnisse haben wir die zuvor berichtete AtLEA4-5 getestet, eine hochempfindliche Pflanze IDR⁶. Als Referenz haben wir auch das leicht unempfindliche globuläre Protein ABP getestet (Abbildung 3). Es kann beobachtet werden, dass beide Konstrukte eine Kombination aus mCerulean3- und Citrin-Emissionsspektren (Peaks für die Donor- und Akzeptor-FPs) aufweisen, was auf einen gewissen Grad an basaler FRET-Effizienz unter Standardbedingungen (0 M NaCl) hinweist. Bei AtLEA4-5 verursachte hyperosmotischer Stress eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität des Akzeptors in Verbindung mit einer Abnahme der Fluoreszenzintensität des Donors, was auf eine hyperosmotische Stress-induzierte Verdichtung der IDR hinweist (Abbildung 3A). Dieser Trend wurde bei ABP nicht beobachtet (Abbildung 3B). Um Unterschiede in der strukturellen Empfindlichkeit zwischen den verschiedenen hyperosmotischen Stressbehandlungen zu quantifizieren, haben wir das FRET-Verhältnis (DxAm/DxDm) für jede Bedingung aufgetragen und einen statistischen Einweg-ANOVA-Test durchgeführt (Abbildung 4). Schließlich haben wir die strukturelle Sensitivität von AtLE4-5 und ABP verglichen. Wir beobachteten, dass AtLEA4-5 eine signifikant höhere Sensitivität als ABP aufwies (Abbildung 5).

Abbildung 1: Fluoreszenzemission von S. cerevisiae-Transformanten . SD-ura-Petrischale, plattiert mit S. cerevisiae, transformiert mit dem pDRFLIP38-AtLEA4-5-Plasmid. Die Fluoreszenz wurde mit einem Blaulicht-Transilluminator und einem Orangefilter beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Eine 96-Well-Plattenschablone für das FRET-System. Drei technische Replikate für jede hyperosmotische Stressbedingung werden in aufeinanderfolgenden Vertiefungen platziert. Die ersten beiden Zeilen (A und B) erfüllen acht Bedingungen für ein Konstrukt (IDR1). Die folgenden Zeilen können neue Konstrukte aufnehmen (IDR2, IDR3 usw.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Normalisierte Fluoreszenzemissionsspektren unter verschiedenen hyperosmotischen Stressbedingungen. Spectra validierte ein typisches FRET-Verhalten als Reaktion auf eine Behandlung mit hyperosmotischem Stress (NaCl). (A) AtLEA4-5, eine hochempfindliche IDR. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität des Akzeptors ist mit der Abnahme der Fluoreszenzintensität des Donors gekoppelt. (B) ABP, ein leicht unempfindliches globuläres Protein. Peaks werden bei 475 nm und 525 nm gemäß dem FRET-Paar mCerulean3 und Citrin beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantifizierung der strukturellen Empfindlichkeit unter verschiedenen hyperosmotischen Stressbedingungen. Normalisiertes FRET-Verhältnis (DxAm/DxDm) von lebenden Hefezellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von NaCl behandelt wurden. (a) AtLEA4-5. (B) Arabinose-bindendes Protein (ABP). n = 9 unabhängige Messungen. Einfache ANOVA. NS: Nicht signifikant. p-Werte: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Die Kästchen stellen das 25. bis 75. Perzentil dar (Linie im Median). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Vergleich der strukturellen Empfindlichkeit von AtLEA4-5 und ABP. (A) Normalisiertes FRET-Verhältnis (DxAm/DxDm) unter verschiedenen hyperosmotischen Spannungsbedingungen für AtLEA4-5 und ABP. n = 3 unabhängige Messungen. (B) Delta-FRET-Wert (1,5 M - 0 M NaCl) für AtLEA4-5 und ABP. Die Änderung wird als strukturelle Empfindlichkeit der im FRET-System gemessenen Konstrukte bei 1,5 M NaCl angegeben. n = 3 unabhängige Messungen. Mittelwert ± SD. Zwei-Wege-ANOVA mit den folgenden p-Werten: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, Einblicke zu gewinnen, wie die globalen Dimensionen des Ensembles von IDRs Umweltstörungen wahrnehmen und darauf reagieren. Diese Methode beruht auf einem genetisch kodierten Konstrukt und benötigt keine zusätzlichen Komponenten außer einer plasmidstabilen Expression in Hefezellen, wodurch sie für potenzielle Anwendungen in anderen Zelltypen angepasst werden kann. Darüber hinaus ist es vielseitig einsetzbar, um andere physikalisch-chemische Störungen zu erforschen, denen eukaryotische Zellen während ihres Lebenszyklus ausgesetzt sind²¹. Die Auflösung von FRET ist bemerkenswert, wobei der Energietransfer nur in einer Nähe von weniger als 10 nm zwischen den Donor- und Akzeptor-FPs stattfindet. Die Haupteinschränkung ist jedoch das Fehlen präziser struktureller Informationen, die mit der Ensemble-FRET-Methode nicht gewonnen werden können.

Die inhärente Heterogenität und Flexibilität von IDRs stellt eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, ihr Ensemble in einem zellulären Kontext zu untersuchen, was Techniken wie die Röntgenkristallographie unpraktisch macht. NMR wurde für die Untersuchung ungeordneter Proteine in Zellen in Betracht gezogen, aber sich ändernde Bedingungen können aufgrund von Signalinterferenzen ein Problem darstellen²². Die Implementierung der FRET-Technik zur Untersuchung von IDR-Konformationsensembles bietet einzigartige Möglichkeiten, die die Kartierung der Populationsverteilung innerhalb lebender Zellen ermöglichen. Darüber hinaus kann es durch In-vitro-Methoden wie Einzelmolekül-FRET (smFRET) ergänzt werden, was seine Anpassungsfähigkeit an verschiedene Ansätze und experimentelle Bedingungen demonstriert²³. Dieses Protokoll verwendet mCerulean3 als Spender-FP und Citrin als Akzeptor-FP und bietet ein unkompliziertes und leicht zu verfolgendes System. Bei der Auswahl von FRET-Paaren muss die spektrale Überlappung sorgfältig berücksichtigt werden, um das Übersprechen zwischen den Signalen^24,25 zu mindern. Bei der Meldung von Änderungen der strukturellen Empfindlichkeit mit dieser Methode ist die Wahl einer geeigneten FRET-Metrik, wie z. B. der FRET-Effizienz (E_FRET), entscheidend für eine zuverlässige Signalinterpretation. Alternativ kann die strukturelle Empfindlichkeit mit dem FRET-Verhältnis (DxAm/DxDm) analysiert und verglichen werden, dies erfordert jedoch eine sorgfältige Korrektur des Donor-Akzeptor-Fluoreszenz-Übersprechens²⁵. Die Interpretation von Fluoreszenzdaten, die von Mikroplatten-Readern erhalten werden, kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden, einschließlich der Eigenschaften der Fluorophore, der Dipolorientierung, der intermolekularen FRET- im Vergleich zu intramolekularen FRET-Systemen, der Probenvorbereitung und der Datenanalyse²⁵.

Intermolekulare FRET ist eine wesentliche Einschränkung der Ensemble-FRET-Methode, da es nicht möglich ist, sie aus der anfänglichen Analyse der Daten zu verwerfen. Dies wirft eine wichtige Überlegung für den Leser auf, da einige IDRs dafür bekannt sind, in biomolekulare Kondensate zu rekrutieren^26,27. Die lokale Konzentration von Makromolekülen in biomolekularen Kondensaten ist hoch, was intermolekulare Wechselwirkungen induzieren und somit die FRET-Auslesung beeinflussen könnte. Für AtLEA4-5 wurde gezeigt, dass es sich bei hyperosmotischem Stress in Hefezellen selbst zu diskreten punktförmigen Strukturen zusammensetzt⁶. Um die Wirkung von intermolekularem FRET auszuschließen, inkubierten die Autoren die Zellen mit 1,6-Hexandiol (1,6-HD), einem Molekül, das biomolekulare Kondensate stört. Die 1,6-HD-Behandlung löste die AtLEA4-5-Kondensate auf, aber die FRET-Spiegel wurden nicht reduziert, was darauf hindeutet, dass die Proteinkondensation keine unerwünschten intermolekularen FRET verursacht. Da dieser Effekt von jeder IDR abhängt, sollten die Leser zusätzliche Ansätze wie Akzeptor-Photobleaching oder Co-Expression von Nur-Spender- und Nur-Akzeptor-Konstrukten durchführen⁶. Die aus dem Ensemble-FRET in lebenden Zellen gewonnenen Informationen sind jedoch von signifikanter Relevanz für die Charakterisierung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs.

Ein komplizierter Aspekt des hier vorgestellten Protokolls ist, dass es einen Organismus verwendet, der auf hyperosmotischen Stress reagiert. In Gegenwart hoher äußerer Natriumchloridkonzentrationen verlässt Wasser die Zelle, erhöht die Gesamtproteinkonzentration und schafft eine überfüllte Umgebung²⁸. IDRs reagieren empfindlich auf Änderungen des makromolekularen Crowdings 5,6,11,12. Insbesondere AtLEA4-5, das Protein, das als Modell in diesem Protokoll verwendet wurde, war empfindlich gegenüber Crowdern mit unterschiedlichem Molekulargewicht, aber nicht gegenüber hohen Konzentrationen von Salzen oder Glycerin in vitro⁶. Da die Akkumulation von Glycerin für die Reaktion und Akklimatisierung von Hefezellen auf hyperosmotischen Stress wichtig ist²⁹, ist es wichtig hervorzuheben, dass der Hauptfaktor für die AtLEA4-5-Verdichtung die makromolekulare Überfüllung während früher Ereignisse der Osmosensorik ist. Wie sich die Struktur von AtLEA4-5 in nachfolgenden Akklimatisierungsstadien verändert, wenn sich Glycerin ansammelt, bedarf weiterer Untersuchungen.

Die Erforschung der Konformationsdynamik in ungeordneten Proteinen umfasst eine Vielzahl von Techniken. FRET ist in diesem Zusammenhang eine zentrale Methode. Abhängig von den spezifischen Forschungsanfragen und den betrachteten Merkmalen können Forscher In-vivo-NMR-Spektroskopie einsetzen, um IDRs zu charakterisieren³⁰. Darüber hinaus ist smFRET ein wertvolles Werkzeug für In-vivo-Studien ²³. Die Elektronenspinresonanzspektroskopie (EPR) ist eine weitere Technik, die zur quantitativen Untersuchung von IDRs in einem zellulären Kontext eingesetzt wird³¹. Massenspektrometrie-basierte Methoden sind ebenfalls leistungsfähige Ansätze, da sie strukturelle Informationen über die zelluläre Konformation von Proteinen liefern können³². Zu diesen Methoden gehören die native Massenspektrometrie (native-MS) und die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS)^32,33. All diese Methoden ermöglichen es den Forschern, sich mit den vielfältigen Konformationen einer IDR und ihrer Dynamik zu befassen und ihre Beiträge zur Zellbiologie zu beleuchten. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um ein erstes Screening der strukturellen Empfindlichkeit in einer Hochdurchsatzweise durchzuführen. Folgestudien können sich auf die Prüfung der strukturellen Empfindlichkeit in einem gewünschten Zelltyp konzentrieren oder mit dem Potenzial, mechanistische Erkenntnisse durch In-vitro-Methoden wie smFRET, CD oder SAXS zu gewinnen. Die Kombination von Methoden ist notwendig, um ein klares Bild der strukturellen Empfindlichkeit von IDR in den sich ändernden Umgebungen von Zellen zu erhalten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well-Platte	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 Zellen	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50	mM Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon Röhrchen	Corning	352057
LB Medien	Sigma-Aldrich	L2897
Lithiumacetat 0,1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Mikrozentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep-Kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0,02 M	Merck	106462
PEG 3.350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
Plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plattenleser	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Lachsspermien DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Natriumclorid	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris Instrumente	E4000
UV-sichtbares Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD-Medien	Sigma-Aldrich	Y1500