Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Daniel Call; Sabrina S. Pizarro; Erica Tovey; Emily Knight; Carrie Baumgardner; Kenneth A. Christensen; James C. Morris

doi:10.3791/66279

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Methodenartikel

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

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DOI:

10.3791/66279

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19. Januar 2024

Daniel Call^*¹ , Sabrina S. Pizarro^*²^,³ , Erica Tovey¹ , Emily Knight²^,³ , Carrie Baumgardner²^,⁴ , Kenneth A. Christensen¹ , James C. Morris²

¹Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, ²Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, ³Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, ⁴Department of Physics and Astronomy, Clemson University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um zu untersuchen, wie der pH-Wert auf Umweltreize in den Glykosomen der Blutkreislaufform afrikanischer Trypanosomen reagiert. Dieser Ansatz beinhaltet einen pH-sensitiven Sensor für vererbbare Proteine in Kombination mit Durchflusszytometrie zur Messung der pH-Dynamik, sowohl als Zeitverlaufsassay als auch in einem Hochdurchsatz-Screen-Format.

Zusammenfassung

Der Glukosestoffwechsel ist für das afrikanische Trypanosom, Trypanosoma brucei, als essentieller Stoffwechselprozess und Regulator der Parasitenentwicklung von entscheidender Bedeutung. Über die zellulären Reaktionen, die entstehen, wenn sich der Glukosespiegel in der Umwelt ändert, ist wenig bekannt. Sowohl in Parasiten im Blutkreislauf als auch in prozyklischer Form (Insektenstadium) beherbergen Glykosomen den größten Teil der Glykolyse. Diese Organellen werden als Reaktion auf Glukoseentzug schnell angesäuert, was wahrscheinlich zu einer allosterischen Regulation von glykolytischen Enzymen wie Hexokinase führt. In früheren Arbeiten war die Lokalisierung der chemischen Sonde, die zur Durchführung von pH-Messungen verwendet wird, eine Herausforderung, was ihren Nutzen in anderen Anwendungen einschränkte.

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Verwendung von Parasiten, die glykosomal lokalisiertes pHluorin2, einen vererbbaren Protein-pH-Biosensor, exprimieren. pHluorin2 ist eine ratiometrische pHluorin-Variante, die eine pH-abhängige (säureabhängige) Abnahme der Anregung bei 395 nm zeigt, während sie gleichzeitig eine Zunahme der Anregung bei 475 nm ergibt. Transgene Parasiten wurden durch Klonierung des offenen pHluorin2-Leserahmens in den Trypanosomen-Expressionsvektor pLEW100v5 erzeugt, was eine induzierbare Proteinexpression in beiden Lebenszyklusstadien ermöglicht. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die glykosomale Lokalisation des pHluorin2-Biosensors zu bestätigen, indem die Lokalisation des Biosensors mit der glykosomalen residenten Proteinaldolase verglichen wurde. Die Reaktionsfähigkeit des Sensors wurde bei unterschiedlichen pH-Werten kalibriert, indem Zellen in einer Reihe von Puffern mit einem pH-Wert von 4 bis 8 inkubiert wurden, ein Ansatz, den wir zuvor zur Kalibrierung eines pH-Sensors auf Fluoresceinbasis verwendet haben. Anschließend maßen wir die pHluorin2-Fluoreszenz bei 405 nm und 488 nm mittels Durchflusszytometrie zur Bestimmung des glykosomalen pH-Werts. Wir validierten die Leistung der lebenden transgenen pHluorin2-exprimierenden Parasiten und überwachten den pH-Wert im Laufe der Zeit als Reaktion auf Glukoseentzug, einen bekannten Auslöser der glykosomalen Ansäuerung bei PF-Parasiten. Dieses Tool hat eine Reihe potenzieller Anwendungen, einschließlich des potenziellen Einsatzes im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening. Über den glykosomalen pH-Wert hinaus könnte der Sensor an andere Organellen angepasst oder in anderen Trypanosomatiden verwendet werden, um die pH-Dynamik in der lebenden Zellumgebung zu verstehen.

Einleitung

Parasitäre Kinetoplastiden sind wie die meisten lebenden Organismen auf Glukose als grundlegenden Bestandteil des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels angewiesen. Zu dieser Gruppe gehören medizinisch wichtige Organismen wie das afrikanische Trypanosom Trypanosoma brucei; das amerikanische Trypanosom, T. cruzi; und Parasiten der Gattung Leishmania. Der Glukosestoffwechsel ist entscheidend für das Wachstum von Parasiten in den pathogenen Lebenszyklusstadien. Wenn beispielsweise Glukose entzogen wird, stirbt die Blutbahnform (BSF) des afrikanischen Trypanosoms schnell ab. Insbesondere dient die Glykolyse als einzige ATP-Quelle in diesem Stadium d....