Computergestützte Vorhersage der Aminosäurepräferenzen potenziell multispezifischer Peptidbindungsdomänen, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine auf Sequenzdiversifikation basierende Methodik zur Abschätzung der Aminosäurepräferenzen multispezifischer Bindungsstellen in Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs). Bei dieser Strategie werden Tausende von potentiellen Peptidliganden erzeugt und in silico gescreent, wodurch einige Einschränkungen der verfügbaren experimentellen Methoden überwunden werden.

Zusammenfassung

Viele Protein-Protein-Wechselwirkungen beinhalten die Bindung kurzer Proteinsegmente an Peptidbindungsdomänen. In der Regel erfordern solche Wechselwirkungen das Erkennen linearer Motive mit variabler Konservierung. Die Kombination von hochkonservierten und variableren Regionen in denselben Liganden trägt oft zur Multispezifität der Bindung bei, eine gemeinsame Eigenschaft von Enzymen und zellulären Signalproteinen. Die Charakterisierung der Aminosäurepräferenzen von Peptidbindungsdomänen ist wichtig für das Design von Mediatoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs). Computergestützte Methoden sind eine effiziente Alternative zu den oft kostspieligen und umständlichen experimentellen Techniken und ermöglichen das Design potenzieller Mediatoren, die später in nachgelagerten Experimenten validiert werden können. In dieser Arbeit haben wir eine Methodik beschrieben, die die Pepspec-Anwendung des molekularen Modellierungspakets von Rosetta verwendet, um die Aminosäurepräferenzen von Peptidbindungsdomänen vorherzusagen. Diese Methode ist nützlich, wenn sowohl die Struktur des Rezeptorproteins als auch die Art des Peptidliganden bekannt sind oder abgeleitet werden können. Die Methodik beginnt mit einem gut charakterisierten Anker aus dem Liganden, der durch zufällige Zugabe von Aminosäureresten erweitert wird. Die Bindungsaffinität der auf diese Weise erzeugten Peptide wird dann durch flexibles Rückgrat-Peptid-Docking bewertet, um die Peptide mit den besten vorhergesagten Bindungswerten auszuwählen. Diese Peptide werden dann zur Berechnung von Aminosäurepräferenzen und optional zur Berechnung einer Positionsgewichtsmatrix (PWM) verwendet, die in weiteren Studien verwendet werden kann. Um die Anwendung dieser Methodik zu veranschaulichen, verwendeten wir die Interaktion zwischen Untereinheiten des humanen Interferon-Regulationsfaktors 5 (IRF5), von dem bisher bekannt war, dass er multispezifisch ist, aber global von einem kurzen konservierten Motiv namens pLxIS geleitet wird. Die geschätzten Aminosäurepräferenzen stimmten mit den bisherigen Erkenntnissen über die IRF5-Bindungsoberfläche überein. Positionen, die von phosphorylierbaren Serinresten eingenommen wurden, wiesen eine hohe Häufigkeit von Aspartat und Glutamat auf, wahrscheinlich weil ihre negativ geladenen Seitenketten denen von Phosphoserin ähneln.

Einleitung

Die Interaktion zwischen zwei Proteinen beinhaltet oft die Bindung kurzer Segmente von Aminosäuren an Peptid-Bindungsdomänen, die Protein-Peptid-Grenzflächen ähneln. Rezeptorproteine, die an solchen Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) beteiligt sind, haben oft die Fähigkeit, einen bestimmten Satz überlappender, aber divergierender Ligandensequenzen zu erkennen, eine Eigenschaft, die als Multispezifität bekannt ist ^1,2. Die multispezifische Erkennung ist ein Merkmal vieler zellulärer Proteine, aber besonders bemerkenswert ist sie bei Enzymen und zellulären Signalproteinen³. Proteine, die mit multispezifischen Bindungsstellen interagieren, haben oft eine Kombination aus mehr und weniger konservierten Regionen in ihrer Sequenz ^4,5,6. In diesem Szenario sind die stärker konservierten Sequenzmotive an stringenten molekularen Wechselwirkungen beteiligt. Umgekehrt interagieren die variableren Sequenzen mit irgendwie permissiven Oberflächen in der Rezeptorbindungsstelle. In der Regel handelt es sich bei diesen weniger konservierten, aber immer noch funktionell relevanten Segmenten um Schleifen ohne definierte Sekundärstrukturmuster oder um noch dynamischere Konformationen, wie sie für intrinsisch ungeordnete Proteine typisch sind⁷.

Die Identifizierung potenzieller Peptidliganden von Bindungsstellen ist in der Regel der erste Schritt bei der Entwicklung von Mediatoren, die in der Lage sind, die entsprechenden PPIs zu interferieren⁸. Es ist jedoch oft unwahrscheinlich, einen einzigen der häufigsten Aminosäurereste an den meisten Sequenzpositionen in Liganden multispezifischer Bindungsstellen zu finden. Stattdessen können diese Stellen besondere Präferenzen für eine bestimmte Klasse von Aminosäuren entsprechend ihren chemischen Eigenschaften haben, z. B. saure und negativ geladene Aminosäuren wie Aspartat oder Glutamat, sperrige aromatische Aminosäuren wie Phenylalanin oder mehr hydrophobe Reste wie aliphatische Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin³. Verschiedene experimentelle Methoden können Einblicke in die Aminosäurepräferenzen von Proteinbindungsstellen liefern, darunter die gerichtete Evolution⁹, die Multicodon-Scanning-Mutagenese¹⁰ und die tiefe^{Mutations-Scanning 11}. Alle diese Methoden folgen dem Ansatz der Sequenzdiversifizierung, der darauf basiert, Mutationen in ursprüngliche Liganden einzuführen und deren Wirkung auf die Funktion des Rezeptorproteins weiter zu analysieren (siehe Bratulic und Badran¹² für eine umfassende Übersicht). Diese Methoden erfordern jedoch oft die Durchsicht großer Sequenzbibliotheken, was sie umständlicher, kostspieliger und zeitaufwändiger macht.

Computergestützte Methoden zur Ableitung der Aminosäurepräferenzen multispezifischer Bindungsstellen haben das Potenzial, die Einschränkungen von Nasslabormethoden zu umgehen. Unter diesen bewertet der In-silico-Sequenzdiversifikationsansatz den energetischen Einfluss einer Vielzahl von Aminosäureersatzstoffen in der Ligandensequenz, um die strukturelle Plastizität des PPI¹³ zu charakterisieren. Diese Methode beginnt mit der Struktur oder dem Modell des Peptidliganden, der an die Rezeptorbindungsstelle gebunden ist, und führt anschließend Mutationen in die Ligandensequenz ein. Statistische und Energie-Scoring-Funktionen werden dann verwendet, um den Einfluss dieser Mutationen auf die Stabilität und Bindungsaffinität zu bewerten. Der Satz der Ligandensequenzen mit der besten Punktzahl, der sich aus der Evaluierungsphase ergibt, kann dann zur Berechnung der Aminosäurepräferenzen verwendet werden. Diese Strategie hat das Potenzial, eine sehr große Anzahl von Ligandensequenzen effizient zu verarbeiten. Daher kann es eine vollständigere und konsistentere Rückschluss auf die Aminosäurepräferenzen liefern, verglichen mit denen, die aus der begrenzteren Anzahl von Sequenzen berechnet werden, die normalerweise in Nasslaboransätzen verarbeitet werden können.

Die Pepspec-Anwendung der Rosetta Molecular Modeling Suite¹⁴ ist ein Werkzeug, das die Sequenzdiversifizierung als wichtigen Schritt seines Peptiddesignmodus durchführt. Diese Anwendung erfordert eine Struktur oder ein Modell des Rezeptorproteins mit einem gebundenen Peptid bis zu einem einzigen Aminosäurerest in der Länge, das als Anker für die nächsten Schritte verwendet wird. Die Sequenz des gebundenen Peptids wird dann (falls erforderlich) verlängert und diversifiziert, um eine große Anzahl von mutmaßlichen Peptidliganden zu erzeugen. Die Bindungsaffinität dieser Peptide wird dann durch Peptid-Docking mit flexiblem Rückgrat bewertet, um diejenigen mit den besten vorhergesagten Bindungswerten auszuwählen. Obwohl das Hauptergebnis dieser Anwendung die besten Peptidkandidaten sind, die am Ende der Designphase ausgewählt werden, kann die viel größere Menge von Peptiden, die in dieser Phase akzeptiert werden, auch zur Berechnung der Aminosäurepräferenzen der Zielbindungsstelle verwendet werden. Aminosäurepräferenzen werden als Häufigkeit jedes Aminosäurerests pro Position der Ligandensequenz berechnet, die entweder als Positionsgewichtsmatrix (PWM) oder als visuelleres Sequenzlogo dargestellt wird.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Abschätzung der Aminosäurepräferenzen der Bindungsoberfläche eines Rezeptorproteins, das an einem PPI beteiligt ist. Das Protokoll konzentriert sich auf PPIs, bei denen bekannt ist, dass ein lineares Segment des Protein-Liganden an das Rezeptorprotein bindet, so dass das Szenario als Protein-Peptid-Schnittstelle modelliert werden kann. In diesem Szenario interagieren konservierte Motive aus dem Liganden typischerweise mit definierten Taschen in der Rezeptorbindungsstelle, obwohl das gesamte Ligandensegment, das an der PPI beteiligt ist, weniger konservierte Regionen enthalten kann. Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammenfasst, ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll beginnt mit der 3D-Struktur des Protein-Protein-Komplexes und reduziert das Ligandenprotein weiter auf das potenziell am besten interagierende Segment, wobei das Rezeptorprotein intakt bleibt. Das am besten interagierende Segment wird unter Verwendung des BUDE Alanin-Scan-Servers¹⁵ abgeleitet, der eine rechnergestützte Alanin-Scanning-Mutagenese durchführt, um Hot-Spot-Reste zwischen den beiden interagierenden Proteinen zu identifizieren. Bei diesem Ansatz werden Reste aus dem Liganden einzeln durch Alanin ersetzt, und die geschätzte Änderung der freien Energie oder Stabilität des Komplexes (ΔΔG) wird dann verwendet, um auf die Relevanz des entsprechenden Rests für den Ziel-PPI zu schließen. Sobald das am besten interagierende Segment abgeleitet ist, wird sein Komplex mit dem Rezeptorprotein als Basisstruktur verwendet, die an Pepspec übermittelt wird, um eine Sequenzdiversifizierung durchzuführen.

Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Schritte des Protokolls, das in dieser Arbeit vorgeschlagen wird. Die Nummern stimmen mit den Schrittnummern im Protokollabschnitt überein. Die Abbildungen wurden mit dem Protein-Protein-Komplex erstellt, der als Beispiel für das im Text beschriebene Beispiel verwendet wird. In diesem Komplex ist die Proteinkette, die als Rezeptor betrachtet wird, rosa dargestellt, während die Kette, die als Ligand betrachtet wird, in hellblau dargestellt ist, wobei ihr vorhergesagtes Segment mit der besten Wechselwirkung rot hervorgehoben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Eine der Einschränkungen des vorgeschlagenen Protokolls ist die Anforderung einer aufgelösten Struktur der Protein-Peptid-Grenzfläche. Das Protokoll kann alternativ mit einem Modell der Zielprotein-Peptid-Grenzfläche beginnen, obwohl die spezifischen Modellierungsschritte hier nicht beschrieben werden. Obwohl das Protokoll auf einem PC mit einem beliebigen Betriebssystem ausgeführt werden kann, ist für die Schritte mit den Rosetta-Anwendungen eine Linux-Umgebung erforderlich. Ein Computercluster wird auch für den Schritt der Sequenzdiversifizierung dringend empfohlen, da Pepspec typischerweise eine große Anzahl von Iterationen durchführt.

Die Anwendung des vorgeschlagenen Protokolls wird durch die Schätzung der Aminosäurepräferenzen der Gebotsfläche von IRF5, einem Mitglied der Familie der humanen Interferon-Regulationsfaktoren (IRF), veranschaulicht. Wir haben dieses Protein als Beispiel gewählt, weil sich während seiner Aktivierung zwei Untereinheiten zu einem Dimer verbinden, dessen Struktur gut charakterisiert ist¹⁶. In IRF-Dimeren kann die Bindung als Protein-Peptid-Grenzfläche modelliert werden, bei der eine Untereinheit die Bindungsoberfläche bildet und die andere durch eine Region interagiert, die ein kurzes konserviertes Motiv namens pLxIS^17,18 enthält. Darüber hinaus ist die Bindung an IRF-Untereinheiten multispezifisch; Daher können sie Homodimere, Heterodimere und Komplexe mit anderen zellulären Proteinen bilden, die als Koaktivatoren bekannt sind¹⁸.

Protokoll

1. Erste Vorbereitung der Protein-Peptid-Grenzfläche

1. Herunterladen der Struktur des Protein-Protein-Komplexes
   1. Navigieren Sie zur Homepage der Protein Data Bank (PDB) (https://www.rcsb.org/) und geben Sie die PDB-ID für die Struktur des Protein-Protein-Komplexes in das Hauptsuchfeld ein (Abbildung 2A). Die PDB-ID für die Struktur des IRF5-Dimers, die in dieser Arbeit als Beispiel verwendet wird, ist 3DSH¹⁹.
   2. Klicken Sie auf der Hauptseite für die gewünschte Struktur auf Download Files (Abbildung 2B) und dann auf Biologische Anordnung 1 (PDB - gz) (Abbildung 2C).
      HINWEIS: In der PDB-Datenbank werden Strukturen vieler Proteinkomplexe, die aus identischen Monomeren bestehen, als biologische Anordnungen dargestellt, bei denen nur die Struktur eines Monomers (asymmetrische Einheit) in der PDB-Datei gespeichert ist. Die Struktur des Multimers, in diesem Fall das IRF5-Dimer, muss als biologische Anordnung heruntergeladen werden, die zwei Instanzen der asymmetrischen Einheit enthält. Um die nächsten Schritte dieses Protokolls zu erleichtern, werden zunächst die beiden Monomere getrennt und ihnen unterschiedliche Ketten-IDs zugewiesen.
   3. Öffnen Sie die heruntergeladene Struktur in UCSF Chimera²⁰ und klicken Sie auf Tools > Strukturbearbeitung > Ketten-IDs ändern. In diesem Beispiel erhalten beide Ketten in der biologischen Baugruppe den Namen A. Benennen Sie die zweite Kette (mit der Bezeichnung #0.2) in B um, und klicken Sie auf OK.
   4. Klicken Sie auf Favoriten > Modellgruppe, und wählen Sie dann das Modell aus, das die beiden Ketten enthält. Klicken Sie auf die Schaltfläche Gruppieren/Gruppierung aufheben , um jede Kette in ein anderes Modell zu unterteilen. Wählen Sie dann die beiden Modelle aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Kopieren/Kombinieren . Geben Sie einen neuen Namen für das kombinierte Modell ein, aktivieren Sie die Option Quellmodelle schließen, und klicken Sie auf OK.
   5. Klicken Sie auf > Kette auswählen und bestätigen Sie, dass jede Kette im Dimer nun durch einen anderen Buchstaben gekennzeichnet ist, nämlich A und B.
   6. Verwenden Sie Datei > PDB speichern , um die bearbeitete Struktur in einer anderen PDB-Datei zu speichern, die in den nächsten Schritten des Protokolls verwendet wird (hier wurde der Name IRF5_dimer.pdb verwendet).

Abbildung 2: Die Seite der Protein Data Bank (PDB) für die Struktur, die in dieser Arbeit als repräsentatives Beispiel verwendet wird. (A) Suchfeld zur Eingabe des PDB-Zugangscodes der Zielstruktur. (B) Menü zum Herunterladen der Struktur in verschiedenen Formaten. (C) Optionen zum Herunterladen biologischer Anordnungen, wenn die Struktur als asymmetrische Einheit gespeichert wurde (siehe Schritt 1.1.2 für weitere Details). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Identifizierung des Zielsegments im Ligandenprotein
   1. Navigieren Sie zum BUDE Alanine Scan Server (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Klicken Sie unter Struktur-Upload auf die Schaltfläche Datei auswählen und wählen Sie die in Schritt 1.1.6 gespeicherte PDB-Datei aus.
   2. Überprüfen Sie auf der nächsten Seite, ob die Struktur korrekt geladen wurde (Abbildung 3A), und geben Sie einen Namen für den Job auf dem Server ein (Abbildung 3B).
   3. Legen Sie die Ketten aus dem PDB fest, die als Rezeptor (A) und Ligand (B) behandelt werden (Abbildung 3C). Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Scan starten , um den Auftrag zu senden.
   4. Sobald der Auftrag abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen , um die Ergebnisseite zu öffnen (Abbildung 4).
      HINWEIS: Auf der Ergebnisseite sind die Reste der Ligandenstruktur entsprechend ihrer geschätzten Änderung der freien Energie (ΔΔG) eingefärbt, und die Reste mit höheren Werten sind rot eingefärbt.
   5. Wählen Sie aus der Rückstandsliste den Abschnitt der Rückstände aus, der voraussichtlich besser mit der Zielbindungsoberfläche interagiert. Stellen Sie sicher, dass diese Reste die höheren Werte für die Differenz der freien Energie (ΔΔG) gruppieren. In diesem Beispiel wurde das Segment zwischen den Resten Leu424 und Ser436 ausgewählt (hervorgehoben durch ein rotes Feld im rechten Bereich von Abbildung 4).
3. Vorbereitung der Protein-Peptid-Grenzfläche für die Sequenzdiversifizierung
   1. Öffnen Sie die in Schritt 1.1.6 gespeicherte PDB-Datei in Chimera und überprüfen Sie, ob keine Atome oder Bindungen in der Struktur der Zieluntereinheiten fehlen.
   2. Löschen Sie alle kleinen Moleküle, Ionen und Lösungsmittel, die mit der ursprünglichen Struktur cokristallisiert wurden. Klicken Sie dazu auf Select > Residues und wählen Sie dann alle Moleküle außer Standardaminosäuren aus. Klicken Sie dann auf Aktionen > Atome/Bindungen und Löschen.
   3. Schneiden Sie die Ligandenkette auf das am besten interagierende Segment zu, das in Schritt 1.2.5 ausgewählt wurde. Klicken Sie dazu auf Favoriten und Sequenz und dann auf die Kette, die als Ligand gilt (B). Ziehen Sie im Sequenzfenster die Maus, um alle Rückstände mit Ausnahme der Rückstände zwischen den Positionen 424 und 436 auszuwählen. Um diese Rückstände zu löschen, klicken Sie auf Aktionen > Atome/Bindungen und Löschen.
   4. Verwenden Sie Datei > PDB speichern , um die bearbeitete Struktur in einer anderen PDB-Datei zu speichern, die in den nächsten Schritten des Protokolls verwendet wird (hier wurde der Name IRF5_interface.pdb verwendet).

Abbildung 3: Selektion von Rezeptor und Ligand im BUDE Alanine Scan Server. (A) Grafische Darstellung des Protein-Protein-Komplexes. (B) Textfeld zur Eingabe des Namens des Jobs auf dem Server. (C) Panel zur interaktiven Auswahl der Ketten, die als Rezeptor und Ligand betrachtet werden (siehe Schritt 1.2 für weitere Details). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ergebnisseite des BUDE Alanine Scan Servers. Das potenziell am besten interagierende Segment in der Ligandensequenz ist mit einem roten Kästchen gekennzeichnet. Im linken Feld ist der Rückstand mit dem höheren prognostizierten Energiebeitrag (Leu433) grün hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Diversifizierung der Sequenz

HINWEIS: In den folgenden Schritten bezieht sich rosetta_main auf das Hauptinstallationsverzeichnis von Rosetta, das sich in der Regel unter /opt/rosetta_src__bundle/main/ befindet, wobei die installierte Rosetta-Version angibt. Außerdem wird davon ausgegangen, dass Rosetta-Anwendungen systemweit zugänglich sind. Ist dies nicht der Fall, muss der vollständige Pfad zu den ausführbaren Dateien angegeben werden. Wenn diese ausführbaren Dateien aus dem Quellcode kompiliert werden, befinden sie sich im Verzeichnis /rosetta_main/source/bin/.

1. Erste Optimierung von Aminosäure-Seitenketten
   1. Kopieren Sie die in Schritt 1.3.4 gespeicherte bearbeitete Struktur an einen Linux-Speicherort, auf den die Rosetta-Anwendungen zugreifen können.
   2. Verwenden Sie die FixBB-Anwendung von Rosetta, um ein Repack aller Aminosäureseitenketten der Basenstruktur vor der Sequenzdiversifizierung durchzuführen. Bei diesem Vorgang wird die Ausrichtung aller Aminosäureseitenketten optimiert, um den Energieaufwand zu minimieren und die Stabilität des Komplexes zu verbessern. Führen Sie dazu den folgenden Befehl aus:
      
      HINWEIS: Dieser Befehl gibt eine PDB-Datei aus, die nach der ursprünglichen Struktur benannt ist und ein zusätzliches numerisches Suffix enthält (in diesem Beispiel IRF5_interface_0001.pdb ).
   3. Um den nächsten Schritt des Protokolls zu erleichtern, benennen Sie die neu gepackte PDB-Datei mit dem Suffix _repack mit dem folgenden Befehl um:
      MV IRF5_interface_0001.PDB IRF5_repack.PDB
2. Diversifizierung der Sequenz
   1. Führen Sie Pepspec im Designmodus aus, um den eigentlichen Schritt zur Sequenzdiversifizierung mit dem folgenden Befehl auszuführen:
      
      Im Folgenden finden Sie allgemeine Optionen:
      • -s gibt die Eingabedatei an (die neu gepackte PDB-Datei, die in Schritt 2.1.3 generiert wurde).
      • -o gibt das Präfix an, um Ausgabedateien zu benennen.
      • - database gibt den Pfad zur Hauptdatenbank von Rosetta 3 an.
      • -ex1, -ex2 und extrachi_cutoff sind Rotamer-Bibliotheksoptionen (weitere Informationen finden Sie in der Pepspec-Dokumentation).
      • -overwrite weist die Anwendung an, mögliche bereits vorhandene Ausgaben zu überschreiben, die von früheren Iterationen generiert wurden.
      Die Sequenzdiversifikation an sich bietet folgende Optionen:
      • -pepspec:pep_chain gibt die PDB-Ketten an, die als Ligand betrachtet werden (in diesem Beispiel 'b').
      • -pepspec:native_pep_anchor gibt den Aminosäurerest an, der als Anker verwendet wird (in diesem Beispiel der Leu-Rest an Position 10 des Ligandenpeptids).
      • -pepspec:n_peptides gibt die Anzahl der auszugebenden Peptidstrukturen an.
      • -pepspec:no_prepack_prot weist die Anwendung an, das erneute Packen in der Eingabebasisstruktur zu überspringen (da dies zuvor in Schritt 2.1 durchgeführt wurde).
        HINWEIS: Die Hauptausgabe von Pepspec ist ein Verzeichnis, das die PDB-Dateien für Peptide enthält, die aus der Designphase resultieren und mit dem Ausgabepräfix mit dem Suffix .pdbs benannt sind (IRF5.pdbs im Beispiel). Darüber hinaus gibt Pepspec alle akzeptierten Peptidsequenzen, die im Rahmen des Sequenzdiversifizierungsschritts getestet wurden, und die entsprechenden Rosetta-Energiewerte in einer tabulatorgetrennten Textdatei aus, die nach dem Ausgabepräfix benannt ist, wobei die . spec-Suffix (IRF5.spec im Beispiel). Da das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll eher darauf abzielt, Aminosäurepräferenzen als das tatsächliche Peptiddesign zu schätzen, wird in den nächsten Schritten IRF5.spec anstelle der PDB-Strukturen im .pdbs-Verzeichnis verwendet.

3. Schätzung der Aminosäurepräferenzen

1. Berechnen einer PWM
   1. Um eine PWM zu generieren, verwenden Sie das gen_pepspec_pwm.py-Skript , das in der Rosetta-Suite enthalten ist. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um dieses Skript auszuführen:
      
      wo:
      • IRF5.spec ist die Pepspec-Ausgabedatei, die in Schritt 2.2 generiert wurde.
      • -1 gibt an, dass es keine zusätzlichen N-terminalen Reste in der Sequenz gibt und daher Positionen in der PWM 1-basiert sind.
      • 0,2 weist das Skript an, nur die Peptide mit den besten 20 % aus der Pepspec-Ausgabe zu berücksichtigen (der Standardwert ist 0,1, entsprechend 10 %)
      • interface_score weist das Skript an, Peptide basierend auf dem Interface-Score zu ordnen, der einer der verschiedenen Rosetta-Scores ist, die in der Pepspec-Ausgabedatei enthalten sind.
        HINWEIS: Dieses Skript generiert zwei Ausgabedateien, eine für die berechnete PWM (mit dem Suffix .pwm ) und die andere für die Sequenzen der Teilmenge von Peptiden, die zur Berechnung der PWM verwendet werden (mit dem Suffix .seq ). Die Namen dieser Dateien enthalten auch den Score und den Anteil der Peptide, die für die Rangfolge verwendet werden. In diesem Beispiel haben diese Dateien die Namen IRF5_interface_score_0.2.pwm bzw. IRF5_interface_score_0.2.seq.
2. Generieren eines Sequenzlogos
   1. Navigieren Sie zum WebLogo-Server (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)²¹ und klicken Sie auf die Schaltfläche Datei auswählen neben Sequenzdaten hochladen. Laden Sie die Datei mit den Peptidsequenzen hoch, die in Schritt 3.1.1 generiert wurden (in diesem Beispiel IRF5_interface_score_0.2.seq ).
   2. Wählen Sie das gewünschte Format und die Größe des Logos entsprechend der Eingabelänge. Im Beispiel wird das PDF-Format und eine Größe von 15 cm x 12 cm verwendet. Klicken Sie auf Logo erstellen.

Ergebnisse

In diesem Artikel haben wir ein Protokoll zur Vorhersage der Aminosäurepräferenzen der Bindungsoberfläche von IRF5 beschrieben, einem Mitglied einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die als humane Interferon-Regulationsfaktoren bekannt sind. Diese Proteine sind Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunantwort und beteiligen sich an der Differenzierung und Aktivierung mehrerer Immunzellen. IRF-Untereinheiten weisen hochplastische und multispezifische Bindungsoberflächen auf und sind in der Lage, Homodimere, Heterodimere und Komplexe mit anderen zellulären Proteinen zu bilden^17,18. Es wird angenommen, dass die Dimerisierung der erste Schritt bei der Aktivierung dieser Faktoren ist, und bei den meisten Familienmitgliedern wird sie durch die Phosphorylierung mehrerer Serin/Threonin-Reste ausgelöst¹⁸. Während der Dimerisierung interagiert jedes Monomer mit der Bieterfläche des anderen Monomers über ein hochkonserviertes Motiv namens pLxIS, das sich in der C-terminalen Region ihrer Sequenz befindet. Die Abkürzung pLxIS stellt teilweise die Aminosäurepräferenzen der Bindungsoberfläche dar, die sequentiell eine polare Aminosäure ('p') erkennt, gefolgt von zwei Positionen mit einer hohen Häufigkeit von Leucin ('L') und Isoleucin ('I'), getrennt durch eine Position, die von einer beliebigen Aminosäure ('x') eingenommen wird, und gefolgt von einem phosphorylierbaren Serinrest (Ser436 in diesem Beispiel). Die Phosphorylierung mehrerer Serinreste, einschließlich des pLxIS-Motivs, fördert die Biegung des C-terminalen Segments eines Monomers und seine Wechselwirkung mit der Bindungsfläche des anderen Monomers^19,22.

Das hier beschriebene Protokoll begann mit einer 3D-Struktur des IRF5-Dimers¹⁹, in der eines der Monomere willkürlich als Rezeptor im PPI betrachtet wurde, während das andere als der Ligand angesehen wurde, der das pLxIS-Motiv enthält. Um das Segment des Liganden, das mit der Rezeptorbindungsstelle interagiert, besser zu definieren, führten wir eine computergestützte Alanin-Scanning-Mutagenese durch (Schritt 1.2). Das vorhergesagte Segment bestand aus 13 Aminosäureresten von den Positionen 424 bis 436, wobei das pLxIS-Motiv bei Arg432 begann. Die Struktur des ursprünglichen Dimers wurde dann auf einen Peptid-Protein-Komplex reduziert, bei dem die Sequenz des Monomers, das als Ligand betrachtet wurde, auf das vorhergesagte Segment mit der besten Wechselwirkung zugeschnitten wurde, während das andere Monomer intakt blieb (Schritt 1.3). Diese Struktur wurde dann als Input für die Sequenzdiversifikationsstrategie (Abschnitt 2) verwendet, wobei der Leucinrest des pLxIS-Motivs (Leu433) als der von Pepspec benötigte Anker bestimmt wurde. Dieser Prozess führte zu über 26.000 potenziellen Peptidliganden. Die besten 20% der potentiellen Liganden mit den besten Energiewerten (5.280) wurden verwendet, um die Aminosäurepräferenzen der Bindungsoberfläche in Form einer PWM (Abbildung 5A) und eines Sequenzlogos (Abbildung 5B) (Abschnitt 3) abzuschätzen.

Abbildung 5: Aminosäurepräferenzen der Bindungsoberfläche von IRF3. (A) PWM, die die Häufigkeit jedes Aminosäurerests (Reihen) pro Position in der Peptidligandensequenz (Spalten) angibt. (B) Sequenzlogo, das die entsprechenden Aminosäurefrequenzen visuell darstellt. Die Positionen der ursprünglichen IRF5-Sequenz werden in Klammern unter jeder Spalte des Sequenzlogos angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In der PWM entspricht jede Zeile einem bestimmten Aminosäurerest, während jede Spalte eine Position in der Sequenz darstellt. Jede Zelle der Matrix enthält die relative Häufigkeit jeder Aminosäure an dieser Position, gewichtet mit den gesamten Hintergrundfrequenzen. Sequenzlogos werden konstruiert, indem die Buchstaben der Aminosäuren so gestapelt werden, dass die Gesamthöhe des Stapels an jeder Position die Erhaltung der Gesamtsequenz an dieser Position anzeigt. Umgekehrt gibt die Höhe der einzelnen Buchstaben innerhalb des Stapels die Häufigkeit der entsprechenden Aminosäure an. In diesem Beispiel stimmen sowohl die PWM als auch das Sequenzlogo mit dem bisherigen Wissen über die Bindungsoberfläche von IRF5 überein, mit einer höheren Präferenz für eine polare Aminosäure (Glutamat) an Position 432 ('p') und einer sehr hohen Präferenz für Leucin und Isoleucin an den Positionen 433 bzw. 435. Bemerkenswerterweise wurde vorhergesagt, dass die Positionen 427, 429 und 436 eine höhere Konservierung für Aspartat aufweisen, obwohl sie in der ursprünglichen IRF5-Sequenz von Serin besetzt waren. Dieser Befund belegt die Bedeutung der Phosphorylierung dieser Positionen für die Bildung des IRF5-Dimers, da die negative Ladung in den Seitenketten von Aspartat und Glutamat der von Phosphoserin ähnelt. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass ein Köderpeptid namens IRF5D, in dem diese Serinreste durch Aspartat ersetzt wurden, in der Lage war, die IRF5-Aktivität zu hemmen²³. Umgekehrt wurde vorhergesagt, dass Position 425 eine sehr hohe Präferenz für Serin hat, was darauf hindeutet, dass der Serinrest in dieser Position in seiner unphosphorylierten Form am PPI beteiligt sein könnte. In der Tat wurde bereits für andere IRFs berichtet, dass die Phosphorylierung des äquivalenten Serinrests die Dimerisierung und Bindung an andere Koaktivatoren negativ beeinflusst^16,24.

Diskussion

Der vorliegende Artikel beschreibt ein Protokoll zur Abschätzung der Aminosäurepräferenzen potentiell multispezifischer Bindungsstellen auf der Grundlage einer in silico Sequenzdiversifikation. Es wurden nur wenige computergestützte Werkzeuge entwickelt, um die Aminosäurepräferenzen von Protein-Peptid-Grenzflächen abzuschätzen 14,25,26. Diese Tools haben einen prädiktiven Charakter, unterscheiden sich jedoch in den Berechnungsalgorithmen, die zur Durchführung ihrer Vorhersagen verwendet werden, und den Korrekturen, die sie implementieren, um die Genauigkeit zu verbessern. In dieser Arbeit haben wir die Pepspec-Anwendung der Rosetta Molecular Modeling Suite¹⁴ verwendet. Obwohl diese Anwendung in erster Linie auf das Peptiddesign ausgerichtet ist, implementiert sie einen Sequenzdiversifizierungsalgorithmus, der zur Vorhersage von Aminosäurepräferenzen verwendet werden kann. Unseres Wissens nach ist dieses Tool das einzige derzeit verfügbare, das ein integriertes Skript zur Berechnung einer PWM direkt aus den Ergebnissen der Sequenzdiversifikation bietet. Es ist wichtig zu beachten, dass sich das Protokoll auf PPIs konzentriert, daher wird erwartet, dass die anfängliche Struktur ein Komplex aus zwei Proteinuntereinheiten ist. Vor dem eigentlichen Sequenzdiversifizierungsschritt wird das Protein, das als Ligand betrachtet wird, auf das Segment zugeschnitten, von dem erwartet wird, dass es mit dem Rezeptorprotein interagiert, und es wird weiter als Peptid behandelt. Das Protokoll kann jedoch auch auf Protein-Peptid-Komplexe angewendet werden, ein Szenario, in dem die Schritte 1.1-1.3 möglicherweise nicht erforderlich sind. Während des Präparationsschritts (Abschnitt 1) ist es auch wichtig, falsch formatierte Reste und Heteroatome zu korrigieren, sowie Segmente der komplexen Struktur zu modellieren, die für die Zielbindungsstelle relevant sind und nicht richtig aufgelöst werden konnten. Diese Korrekturen hängen von der spezifischen Struktur ab, die untersucht wird, und waren für die hier als Beispiel verwendete Struktur nicht erforderlich.

Die kritischsten Schritte dieses Protokolls sind diejenigen, die mit den Rosetta-Anwendungen durchgeführt werden, zu denen ein erstes Repack der Seitenketten mit FixBB (Schritt 2.1) und die eigentliche Sequenzdiversifizierung mit Pepspec (Schritt 2.2) gehören. Dieser erste Repack-Schritt, der als Pre-Packing bezeichnet wird, wird von den Pepspec-Autoren ausdrücklich als erforderlich erwähnt¹⁴. Obwohl es mit Pepspec durchgeführt werden kann, empfehlen die Autoren dieser Anwendung dringend die Verwendung der FixBB-Anwendung, die speziell zur Optimierung von Seitenketten-Rotameren in festen Proteinrückgraten entwickelt wurde. Im Schritt der Sequenzdiversifizierung ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die Pepspec-Anwendung auf das Peptiddesign ausgerichtet ist. Folglich meldet es standardmäßig einige Peptidkandidaten mit der besten Punktzahl. Da das Ziel des hier vorgestellten Protokolls darin besteht, eine große Anzahl von mutmaßlichen Peptidliganden zu generieren und nicht einige wenige Kandidaten mit der besten Bewertung, haben wir die Option "-pepspec:n_peptides" von 8 (Standard) auf 200 (Schritt 2.2.1) geändert. Mit dieser Einstellung sagte Pepspec mehr als 20.000 Peptide als potenzielle Liganden voraus. Dieser Satz mutmaßlicher Peptide lieferte einen sehr breiten Überblick über die Bindungslandschaft des Rezeptors, der dann für die besten 20% der Peptide mit der besten Punktzahl für die tatsächliche Schätzung der Aminosäurepräferenzen entnommen wurde. Wenn eine geringere Anzahl von Peptiden an "-pepspec:n_peptides" übergeben wird, werden deutlich weniger Kandidaten von Pepspec akzeptiert. In diesem Szenario kann die im Protokoll vorgeschlagene Probenahme viele mutmaßliche Peptidliganden mit suboptimalen Energiewerten erfassen, was möglicherweise zu weniger robusten Schätzungen führt.

Eine der Haupteinschränkungen des in dieser Arbeit vorgestellten Protokolls besteht darin, dass es sich auf das vorherige Wissen über die Struktur des Proteins stützt, das die Bindungsoberfläche enthält. Diese Struktur muss jedoch nicht unbedingt experimentell bestimmt werden, sondern kann ab initio oder durch Homologiemodellierung^{modelliert werden 14}. Darüber hinaus ist es auch notwendig, den Bindungsmodus von mindestens einem Aminosäurerest (Anker) des Peptidliganden zu kennen. Dieser Anker wird über spezifische Ankerverlängerungsoptionen von Pepspec auf eine bestimmte Anzahl von Resten erweitert, um die Sequenzdiversifizierung durchzuführen. Wenn die Orientierung des gesamten Liganden in der Bindungsstelle bekannt ist, wie es bei dem repräsentativen Beispiel dieser Studie der Fall ist, sollten Optionen in Bezug auf die Ankerverlängerung als Standard (keine Verlängerung) belassen werden, obwohl ein Rest des Peptids immer noch als Anker angegeben werden muss, um den Sequenzdiversifizierungsalgorithmus zu steuern. Die Pepspec-Anwendung unterstützt kein De-novo-Andocken eines möglichen Ankerrests, kann jedoch als Input die Ausgabe anderer Andockanwendungen oder ein Modell eines homologen Protein-Peptid-Komplexes verwenden, um das Ankerandocken^{durchzuführen 14}; Diese Szenarien gehen jedoch über den Rahmen dieses Artikels hinaus.

Ein wichtiger Nachteil des vorgeschlagenen Protokolls ist seine inhärente prädiktive Natur, die direkt von der Auflösung und Genauigkeit der ursprünglichen Struktur oder des Modells des Protein-Protein-Komplexes beeinflusst wird. Die Pepspec-Autoren haben jedoch erklärt, dass die Genauigkeit dieser Anwendung erheblich verbessert wurde, indem die Eingangs-Backbone-Koordinaten als ein Ensemble von Strukturen behandelt wurden, anstatt eine einzelne Proteinstruktur zu verwenden und die Hintergrundnormalisierung bei der Berechnung des PWM¹⁴ anzuwenden. Darüber hinaus ist das Protokoll eine Alternative zu den umständlichen und kostspieligen experimentellen Methoden zur Abschätzung von Aminosäurepräferenzen. Alle diese experimentellen Methoden beruhen auf der Bewertung großer Sequenzbibliotheken, die durch das Einbringen von Mutationen in die Sequenz von Proteinliganden erhalten wurden, gefolgt von einer experimentellen Bewertung der Auswirkungen solcher Mutationen (siehe Bratulic und Badran¹² für eine Übersicht). Computerprotokolle wie das in dieser Arbeit vorgeschlagene ermöglichen das Screening von Tausenden von mutmaßlichen Peptidliganden auf sehr effiziente Weise und bieten möglicherweise einen robusteren Satz für die Schätzung von Aminosäurepräferenzen 13,14,25. Das von uns vorgeschlagene Protokoll kann auf jedes PPI angewendet werden, das auf eine Protein-Peptid-Schnittstelle reduziert werden könnte. Darüber hinaus kann dieses Protokoll als erste Strategie zur Identifizierung von Mediatoren von PPIs, wie z. B. potenziellen Aktivatoren oder Inhibitoren, dienen. Die identifizierten Mediatoren können weiter verwendet werden, um diese PPIs im Labor zu untersuchen, oder sie können als potenzielle Therapeutika bewertet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BUDE Alanine Scan Server	University of Edinburgh	https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/	doi: 10.1021/acschembio.9b00560
Rosetta Modeling Software	Rosetta Commons	https://www.rosettacommons.org/software	doi: 10.1002/prot.22851
UCSF Chimera	University of California San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	doi: 10.1002/ JCC.20084