Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.
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Methodenartikel
Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) zeichnen sich durch ihre lebenslange Fähigkeit aus, alle Blutzelltypen zu produzieren. Dies wird operativ getestet, indem Zellpopulationen, die HSCs enthalten, in syngene oder immungeschwächte Mäuse transplantiert werden. Die Größe und Zusammensetzung des Transplantats wird dann im Laufe der Zeit gemessen, in der Regel durch Durchflusszytometrie. Klassischerweise wird eine Population, die HSCs enthält, in den Kreislauf des Tieres injiziert, woraufhin die HSCs ins Knochenmark gelangen, wo sie sich einlagern und mit der Blutproduktion beginnen. Alternativ können HSCs und/oder Vorläuferzellen (HSPCs) direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die intrafemorale Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse beschrieben. Kurz gesagt, vorkonditionierte Mäuse werden betäubt und mit einer Nadel ein kleines Loch durch das Knie in den Oberschenkelknochen gebohrt. Mit einer kleineren Insulinnadel werden die Zellen dann direkt in denselben Kanal injiziert, der von der ersten Nadel erzeugt wird. Diese Methode der Transplantation kann in verschiedenen experimentellen Designs angewendet werden, wobei entweder Mauszellen oder menschliche Zellen als Spenderzellen verwendet werden. Es wird am häufigsten für die Xenotransplantation verwendet, da in diesem Zusammenhang angenommen wird, dass es eine verbesserte Transplantation gegenüber intravenösen Injektionen ermöglicht, wodurch die statistische Aussagekraft verbessert und die Anzahl der zu verwendenden Mäuse reduziert wird.
Einleitung
Blut hat eine der höchsten Regenerationsraten im menschlichen Körper und produziert 1 × 1012 Zellen pro Tag im erwachsenen menschlichen Knochenmark1. Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) garantieren die Blutproduktion über die gesamte Lebensspanne durch den Prozess der Hämatopoese und zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, alle Blutzelltypen zu produzieren (Multipotentialität) und sich gleichzeitig selbst zu erhalten (Selbsterneuerung). In der Vergangenheit beruhte der Goldstandard für die Prüfung der Funktion eines HSC immer auf der Transplantation, bei der die Fähigkeit einer Spenderpopulation getes....
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Protokoll
Alle hier vorgestellten Tierversuche entsprechen dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations 2012 und wurden nach ethischer Prüfung und Genehmigung durch das Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) der University of Cambridge durchgeführt. Weibliches NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse im Alter zwischen 12 und 16 Wochen (~21-30 g), die im eigenen Haus gezüchtet und in einer spezifisch-pathogenfreien Tierhaltung gehalten wurden, wurden für intrafemorale Injektionen verwendet. Anonymisierte CB-Proben wurden von gesunden Spendern nach Einverständniserklärung der Cambridge Blood....
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Ergebnisse
Die Transplantation der intrafemoral injizierten Zellen kann je nach Versuchsdesign jederzeit ab 24 h beurteilt werden. Zum Endzeitpunkt können IF, BM, PB und Milz erfasst werden. Diese können verarbeitet und der Grad der Transplantation mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden. Um eine humane Transplantation auch bei niedrigen Konzentrationen robust bezeichnen zu können, haben wir mit zwei unterschiedlichen Antikörpern gegen humanes CD45 gefärbt (Klon HI30 und Klon 2D1). Nur Zellen, die für beide Antikörper (CD45
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Diskussion
Intrafemorale Injektionen sind ein nützliches Instrument bei der Xenotransplantation, wenn nur eine kleine Anzahl von HSPCs verfügbar ist, und bieten im Vergleich zu intravenösen Injektionen eine verbesserte Transplantation. Die Technik erfordert jedoch Geschicklichkeit und Training. Beim Üben empfehlen wir, frische Leichen im richtigen Gewichtsbereich (siehe unten) zu verwenden und einen farbigen Farbstoff (z. B. Trypanblau) zu injizieren, damit bei der Dissektion klar ist, ob die Injek.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Die Autoren danken der Gruppe von Dr. John Dick für frühere Arbeiten an dieser Methode und Monica Doedens für die Ausbildung. Wir danken der Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB), insbesondere Dr. Joanna Baxter und dem Team von CBSB-Krankenschwestern, die zugestimmt und Nabelschnurblutproben entnommen haben; unsere Probenspender; der Biomedizinische Dienst der Universität, insbesondere Nicolas Lumley und die Mitarbeiter des Anne McLaren Building für die Wartung unserer Mäusestämme und die Unterstützung unserer In-vivo-Experimente ; Shaaezmeen Basheer für die Redaktion des Manuskripts.
E.L. w....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 mL Insulinspritze mit 29 g x 12,7 mm Nadel | BD | 324892 | |
| 1 mL Insulinspritze mit 29 g x 0,5" Nadel | BD | 324827 | |
| 1,5 mL Tube | Fisherbrand | 509-GRD-PFB | |
| 3 mL Spritze | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
| 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Kappe für das Zellsieb 12 x 75 mm | Falcon | 352235 | FACS Röhrchen |
| 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappverschluss 12 x 75 mm | Falcon | 352058 | FACS Röhrchen |
| 27 G 1/2" Nadel | BD | ||
| 40 µ m Zellsieb für 50 mL Röhrchen | Greiner Bio-one | 542040 | |
| 50 mL Röhrchen | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
| 96 Well Rundbodenplatte | Falcon | 351177 | |
| Alkoholtupfer | VITREX MEDICAL A/S | ||
| BD LSR Fortessa X-20 Zellanalysator | BD-Durchflusszytometer | ||
| Buphrenorphin | Animalcare | XVD190 | |
| CD14/PECy7 (Klon M5E2) | biolegend | 301814 | Wird bei 1 zu 1000 |
| CD19/Alexa 700 (Klon HIB19) | verwendet 302226 biolegend | Wird bei 1 zu 300 | |
| CD19/FITC (Klon HIB19) | biolegend | 302206 | Wird bei 1 zu 200 |
| CD3/APCCy7 ( Klon HIT3a) | biolegend | 300318 | Verwendung bei 1 zu 100 |
| CD33/APC (Klon P67.6) | BD | 345800 | Verwendung bei 1 zu 200 |
| CD45/BV510 (Klon HI30) | biolegend | 304036 | Verwendung bei 1 zu 500 |
| CD45/PECy5 (Klon 2D1) | biolegend | 368526 | Verwendung bei 1 zu 300 |
| CompBeads Anti-Maus Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | ||
| Dnase 1 | Worthington Biochemisches | LS002139 | |
| fötales Rinderserum (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| Glycophorin A (GlyA)/PE (Klon GA-R2) | BD | 340947 | wird bei 1 von 1000 |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | verwendetPAN-Biotech | P04-20250 | |
| Isofluran (IsoFlo 100% w/w Inhalationsdampf, flüssig) | Zoetis | 115095 | |
| Microvette 300 Lithium-Heparin LH, 300 & Mikro; L | Sarstedt Ltd | 20.1309 | Maus-Blutentnahmeröhrchen |
| NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse | Charles River | ||
| Pancoll human, Dichte: 1.077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 14190169 |
Referenzen
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Laurenti, E., Göttgens, B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
