Methodenartikel

Ein Workflow zur quantitativen Bewertung der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

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27. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet einen zuverlässigen und effizienten Arbeitsablauf von der Probenentnahme bis zur Datenanalyse für die Profilierung der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiome in der Rinde von Populus trichocarpa.

Zusammenfassung

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Mikroorganismen, die Pflanzenoberflächen und inneres Gewebe besiedeln, können vorteilhafte Funktionen bei der Förderung des Pflanzenwachstums und der Pflanzengesundheit haben. Die Informationen über das Mikrobiom des Rindengewebes von Gehölzen sind jedoch nach wie vor begrenzt, insbesondere hinsichtlich der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiota der Rinde von Populus. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir einen Workflow zur Quantifizierung der Zusammensetzung und Diversität der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiota etabliert, die die Rinde von Populus trichocarpa besiedeln. Kurz gesagt, die Epidermis des Stängels von P. trichocarpa wurde wiederholt mit einem Wattebausch abgewischt, der in 0,1 % Tween 20 getaucht war, um epiphytische Bakterienproben zu gewinnen. Die abgestreifte Epidermis wurde sterilisiert und dann wiederholt eingefroren und mit flüssigem Stickstoff bzw. einem Rührbesen zerkleinert, um endophytische Bakterienproben zu sammeln. Die genomische DNA wurde aus den an Baumwolle anhaftenden epiphytischen Bakteriengemeinschaften und der zerkleinerten Rinde von P. trichocarpa extrahiert und einer Ploymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation mit Primern unterzogen, die auf die hypervariablen V5-V7- und V4-Regionen des bakteriellen 16S rRNA-Gens abzielen. Drei Repliken der erhaltenen PCR-Produkte jeder endophytischen oder epiphytischen Probe wurden in gleichen Konzentrationen gemischt, um die Amplikonbibliothek aufzubauen, die dann sequenziert wurde. Die erhaltenen Sequenzen wurden durch Sequenzspleißen, Qualitätsfilterung, Chimärenentfernung und taxonomische Annotationen analysiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir einen zuverlässigen und effizienten Workflow von der Probenentnahme bis zur Datenanalyse zur Bestimmung der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von P. trichocarpa durch 16S rRNA-Genprofilierung etabliert haben. Zusammen mit den in der vorherigen Studie etablierten Methoden zur Erforschung der Mikrobiota, die Rinde besiedeln, kann unsere Methodik als Blaupause für die Entwicklung von Protokollen zur Untersuchung des Rindenmikrobioms anderer Gehölzarten, insbesondere wirtschaftlich wichtiger Bäume von Wäldern, dienen.

Einleitung

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Die Rinde ist die äußerste Schicht der Stängel von Gehölzen und bezieht sich auf alle Gewebe außerhalb des Gefäßkambiums, einschließlich des Phloems und des Periderms 1,2. Umfangreiche Forschungen haben gezeigt, dass Rinde eine zentrale Rolle bei der Translokation von Wasser und Kohlenhydraten, beim Schutz von Bäumen vor Feuer und mechanischen Schäden3 und bei der Anpassung an abiotische4und biotische Belastungen5 spielt. Noch wichtiger ist, dass die Rinde als Schnittstelle zwischen einem Baum und der umgebenden Luft auch als einzigartiger Lebensraum für Mikroorganismen dient6. Insbesondere wurde bestätigt, dass rindenassoziierte Mikroben die Funktionen besitzen, das Wirtswachstumzu fördern 7, Bäumen bei der Nährstoffaufnahmezu helfen 8, die Hormonsynthese der Pflanzen zu verbessern9 und den Wirt vor Phytopathogeninfektionen zu schützen5. Den mikrobiellen Gemeinschaften, die die Rinde besiedeln, wurde jedoch weit weniger Aufmerksamkeit geschenkt als den Mikrobiota der Phyllosphäre und der Rhizopscher10,11. Es gibt nur begrenzte Kenntnisse über die biologischen Eigenschaften des Mikrobioms der Baumrinde. Das Ziel des vorliegenden Methodikpapiers ist es, den Forschern eine Reihe von Protokollen zur Beschreibung der Diversität und Zusammensetzung des endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobioms der holzigen Pflanzenrinde zur Verfügung zu stellen.

Auf der Grundlage der in dieser Arbeit veröffentlichten Methoden zur Untersuchung der Rindenmikrobiota12,13 haben wir einen ausgeklügelten Arbeitsablauf auf der Grundlage einer 16S rRNA-Genamplikon-Sequenzierungsanalyse entwickelt und getestet, um das bakterielle Mikrobiom zu untersuchen, das das innere Gewebe oder die Oberflächen der Stammrinde von Populus trichocarpa, einem wichtigen Modellorganismus, der in der Gehölzpflanzenbiologie verwendet wird, absetzt14. P. trichocarpa zeichnet sich durch schnelles Wachstum15, relativ einfache experimentelle Manipulation16 und einfache genetische Transformation aus und ist auch für seine breite Anwendung in der Holzproduktionbekannt 17. Konkret beginnt die in dieser Arbeit vorgeschlagene Methode mit einer detaillierten Beschreibung der Probenahme der endophytischen und epiphytischen Mikrobiota der Stammrinde von P. trichocarpa. Unter Einbeziehung eines Schritts zur Oberflächensterilisation der Rinde mit Alkohol und Natriumhypochlorit nach der Entnahme des Mikrobioms, das die Oberfläche besiedelt, etablierte diese Studie ein Verfahren zur gleichzeitigen und getrennten Sammlung von Mikroorganismen, die sich in der inneren Struktur der Rinde (Endophyten) und solchen, die auf der äußeren Oberfläche der Rinde leben (Epiphyten). Nach bestem Wissen und Gewissen wurden in den veröffentlichten Studien über das Mikrobiom der holzigen Pflanzenrinde keine Assays an den endophytischen und epiphytischen mikrobiellen Gemeinschaften durchgeführt, die aus derselben Rindenprobe entnommen wurden, basierend auf einer klaren Unterscheidung zwischen den inneren und äußeren Nischen der Rinde 18,19,20. Die in dieser Forschung entwickelte Methode wird es den Forschern ermöglichen, die Vielfalt und die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften, die die Rinde bewohnen, präzise und umfassend zu untersuchen. Darüber hinaus enthält diese Studie detaillierte Beschreibungen der Verfahren für die genomische DNA-Extraktion, die Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Vorbereitung der 16S rRNA-Genamplikon-Sequenzierungsbibliothek21 und die Analyse von Sequenzierungsdaten. Insbesondere wurde in dieser Studie ein Primerpaar verwendet, das auf die hypervariablen V5-V7-Regionen des bakteriellen 16S rRNA-Gens abzielte, um die unspezifische Amplifikation der mitochondrialen und Chloroplastensequenzen der Wirtspflanzenzu reduzieren 22, was zu unverzerrten Profilen des rindenassoziierten Mikrobioms führte. Die α-Diversitäten wurden unter Verwendung des Shannon-Index23 bewertet, einem populären Diversitätsindex, der in der Ökologieforschung weit verbreitet ist, und die taxonomische Zusammensetzung auf Stammebene wurde in den Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24und der R-Software25 berechnet und visualisiert. Zusammen mit den in der vorangegangenen Studie 1,6 etablierten Methoden zur Erforschung der Mikrobiota, die Rinde besiedeln, kann unsere Methodik als Blaupause für die Entwicklung von Protokollen zur Untersuchung des Rindenmikrobioms anderer Gehölzarten, insbesondere wirtschaftlich wichtiger Waldbäume, dienen.

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Protokoll

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1. Probenentnahme

  1. Züchte die 3 Monate alte P. trichocarpa-Setzlinge in einer Wachstumskammer (21–25°C; 16 h Licht/8 h Dunkelzyklus mit zusätzlichem Licht von ca. 300 μEm−2 s−1 von einer linearen Dreiband-Leuchtstofflampe [T5 28 W 6400 K]; und 60–80 % Luftfeuchtigkeit)26.
  2. Schneide die 10 cm langen Stielsegmente von P ab. trichocarpa von 2–12 cm über der sterilisierten Bodenoberfläche (Abbildung 1A) mit einem sterilisierten Hochentaster. Legen Sie die Stängelsegmente in eine sterilisierte quadratische Petrischale (13 cm x 13 cm).
    HINWEIS: Für diese Studie wurden sechs Bäume gleicher Größe ausgewählt, von denen drei für die PCR-Amplifikation mit jedem Primer-Set verwendet wurden.

2. Probenverarbeitung

  1. Wischen Sie die Epidermis des Stängels wiederholt mit einem sterilen, in 0,1 % Tween 20 getauchten Wattestäbchen auf der sterilisierten quadratischen Petrischale ab, um die Mikroorganismen, die sich auf den Rindenoberflächen ansiedeln, effizienter zu sammeln (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Subfeuchte sterile Baumwolle wird verwendet, um Mikroorganismen zu sammeln, die an der Stängeloberfläche haften. Verwenden Sie keine zu trockene oder zu nasse Baumwolle, wenn Sie die Stieloberfläche abwischen. Tween 20 ist ein Tensid, das in der Lage ist, die Oberflächenspannung zu reduzieren, eine Eigenschaft, die für die Gewinnung von mehr mikrobiellen Proben von Pflanzenoberflächen von Vorteil ist27,28.
  2. Schneiden Sie das Wattestäbchen mit einer sterilen Klinge vom Tupfer ab und legen Sie jedes Wattestäbchen mit epiphytischen mikrobiellen Proben in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Proben bei -80 °C.
  3. Nachdem Sie die Stängeloberfläche abgewischt haben, schneiden Sie die Rinde, von der die epiphytischen Mikroorganismen entnommen wurden, mit einem sterilen Skalpell auf, schälen Sie die Rinde ab und legen Sie sie in eine quadratische Petrischale.
  4. Schneiden Sie die in Schritt 2.3 vom Stiel abgestreifte Rinde mit einem sterilen Skalpell in ca. 1 cm große Segmente (Abbildung 1C).
  5. Sterilisieren Sie die Segmente, indem Sie sie 2 Minuten lang in 70%igem Alkohol einweichen. Anschließend die Segmente 5 min lang in Natriumhypochlorit (2,5 % effektiver Chlorgehalt) mit 0,1 % Tween 80 einweichen.
  6. Die in Schritt 2.5 erhaltenen Segmente werden 30 s lang in 70 % (v/v) Alkohol29 sterilisiert. Waschen Sie dann alle Proben dreimal mit sterilem destilliertem Wasser und legen Sie sie zum Lufttrocknen auf eine saubere Bank.
    HINWEIS: Die Rindenproben werden mit einer sterilen Pinzette hin und her gerührt, um eine ausreichende Oberflächensterilisation zu gewährleisten.
  7. Jedes oberflächensterilisierte Stängelrindensegment (endophytische Proben) wird in einem sterilen 2-ml-Zentrifugenröhrchen bei -80 °C gelagert.

3. Extraktion genomischer DNA

  1. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die Proben für die DNA-Extraktion vorzubehandeln.
    1. Die in Schritt 2.7 erhaltenen oberflächensterilisierten Stängelrindensegmente werden in sterile 5-ml-Hartröhrchen gegeben und in jedes Röhrchen drei sterilisierte Stahlkügelchen (4 mm) gegeben.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank durch, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Die in Schritt 2.2 (epiphytischen Proben) hergestellten Wattebällchen müssen nicht vorverarbeitet werden und werden direkt für die genomische DNA-Extraktion verwendet.
    2. Frieren Sie die harten Röhrchen mit den Proben 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff ein.
    3. Zerkleinern Sie die Rindenproben 5 Minuten lang mit einem Rührer. Frieren Sie dann das harte Rohr erneut 1 Minute lang in flüssigem Stickstoff ein und wiederholen Sie den Schritt des Perlenschlagens für 5 Minuten.
  2. Extrahieren Sie genomische DNA.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein kommerzielles DNA-Extraktionskit, um genomische DNA aus den endophytischen und epiphytischen Proben zu isolieren.
    1. Fügen Sie die zerkleinerte Stängelrinde von P hinzu. Trichocarpa und die an Baumwolle haftenden epiphytischen Bakteriengemeinschaften (je 0,25 g) an jedes der Perlenröhrchen. Fügen Sie dann 60 μl Lösung C1 hinzu, die in einem handelsüblichen Kit enthalten ist, und mischen Sie vorsichtig durch Inversion.
    2. Als nächstes homogenisieren Sie die endophytischen und epiphytischen Proben mit einem Bead Beater in vier 1-minütigen Durchläufen. Legen Sie die Proben nach jedem Lauf für 30 s auf Eis.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 min.
    4. Entnehmen Sie die endophytischen und epiphytischen Proben mit einem Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    5. 30 μl Lösung C6 in die Mitte der weißen Filtermembran geben und 5 min bei 25 °C inkubieren.
    6. Bei 10.000 x g bei Raumtemperatur 1 min zentrifugieren.

4. PCR-Amplifikation

  1. Standardisieren Sie die extrahierte DNA-Konzentration.
    1. Messen Sie die Konzentrationen der genomischen DNA, die aus epiphytischen und endophytischen Proben extrahiert wurde, mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer.
    2. Verdünnen Sie jede DNA-Probe mit sterilem ddH2O bis 2 ng/μl, um das DNA-Template für die PCR-Amplifikation zu erhalten.
  2. Amplifizieren Sie diese DNA-Proben.
    1. Amplifizieren Sie die V5-V7-Region des bakteriellen 16S rRNA-Gens mit dem Forward-Primer 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') und dem Reverse-Primer 1193R (5'-ACGTCATCCCCCCCCCCCC-3') 10. Amplifizieren Sie die V4-Region des bakteriellen 16S rRNA-Gens mit dem Forward-Primer 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') und dem Reverse-Primer 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      HINWEIS: Die aus jeder Probe extrahierte genomische DNA wird als Vorlage für jede der dreifachen PCR-Amplifikationsreaktionen verwendet, und eine zusätzliche Reaktion, die keine DNA enthält, wird als Negativkontrolle festgelegt. Für jede Probe beträgt das Volumen des PCR-Reaktionsgemisches 25 μl. Für das Primerpaar 799F/1193R enthält jede Reaktion 12 μl PCR-Wasser, 1 μl jedes der F/R-Primer (10 μM), 1 μl DNA-Template und 10 μl Mischlösung. Für das Primerpaar 515F/806R enthält jede Reaktion 12 μl PCR-Wasser, 1 μl jedes F/R-Primers (10 μM), 1 μl DNA-Template und 10 μl Mischlösung. PCR-Reaktionen mit dem Primerpaar 799F/1193R werden unter den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 5 min, 25 Zyklen von 98 °C für 30 s, 53 °C für 30 s und 72 °C für 45 s und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Die PCR-Reaktionen mit dem Primerpaar 515F/806R werden unter den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: initiale Denaturierung bei 94 °C für 3 min, 35 Zyklen bei 94 °C für 45 s, 50 °C für 60 s und 72 °C für 90 s und eine abschließende Verlängerung für 10 min bei 72 °C.
    2. Mischen Sie jede Probe gründlich und zentrifugieren Sie, um Blasen zu entfernen.
    3. Führen Sie die Amplifikation der V5-V7- oder V4-Region der bakteriellen 16S rRNA-Gene auf einem Thermocycler durch.
  3. Erkennen Sie die amplifizierten Produkte.
    1. Laden Sie 5 μl jedes Amplikons auf ein 1%iges Agarosegel und führen Sie eine Elektrophorese bei 120 V für 30 Minuten durch.
    2. Betrachten Sie das Gel unter UV-Licht, um die erfolgreiche PCR-Amplifikation zu validieren. Die Größen der PCR-Produkte, die mit den Primerpaaren 799F/1193R und 515F/806R erhalten werden, sollten etwa 430 bp bzw. 400 bp betragen.

5. Vorbereitung der Amplikon-Sequenzierungsbibliothek

  1. Mischen Sie die amplifizierten Produkte und bestimmen Sie ihre Konzentrationen.
    1. Mischen Sie die Produkte, die aus den drei Replikaten der PCR-Amplifikation für jede Probe erzeugt wurden, in einem PCR-Röhrchen.
    2. Geben Sie 5 μl der PCR-Produkte und 195 μl Arbeitslösung in eine Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Kit (siehe Materialtabelle). Geben Sie anschließend 10 μl der Standard-DNA (DNA-Reagenzien mit Konzentrationen von 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 ng/μl aus dem Kit) und 190 μl Arbeitslösung in eine Vertiefung derselben Mikroplatte. Bestimmen Sie nach diesem Schritt die Fluoreszenzintensität der PCR-Produkte und der Standard-DNA.
    3. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader.
      HINWEIS: Die Anregung/Emission von Standard-Fluoreszein-Wellenlängen ist auf 480/530 nm eingestellt, um die Menge der doppelsträngigen DNA in jeder Probe zu messen.
    4. Die Standardkurve der DNA-Konzentrationen und Fluoreszenzintensitäten wird unter Verwendung der Standard-DNA-Konzentrationen der Standard-DNA-Lösungen (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 ng/μl) und der Fluoreszenzintensität jeder der Standard-DNA-Lösung festgelegt. Setzen Sie den Fluoreszenzintensitätswert jedes PCR-Produkts in die Standardkurve ein, um die DNA-Konzentrationen der PCR-Produkte zu berechnen.
  2. Erstellen Sie Amplikon-Sequenzierungsbibliotheken.
    1. Entsprechend den in Schritt 5.1.4 ermittelten Konzentrationen werden die verbleibenden PCR-Produkte, die mit demselben Primerpaar amplifiziert wurden, in gleichen Konzentrationen gemischt, um die Amplikon-Sequenzierungsbibliothek aufzubauen.
      HINWEIS: Der Anteil der PCR-Produkte jeder Probe, der zur Quantifizierung der Konzentration der doppelsträngigen DNA durch Messung der Fluoreszenzintensität verwendet wird, ist nicht in der Amplikon-Sequenzierungsbibliothek enthalten, die aus den restlichen PCR-Produkten derselben Probe aufgebaut wird.
  3. Führen Sie eine Gelextraktion durch.
    1. Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese mit einem Elektrophoresegerät durch. Bereiten Sie kurz ein 1,3%iges Agarosegel vor (d. h. 1,3 g Agarosepulver in 100 ml 1 x TAE-Puffer).
      HINWEIS: Es wird darauf geachtet, dass die Menge der Vertiefungen im Gel ausreicht, um jedes PCR-Produkt und jede DNA-Leiter aufzunehmen. In dieser Studie wird 1,3% Agarosegel hergestellt, indem 1,3 g Agarosepulver in 100 ml 1 x TAE-Puffer aufgelöst werden.
    2. Entfernen Sie die Waben nach der Gelverfestigung und geben Sie das Gel in einen Elektrophoresetank mit 1 x TAE-Puffer. Fügen Sie als Nächstes 1 Volumeneinheit von 6 x orangefarbenem Ladepuffer zu 5 Volumeneinheiten jedes PCR-Produkts hinzu, wobei 100 μl des letzteren in jede Vertiefung geladen werden. Geben Sie 30 μl der DNA-Leiter in eine Vertiefung. Nach dem Anschließen des Plus- und Minusdrahtes eine Elektrophorese bei 80 V für 50 min durchführen.
      HINWEIS: In dieser Studie wird die Gelextraktion eingesetzt, um die Amplikon-Sequenzierungsbibliothek zu reinigen, die durch die Bande von 400 bp oder 430 bp dargestellt wird, die mit dem Primerpaar 515F/806R bzw. 799F/1193R amplifiziert ist.
    3. Entfernen Sie DNA-Fragmente aus dem Agarosegel mit einem sauberen, scharfen Skalpell.
    4. Wiegen Sie die Gelscheibe und geben Sie sie in eine farblose Tube. Fügen Sie Puffer hinzu, um die Gelscheibe einzutauchen.
      HINWEIS: Die maximale Menge an Gel pro Spin-Säule beträgt 400 mg. Drei Volumeneinheiten Puffer werden zu einer Volumeneinheit einer gegebenen Gelscheibe hinzugefügt.
    5. Führen Sie die Gelextraktion mit dem Gelextraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      HINWEIS: Die Amplikonbibliothek, die aus den Produkten der PCR hergestellt wurde, die auf das bakterielle 16S rRNA-Gen abzielen, das für die Sequenzierung der endophytischen und epiphytischen Bakteriengemeinschaften verwendet wird, wird mit dieser Methode erhalten.
  4. Bestätigen Sie die Qualität der gereinigten Amplikon-Sequenzierungsbibliothek.
    1. Bestimmen Sie die Konzentration doppelsträngiger DNA in der gereinigten Amplikon-Sequenzierungsbibliothek, die in Schritt 5.3.5 erhalten wurde, mit einem Fluorometer unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (siehe Materialtabelle) gemäß dem Protokoll des Herstellers (Abbildung 2).
    2. Bestimmen Sie die Größe des Ziel-DNA-Fragments der in Schritt 5.3.5 erhaltenen Amplikon-Sequenzierungsbibliothek unter Verwendung eines Nukleinsäure-Qualitätskontrollanalysesystems mit kommerziellen Chips und Kits (siehe Materialtabelle) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Fragmentgröße innerhalb des erwarteten Bereichs liegt und sich keine Primer-Dimere in der Amplikon-Sequenzierungsbibliothek befinden.
    3. Bestimmen Sie die effektive Konzentration der in Schritt 5.3.5 erhaltenen Sequenzierungsbibliothek unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) mit einem kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    4. Verdünnen Sie die Amplikon-Sequenzierungsbibliothek, um die für die Sequenzierplattform empfohlene Beladungskonzentration zu erreichen.

6. Sequenzverarbeitung und statistische Analyse

  1. Nach der Sequenzierung der in Schritt 5.4.4 erhaltenen Amplikonbibliothek unter Verwendung einer Sequenzierplattform (siehe Materialtabelle)31. Erstellen Sie im Arbeitsverzeichnis einen Ordner mit dem Namen emp-paired-end-sequences, und speichern Sie dann die komprimierte Sequenzierungsdatei im fastq-Format in diesem Ordner. Öffnen Sie dann Ubuntu und aktivieren Sie die conda-Umgebung und Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Schreiben Sie eine Zuordnungsdatei, und speichern Sie sie als Textdatei. Der Inhalt der Datei ist in Tabelle 2 dargestellt.
  3. Teilen Sie die mit der Amplikon-Sequenzierungsbibliothek erhaltenen Sequenzierungsdaten auf und entfernen Sie Primer aus den Sequenzierungsdaten mithilfe der Mapping-Datei.
    1. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um die Sequenzierungsdaten aufzuteilen: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um Primer zu entfernen: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F oder 515F --p-front-r 1193R oder 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Sieben und entfernen Sie alle Chimären mit der DADA2-Pipeline33. Gruppieren Sie die gefilterten Sequenzen in Amplikonsequenzvarianten (ASVs) mit einer Ähnlichkeit von 99 %.
    1. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um Chimären- und Cluster-Sequenzen in ASVs zu filtern und zu entfernen: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Taxonomische Annotationen mit der SILVA-Datenbank (v138) auf der Grundlage der Referenzsequenzen34 vornehmen.
    1. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um die in Schritt 6.4 erhaltenen ASVs zu kommentieren: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Erstellen Sie eine ASV-Tabelle in QIIME2 (v2021.2) mit den folgenden Befehlen:
    qiime tools export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taxonomie --sc-separated taxonomy
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key Taxonomie
    HINWEIS: Mit diesen Befehlen wird eine Tabelle generiert, die die Anzahl der Lesevorgänge aller ASVs für jede Probe enthält.
  7. Berechnen Sie die Anzahl der ASVs und Reads der endophytischen und epiphytischen Bakteriengemeinschaften, die mit den Primerpaaren 799F/1193R bzw. 515F/806R erzeugt wurden.
    1. Berechnen Sie die Gesamtzahl der ASVs mit ≥ 1 Messwerten auf den Ebenen Stamm, Klasse, Ordnung, Familie und Gattung in jeder Probe in der ASV-Tabelle, die in Schritt 6.6 erhalten wurde, durch Zählen.
    2. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Lesevorgänge in jeder Stichprobe basierend auf der Summe der Anzahl der Lesevorgänge aller ASVs in der ASV-Tabelle, die Sie in Schritt 6.6 durch Zählen erhalten haben.
    3. Berechnen Sie die Anzahl der pflanzlichen Messwerte in jeder Probe anhand der Anzahl der Lesevorgänge von ASVs, die in der in Schritt 6.6 erhaltenen ASV-Tabelle als Chloroplasten oder Mitochondrien annotiert sind, indem Sie zählen.
    4. Berechnen Sie die Anzahl der bakteriellen Messwerte in jeder Probe mit der folgenden Formel:
      Anzahl der bakteriellen Reads = Anzahl der gesamten Reads − Anzahl der pflanzlichen Reads.
    5. Berechnen und visualisieren Sie die durchschnittliche Anzahl von ASVs (auf den Ebenen von Stamm, Klasse, Ordnung, Familie bzw. Gattung) oder Lesevorgänge (insgesamt oder von Pflanzen und Bakterien) der endophytischen und epiphytischen Bakteriengemeinschaften, die von den Primerpaaren 799F/1193R und 515F/806R erzeugt wurden, unter Verwendung von Excel (2019) und Prism (v8.0).
    6. Bewerten Sie die Signifikanz der Unterschiede zwischen der Anzahl der ASVs (auf der Ebene des Stammes, der Klasse, der Ordnung, der Familie bzw. der Gattung) oder der Reads (insgesamt oder von Pflanzen und Bakterien), die mit den Primerpaaren 799F/1193R und 515F/806R erzeugt wurden, indem Sie den Student's t-Test in der Prism (v8.0) Software verwenden.
  8. Filtern Sie die als Chloroplasten und Mitochondrien annotierten Reads mit dem folgenden Befehl: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondrien, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondrien-no-chlorplast.qza
  9. Erstellen Sie einen phylogenetischen Baum mit dem folgenden Befehl: time qiime phylogenie align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Berechnen und visualisieren Sie die Alpha-Diversitäten, die durch den Shannon-Index der endophytischen und epiphytischen Bakteriengemeinschaften dargestellt werden, unter Verwendung des QIIME2 (v2021.2) und des 'ggplot2'-Pakets in R (v4.0.5)35.
    1. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um die Alpha-Diversitäten zu berechnen: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth der niedrigste Lesewert unter allen Proben --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Berechnen Sie die relativen Häufigkeiten der Populationen auf der Stammebene der endophytischen und epiphytischen Bakteriengemeinschaften. Generieren Sie eine Datei im qzv-Format mit dem Namen "taxa-bar-plots", indem Sie den folgenden Befehl von QIIME2 (v2021.2) verwenden: time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Öffnen Sie die Datei taxa-bar-plots.qzv online unter https://view.qiime2.org/. Laden Sie die neu generierte Datei von level2 herunter und speichern Sie sie. Berechnen Sie die relative Häufigkeit nach der folgenden Formel mit R (v4.0.5):
      Relative Abundanz jedes Bakterienstammes (%) = (Anzahl der Lesevorgänge jedes Bakterienstammes in jeder Probe / Anzahl der Gesamtlesevorgänge jeder Probe) x 100 %.
      Visualisieren Sie die Daten mit den Paketen ggplot2, RColorBrewer, reshape und ggalluvial in R (v4.0.5).
  12. Analysieren Sie die Signifikanz der Differenz zwischen der relativen Häufigkeit jeder der dominanten Stämme (definiert als ein Stamm mit einer relativen Häufigkeit von > 0,5%) in den endophytischen und epiphytischen Bakteriengemeinschaften, die mit dem Primerpaar 799F/1193R sequenziert wurden, unter Verwendung der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Post-hoc-Test von Tukey bei einem Signifikanzniveau von 0,05 in der STAMP-Software36.

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Ergebnisse

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Hochwertige genomische DNA der endophytischen und epiphytischen bakteriellen Mikrobiome der Rinde von P. Trichocarpa wurde unter Verwendung des optimierten Protokolls erhalten (Tabelle 1). Die PCR-Amplifikation aller 12 Proben ergab einzelne starke Banden mit der richtigen Größe (Abbildung 3). Beide Primerpaare 799F/1193R und 515F/806R amplifizierten erfolgreich die Zielprodukte aus endophytischen oder epiphytischen Rindengewebepr...

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Diskussion

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Der von uns vorgeschlagene Arbeitsablauf wurde auf der Grundlage der veröffentlichten Methodik zur Untersuchung der Rindenmikrobiota 7,18 entwickelt und bietet eine allgemeine Anleitung zur Identifizierung und Charakterisierung endophytischer und epiphytischer Mikrobiome der Rinde von Gehölzen. Diese Methode umfasst Protokolle für die Probenentnahme und -verarbeitung, die genomische DNA-Extraktion, die PCR-Amplifikation, die Vorb...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Herrn David Anthony Atherton für die Bereitstellung der Videokommentare und den Mitgliedern des B.N.-Labors für wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Science Foundation of China (Fördernummer 32071741 [an BN]), den Key R&D Plan Projects in der Uigurischen Autonomen Region Xinjiang (Fördernummer 2022B02014), dem "Tianchi Talents" Introduction Plan (an BN), dem National Key R&D Program of China (Fördernummer 2021YFD2200203 [an GQ]) und dem Innovationsprojekt des State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University) (Fördernummer 2019A01 [an BN]).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung:
Bead BeaterDHS Life Science401265
Zentrifuge für 1,5 mL RöhrchenThermo Scientific75002440
Zentrifuge für PCR Röhrchen
Mikroplatten-ReaderBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.2010/2020 Mikrovolumen-Spektralphotometer
Qubit 3.0 Fluorometer InvitrogenQ33216Fluorometer 
Kühlschrank (-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 ThermocyclerBio-Rad1861096Thermocycler
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313Für die Elektrophorese
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Bibliothek, Nachweis der DNA-Fragmentverteilung, Analyse der Nukleinsäure-Qualitätskontrolle
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Quantifizierungsbibliothek
Illumina Novaseq6000Illumina die Sequenzierung in der Bibliothek
:
HandschuheJede
Spitze 10 μ LAxygenTF-300-R-S
Aerosol-Barrierespitze 20μ LAxygenTF-20-R-S
Aerosol-Barrierespitze 200μ LAxygenTF-200-R-S
Aerosol-Barriere Tipr 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
Zentrifugenröhrchen 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96-well Schwarz/Transparent Mikroplatte mit flachem BodenCorning3631
WattestäbchenZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100Für die DNA-Extraktion
enzymfreies Zentrifugenröhrchen 1,5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
EthanolTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
harte Röhrchen (5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
Mikrozentrifugenröhrchen 2,0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR WasserQIAGEN17000-10
QIAquick Gel-Extraktionskit QIAGEN28704Für die Gelextraktion
Quant-iT dsDNA Assay Kits, Broad RangeInvitrogenQ33130Für die Konzentrationsbestimmung der amplifizierten Produkte und der gereinigten Amplikonbibliotheken
quadratische PetrischaleChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
StahlperlenShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
NatriumhypochloritlösungTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Dual-Protokoll-DNA-High-Sens-ReagenzienkitPerkinElmerNachweis von DNA-Bibliotheken
VAHTS-Bibliotheksquantifizierungskit für IlluminaVazyme Biotech Co., LtdNQ104Quantifizierungsbibliothek
Materialien für NA-Aerosolbarriere YXB36985 CLS760672

Referenzen

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Rindenmikrobiomendophytische Bakterienepiphytische Bakterien16S rRNA SequenzierungDNA ExtraktionPCR AmplifikationAmplikon BibliothekAgarose Gelelektrophoresemikrobielle Diversit t

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