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MLH1 Genexpression im peripheren Blut bei Darmkrebspatienten und ihre Assoziation mit Dickdarmkrebs

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DOI:

10.3791/66387

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27. September 2024

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1Oncology Department, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital, 2Department of Emergency, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht den Zusammenhang zwischen der MLH1-Genexpression im peripheren Blut und bei Dickdarmkrebs unter Verwendung eines Fall-Kontroll-Ansatzes, um die Expressionsniveaus bei Patienten mit gesunden Kontrollen zu vergleichen.

Zusammenfassung

MutL-Homolog 1 (MLH1) ist eine Komponente des heterodimeren Komplexes MutLα, der Basen-Basen-Fehlanpassungen und Insertions-/Deletionsschleifen, die durch Nukleotid-Fehleinbau verursacht werden, erkennt und repariert. In Abwesenheit des MLH1-Proteins nimmt die Häufigkeit von nicht reparierten Fehlpaarungen zu, was zu Organkrebs führt. In der aktuellen Studie wurde versucht, die MLH1-Genexpression und ihre Beziehung zur Tumorinvasion (T) und Lymphknoteninvasion (N) in Blutproben von Patienten mit Darmkrebs (CRC) zu quantifizieren. Es wurden Blutproben von 36 Darmkrebspatienten entnommen. RNA wurde extrahiert und cDNA mit einem Kit synthetisiert. Die Primer wurden mit dem Exon-Exon-Junction-Ansatz erstellt, und MLH1 - und β-Aktin-Gene wurden 3x mit Hilfe der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (Real-Time PCR) getestet. Zur Analyse der Daten wurde eine Software zur Analyse der Genexpression verwendet, und ein t-Test wurde verwendet, um die Expression von MLH1 und seine Verbindung mit T- und N-Variablen zu untersuchen. In dieser Studie wurden 36 Patienten mit Darmkrebs, darunter 15 (41,6%) Frauen und 21 (58,4%) Männer, mit einem Durchschnittsalter von 57,35 ± 4,22 Jahren und im Alter von 26-87 Jahren eingeschlossen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis der MLH1-Genexpression bei Patienten im Vergleich zu gesunden Personen abnahm und die Abnahme der Genexpression in verschiedenen Stadien der Erkrankung signifikant war. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Verringerung der MLH1-Genexpression eine wirksame Rolle bei der Entwicklung von Darmkrebs spielt.

Einleitung

Darmkrebs (Darmkrebs) ist eine der häufigsten Krebsarten. Sie ist die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit1. Darmkrebs ist bei Männern häufiger als bei Frauen, in Industrieländern drei- bis viermal häufiger als in Entwicklungsländern. Die altersstandardisierte (globale) Inzidenzrate pro 1 x 105 der Darmkrebs-Inzidenzen beträgt 19,7 bei beiden Geschlechtern, 23,6 bei Männern und 16,3 bei Frauen2. Epidemiologische Studien haben starke Umwelt- und Lebensstilassoziationen mit Darmkrebs gezeigt. Fettleibigkeit, rotes/verarbeitetes Fleisch, Tabak, Alkohol, Androgenentzugstherapie und Cholezystektomie sind alle mit einem moderat erhöhten Darmkrebsrisiko verbunden 2,3.

Chromosomale Instabilität, Mikrosatelliteninstabilität und der CpG-Inselmethylator-Phänotyp (CIMP) spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorgenese des SFB4. Früheren Studien zufolge wurden bei Patienten mit Darmkrebs etwa 250 verschiedene Mutationen identifiziert, was etwa 55 % der bekannten Mutationen im Zusammenhang mit Genen für die DNA-Mismatch-Reparatur (MMR) entspricht. Defekte in Mismatch-Reparaturproteinen können durch Keimbahnmutationen in den Genen MSH6, MLH1, PMS2 und MSH2 verursacht werden, und die meisten dieser Mutationen finden sich in den Genen MLH1 und MSH2 4,5. Das wichtigste Protein im MMR-System, das in der Regel an Darmkrebs beteiligt ist, ist MLH1. Neuere Studien haben gezeigt, dass jede Veränderung der MLH1-Expression das Risiko für Darmkrebs erhöhen kann. Keimbahnmutationen in MLH1 sind für das Lynch-Syndrom verantwortlich, eine vererbte Form von Darmkrebs. Darüber hinaus werden 13%-15% der Fälle von diffusem Dickdarmkrebs durch einen MLH1-Mangel verursacht, der auf einer somatischen Promotor-Hypermethylierung beruht 6,7,8.

Das MLH1-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 an Position 22.2 und enthält 21 Exons9. Das Protein, das vom MLH1-Gen kodiert wird, kann mit einer Endonuklease, die an der Mismatch-Reparatur beteiligt ist, PMS2, zusammenarbeiten, um MutLα zu erzeugen, das Teil des MMR-Systems ist. MutLα ist hauptsächlich an der Reparatur von Basen-Basen-Fehlpaarungen sowie Deletions- und Additionsschleifen als Folge unvollständiger DNA-Replikation beteiligt. Darüber hinaus ist das kodierte Protein an der Signalübertragung von DNA-Schäden beteiligt und kann mit dem MLH3-Protein, das an der Reparatur von DNA-Fehlanpassungen beteiligt ist, in die ɣMutL-Form umgewandelt werden, die in der Meiose beobachtet wurde 10,11,12. Studien haben gezeigt, dass MLH1 an anderen wichtigen zellulären Aktivitäten beteiligt ist, einschließlich der Regulation von Zellzyklus-Checkpoints, Apoptose, Crossover-Rekombination und mitotischer Inkompatibilität13.

Das MLH1-Gen spielt eine Schlüsselrolle im System der DNA-Mismatch-Reparatur (MMR). Ein Defekt in der Funktion dieses Gens kann zur Häufung genetischer Mutationen und in der Folge zur Entwicklung von Darmkrebs führen14. Frühere Studien haben gezeigt, dass etwa 55% der Mutationen, die mit MMR-Genen bei Patienten mit Darmkrebs assoziiert sind, mit MLH1-Genmutationen zusammenhängen. Darüber hinaus kann eine verminderte MLH1-Genexpression zum Lynch-Syndrom führen, einer vererbten Form von Darmkrebs 15,16. Außerdem wurde ein MLH1-Gendefekt auf der Grundlage einer somatischen Promotor-Hypermethylierung bei 13 % bis 15 % der sporadischen Darmkrebsfälle beobachtet17. Diese wissenschaftlichen Erkenntnisse zeigen, dass das MLH1-Gen als wichtiger Biomarker bei Darmkrebs fungiert und seine Expressionsanalyse wertvolle Informationen über die Funktion des MMR-Signalwegs und das genetische Risiko von SFB18 liefern kann. Die Messung der MLH1-Expressionsniveaus im peripheren Blut von Patienten mit Dickdarmkrebs kann wertvolle Informationen über die Funktionalität des MMR-Signalwegs liefern, der bei Dickdarmkrebs häufig gestört ist. Diese Methode kann zu prognostischen Zwecken und zum Verständnis der genetischen Anfälligkeit für Darmkrebs eingesetzt werden19,20. Eine Studie über den Zusammenhang zwischen der G-zu-C-Mutation des MLH1-415-Locus und sporadischem Darmkrebs bei chinesischen Patienten ergab, dass die Häufigkeit des MLH1 C/C-Genotyps bei sporadischen Darmkrebspatienten signifikant höher war als bei Kontrollen, was auf eine genetische Anfälligkeit für sporadischen Darmkrebs bei chinesischen Patienten hindeutet21. Eine weitere Studie verglich die Genexpression von genetischen Biomarkern für Darmkrebs in peripheren Blut- und Biopsieproben von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) und unterstrich das Potenzial der Genexpressionsanalyse im peripheren Blut für das Verständnis von Biomarkern im Zusammenhang mit Dickdarmkrebs22.

In Anbetracht der wichtigen Rolle des MLH1-Gens und der in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien mit molekularer Analyse durch Profilierung der mRNA-Expression wurden Krebserkrankungen mit höherer Genauigkeit klassifiziert. Ziel dieser Studie war es, die Expression von MLH1 in peripheren Blutproben von Patienten mit Darmkrebs mittels real-time PCR quantitativ zu untersuchen und seine Beziehung zu pathologischen Faktoren, Stadien der Tumorprogression zu den Schichten der Darmwand (T) und Stadien der Invasion zu Lymphknoten (N) zu untersuchen. Diese Studie wurde an 36 Darmkrebspatienten durchgeführt, um möglicherweise quantitative Veränderungen in der Genexpression als Biomarker für das Darmkrebs-Screening, die Prognose und die Diagnose anhand von peripheren Blutproben zu etablieren.

Protokoll

Zwischen April 2021 und Mai 2023 wurde am Affiliated Hospital 2 der Nantong University eine Fall-Kontroll-Studie durchgeführt. Setzen Sie sich mit der Verwaltungsabteilung des Krankenhauses in Verbindung, um den Studienrahmen festzulegen. Die ethische Genehmigung wurde durch die Einreichung des Studienvorschlags bei der Ethikkommission der Universität Nantong eingeholt. Ethische Richtlinien wurden befolgt, um Vertraulichkeit und informierte Zustimmung zu gewährleisten.

1. Patientenrekrutierung und Studiendesign

  1. Stichprobenentnahme für den Einschluss der Teilnehmer in die Studie
    1. Untersuchen Sie die Expression des MLH1-Gens im peripheren Blut von 36 Personen mit Dickdarmkrebs und einer Kontrollgruppe. Entwickeln Sie klare Ein- und Ausschlusskriterien für die Auswahl der Teilnehmer.
    2. Rekrutieren Sie Personen, bei denen bestimmte Arten von Dickdarmkrebs diagnostiziert wurden (Rektosigmoid, Blinddarmkrebs, aufsteigender, transversaler und absteigender Dickdarmkrebs, die als kolorektale Tumoren angesehen wurden) und über eine informierte Einwilligung verfügen.
    3. Schließen Sie Personen mit anderen Krebsdiagnosen oder -erkrankungen aus, die die Genexpressionsanalyse beeinträchtigen könnten. Schließen Sie außerdem Teilnehmer aus, bei denen in den letzten 3 Monaten Bluttransfusionen in der Vorgeschichte, in den letzten 6 Monaten eine Chemotherapie oder Strahlentherapie in der Vorgeschichte, Alkohol- oder Drogenkonsum in der Vorgeschichte und Autoimmunerkrankungen oder entzündliche Darmerkrankungen in der Vorgeschichte aufgetreten sind.
  2. Kategorisierung klinischer Risikofaktoren nach dem TNM-Staging-System (Tumor, Nodes, and Metastasis) unter Berücksichtigung der Krebsmasse, der Tumorgröße und der Invasion in benachbarte Organe23,24.
    1. Unterteilen Sie verschiedene Krebsstadien (0-4) basierend auf den verfügbaren Daten aus der Pathologiedatei.
    2. Segmentieren Sie die Rate des Tumorwachstums und der Progression in den Darmwandschichten (T-Index) in vier verschiedene Gruppen (T1-4, T0-TX) und die Lymphknoteninvasion (N-Index) in vier Gruppen (N1-3, N0-NX).
  3. Bereiten Sie eine Kontrollgruppe mit gesunden Personen vor.
    1. Ordnen Sie die Kontrollgruppe in Bezug auf Alter und Geschlecht der Patientengruppe zu. Sammeln Sie detaillierte demografische Daten für jeden Teilnehmer, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
  4. Verfahren zur Einwilligung nach Aufklärung
    1. Bereiten Sie Einwilligungserklärungen vor, in denen der Zweck, die Verfahren und die potenziellen Risiken der Studie erläutert werden.
    2. Interagieren Sie mit den Teilnehmern und geben Sie ihnen ausreichend Zeit, Fragen zu stellen. Sammeln Sie unterschriebene Einwilligungserklärungen, bevor Sie mit der Probenentnahme fortfahren.

2. Extraktion und Reinigung von RNA

  1. Entnahme von peripheren Blutproben
    1. Besorgen Sie sich handelsübliche EDTA-beschichtete Röhrchen, die für den klinischen oder Laborgebrauch zertifiziert sind. Überprüfen Sie das Verfallsdatum der Tuben. Überprüfen Sie die Unversehrtheit der Tubenverpackung.
    2. Weisen Sie den Teilnehmer an, bequem zu sitzen. Entnehmen Sie mit einer sterilen Spritze 5 ml Blut aus der Vena antecubitalis. Stellen Sie sicher, dass der Teilnehmer entspannt ist und den Arm ausstreckt, um die Vene freizulegen. Füllen Sie die Blutproben sofort in die vorbereiteten Röhrchen und stellen Sie sicher, dass sie nur minimal mit Luft in Berührung kommen.
    3. Halten Sie die Proben während des Transports zum Labor bei 4 °C, um die Integrität der RNA zu erhalten.
  2. Verwenden Sie ein RNA-Blut-Mini-Kit für die RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Kurz gesagt, lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie die Vollblutprobe mit Buffer EL auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie, um die Leukozyten zu pelletieren, und verwerfen Sie den Überstand. Lysieren Sie die Leukozyten mit Buffer RLT und homogenisieren Sie das Lysat mit einer Shredder-Säule.
    2. Ethanol zum homogenisierten Lysat geben und in eine Spin-Säule überführen. Waschen Sie die Säule mit Buffer RW1 und Buffer RPE. Eluieren Sie die gereinigte RNA, indem Sie RNase-freies Wasser in die Säule geben und zentrifugieren.
  3. Bewertung der RNA-Menge und -Qualität
    1. Quantifizierung von RNA: Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die RNA-Konzentration und -Reinheit zu messen. Öffnen Sie die Software auf dem angeschlossenen Computer. Wählen Sie die Option Nukleinsäure aus dem Hauptmenü. Tragen Sie 1 μl RNA-Probe auf die Probenfläche auf.
    2. Testen Sie die Reinheit und Integrität der RNA
      HINWEIS: Die Integrität und Größenverteilung der Gesamt-RNA, die mit dem RNA-Blut-Mini-Kit gereinigt wurde, kann durch Spektralphotometrie und Gelelektrophorese überprüft werden. Ribosomale RNAs sollten als scharfe Banden oder Peaks erscheinen. Das scheinbare Verhältnis von 28S rRNA zu 18S rRNA sollte etwa 2:1 betragen. wenn die ribosomalen Banden oder Peaks einer bestimmten Probe nicht scharf sind, sondern als Abstrich in Richtung kleinerer RNAs erscheinen; Es ist wahrscheinlich, dass die Probe entweder vor oder während der RNA-Aufreinigung stark abgebaut wurde.
      1. Senken Sie für die spektrophotometrische Messung den Arm des Geräts ab und klicken Sie auf Messen , um das Verhältnis A260/A280 zu erhalten. Bewerten Sie die Reinheit der RNA-Probe mit dem Ziel eines A260/A280-Verhältnisses zwischen 1,8 und 2,0.
      2. Führen Sie eine 1%ige Agarose-Gelelektrophorese wie unten beschrieben durch.
        1. Bereiten Sie die 1%ige Agaroselösung vor, indem Sie Agarosepulver in TAE-Puffer erhitzen, bis es sich aufgelöst hat. Geben Sie Ethidiumbromid zur Agaroselösung, um eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml zu erreichen. Gießen Sie die Agarose-Ethidiumbromid-Lösung in eine Gel-Gießschale und lassen Sie sie sich verfestigen.
          HINWEIS: Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der mit RNA interkaliert, um eine Visualisierung unter UV-Licht zu ermöglichen.
        2. Mischen Sie die RNA-Proben mit Ladefarbstoff und laden Sie sie vorsichtig in die Vertiefungen des erstarrten Gels. Lassen Sie die Gelelektrophorese ca. 30 Minuten lang bei 100 V laufen, um die RNA-Fragmente nach Größe zu trennen. Visualisieren Sie die RNA-Banden, indem Sie das Gel auf einen UV-Transilluminator oder ein Bildgebungssystem legen, wodurch die mit Ethidiumbromid gefärbte RNA fluoresziert.
  4. Lagerung der extrahierten RNA
    1. Entnehmen Sie die extrahierten RNA-Proben. Aliquotieren Sie die RNA in sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 10 μl pro Aliquot. Lagern Sie die RNA-Aliquoten bei -80 °C oder niedriger.
  5. Reverse Transkription von RNA in cDNA
    1. Befolgen Sie das Protokoll des Reverse-Transkriptionskits. Tauen Sie auf und bereiten Sie die notwendigen Reagenzien auf Eis und bei Raumtemperatur vor.
    2. Führen Sie eine genomische DNA-Eliminierungsreaktion durch, um alle genomischen DNA-Kontaminationen zu entfernen.
    3. Bereiten Sie den reversen Transkriptions-Mastermix auf Eis vor, der alle Komponenten außer der Template-RNA enthält.
    4. Fügen Sie die Template-RNA aus dem DNA-Eliminierungsschritt zum Reverse-Transkriptions-Mastermix hinzu. Inkubieren Sie die reverse Transkriptionsreaktion 15 Minuten lang bei 42 °C.
    5. Inaktivieren Sie das Reverse-Transkriptase-Enzym, indem Sie es 3 Minuten lang bei 95 °C inkubieren. Verwenden Sie ein Aliquot der fertigen cDNA für die sofortige Real-Time-PCR oder lagern Sie die cDNA bei -20 °C für die spätere Verwendung.

3. Primer-Design für die Real-Time-PCR

  1. Auswahl von Zielgenen und internen Kontrollen
    1. Wählen Sie das MLH1-Gen als Ziel für die Quantifizierung, da es mit Darmkrebs assoziiert ist. Wählen Sie β-Aktin als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genexpressionsdaten aus.
  2. Designprozess des Primers
    1. Starten Sie die Primer-Design-Software und geben Sie die Gensequenz von MLH1 ein, die aus dem Ensemble- oder UCSC-Genombrowser erhalten wurde.
    2. Stellen Sie die Schmelztemperatur (Tm) für Primer zwischen 58 und 60 °C, den optimalen GC-Gehalt auf 40 % bis 60 % und die Primerlänge zwischen 18 und 24 Nukleotiden ein.
    3. Geben Sie die entworfenen Primersequenzen in die NCBI BLAST-Datenbank ein, um die Spezifität zu bestätigen.
      1. Gehen Sie auf die BLAST-Website und wählen Sie Nucleotide BLAST. Fügen Sie die Primer-Sequenzen in das Suchfeld ein und klicken Sie auf BLAST.
      2. Analysieren Sie die Ergebnisse, um sicherzustellen, dass keine Off-Target-Amplifikation vorhergesagt wird. Einzelheiten siehe Tabelle 1 .

4. Echtzeit-PCR

  1. Aufbau einer Echtzeit-PCR-Reaktion. Einzelheiten siehe Tabelle 2 .
    1. Zentrifugieren Sie die Reagenzien 5 Minuten lang bei 4 °C bei 10.000 x g , um den Inhalt am Boden der Röhrchen zu sammeln.
    2. Bereiten Sie einen Mastermix gemäß dem kommerziellen Kit-Protokoll vor, der SYBR Green, Puffer, dNTPs, MgCl2 und Taq-Polymerase enthält.
    3. Ordnen Sie den Mastermix markierten PCR-Röhrchen zu und stellen Sie so die Konsistenz des Volumens über die Proben hinweg sicher.
    4. Geben Sie das entsprechende Volumen an Vorwärts- und Rückwärtsprimern für MLH1 und β-Aktin in die jeweiligen Röhrchen.
    5. Verdünnen Sie die RNA-Proben vor der reversen Transkription auf eine konstante Konzentration von 100 ng/μl und transkribieren Sie sie mit einem reversen Transkriptionskit in cDNA.
  2. Amplifikation und Datenerfassung
    1. Legen Sie die PCR-Röhrchen in das real-time PCR-System.
    2. Programmieren Sie den Thermocycler mit den optimierten Zyklusbedingungen: 95 °C für 20 s für die Denaturierung, 54 °C für 30 s für das Glühen und 72 °C für 30 s für die Verlängerung. Einzelheiten siehe Tabelle 3 .
    3. Stellen Sie die Maschine auf 45 Zyklen ein.
    4. Überwachen Sie die Reaktion in Echtzeit über die Softwareschnittstelle des Systems und beobachten Sie die Amplifikationskurven für jede Probe.
    5. Fügen Sie eine Negativkontrolle ohne cDNA hinzu, um auf Kontamination zu prüfen. Wiederholen Sie den PCR-Lauf 3x für jede Probe, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
  3. Datenanalyse
    1. Verwenden Sie nach Abschluss der Zyklen die Software des Systems, um die Werte des Schwellenwertzyklus (Ct) zu analysieren. Exportieren Sie die Ct-Werte zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Berechnen Sie die relative Genexpression unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode 25, wobei die Daten auf die β-Aktin-Kontrolle normiert werden.

5. Immunhistochemie und genetische Analysen

  1. Durchführung von Immunhistochemie an Gewebeschnitten, um die MLH1-Proteinexpression mit den Genexpressionsniveaus zu korrelieren.
    1. Bereiten Sie Gewebeobjektträger vor und tragen Sie Anti-MLH1-Antikörper auf.
    2. Verwenden Sie einen HRP-konjugierten Sekundärantikörper und ein DAB-Substratkit (3,3'-Diaminobenzidin). Entwickeln Sie Objektträger gemäß den Anweisungen des Kits und analysieren Sie diese mit einem Lichtmikroskop.
  2. Durchführung von methylierungsspezifischen PCR- und Mikrosatelliten-Instabilitätstests zur Unterscheidung zwischen Lynch-Syndrom und sporadischem Darmkrebs.
    1. Verwende ein kommerzielles DNA-Extraktionskit. Befolgen Sie das Kit-Protokoll sowohl für Blut- als auch für Tumorgewebe.
    2. Behandeln Sie DNA mit einem Bisulfit-Umwandlungskit. Verwenden Sie methylierungsspezifische Primer, die für die MLH1-Promotorregion entwickelt wurden. Führen Sie die PCR gemäß dem Kit-Protokoll durch.
    3. Führen Sie eine Gelelektrophorese auf den PCR-Produkten durch, um den Methylierungsstatus zu visualisieren.
    4. Für die Prüfung der Mikrosatelliteninstabilität (MSI) Kapillarelektrophorese mit einem genetischen Analysator. Vergleichen Sie die Länge von Mikrosatelliten durch die Analyse von fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten.

6. Statistische Analyse

  1. Verwenden Sie kommerzielle statistische Analysesoftware für die Datenanalyse.
    1. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie einen neuen Datensatz für Genexpressions- und demografische Daten.
    2. Geben Sie die relativen Genexpressionswerte und die entsprechenden demografischen Daten in den Datensatz ein.
    3. Verwenden Sie den Kolmogorov-Smirnov-Test, um die Datennormalität zu beurteilen.
      1. Wählen Sie im oberen Menü die Option Analysieren aus, wählen Sie Nichtparametrische Tests und dann Legacydialogfelder aus.
      2. Klicken Sie auf Kolmogorov-Smirnov-Test und geben Sie die Variable für die Genexpression ein. Führen Sie den Test aus, und interpretieren Sie die Ausgabe für die Signifikanz der Verteilungsnormalität.
    4. Durchführung von T-Tests zum Vergleich der MLH1-Genexpression zwischen Patienten- und Kontrollgruppen.
      1. Wählen Sie Analyze (Analysieren), dann Compare Means (Mittelwerte vergleichen) und dann Independent Samples T Test (T-Test mit unabhängigen Stichproben) aus.
      2. Weisen Sie die Gruppenzugehörigkeit (Patient oder Kontrolle) als Gruppierungsvariable und die Genexpression als Testvariable zu. Führen Sie den Test aus, und interpretieren Sie das zweiseitige Signifikanzniveau.
    5. Berechnen Sie Faltungsänderungen in der Genexpression unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode 25.

Ergebnisse

In dieser Studie wurden 36 Patienten mit Dickdarmkrebs auf die MLH1-Genexpression im peripheren Blut und ihre Beziehung zu Dickdarmkrebs untersucht. Die Analyse demografischer Variablen zeigte, dass 15 Patienten (41,6 %) Frauen und 21 Patienten (58,4 %) Männer waren. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 57,35 ± 4,22 Jahre, und die Altersspanne lag zwischen 26 und 87 Jahren. Der Body-Mass-Index (BMI) der Patienten zeigte, dass 14 Patienten (38,8 %) einen normalen BMI (18,5 und 24,9 kg/m2) und 22 Patienten (61,2 %) keinen BMI im normalen Bereich (unter 18,5 oder über 24,9 kg/m2) hatten. Die histopathologischen Merkmale der Darmkrebsfälle stellten sich wie folgt dar: Der Tumorgrad wurde nach dem WHO-Grading-System26 klassifiziert, wobei 12 Fälle (33,3 %) gut differenziert, 18 Fälle (50 %) mäßig differenziert und 6 Fälle (16,7 %) schlecht differenziert waren. In 14 Fällen (38,9 %) wurde eine lymphovaskuläre Invasion und in 9 Fällen (25 %) eine perineurale Invasion beobachtet. Alle Patienten wiesen deutliche Resektionsränder auf. Die Ergebnisse der Untersuchung der Variablen der Tumorlokalisation zeigten, dass sich 20 Tumoren (55,5%) im Dickdarm und 16 (45,5%) im Enddarm befanden. Von allen Tumoren waren 4 Tumoren (11,1 %) kleiner als 10 mm und 32 Tumoren (88,9 %) größer als 10 mm (Tabelle 4).

Wir führten eine stratifizierte Analyse der MLH1-Promotor-Hypermethylierung und des Lynch-Syndroms durch. Von den 36 Darmkrebspatienten wiesen 10 (27,8 %) eine MLH1-Promotor-Hypermethylierung auf, während die genetische Sequenzierung 5 Patienten (13,9 %) mit Keimbahnmutationen identifizierte, die mit dem Lynch-Syndrom übereinstimmen. Die restlichen 21 Patienten (58,3 %) wiesen keine MLH1-Hypermethylierung oder Lynch-Syndrom auf, was auf einen sporadischen Darmkrebs hindeutet (Tabelle 5).

In der vorliegenden Studie wurden genetische Tests und Familienanamnese verwendet, um Fälle von erblichem MLH1-Mangel im Vergleich zu somatischem MLH1-Mangel zu identifizieren. Von den 36 Patienten hatten 12 Patienten eine familiäre Vorgeschichte des Lynch-Syndroms, und die genetische Sequenzierung bestätigte bei 5 dieser Patienten (13,9%) MLH1-Keimbahnmutationen. Die restlichen 7 Patienten mit einer Familienanamnese zeigten keine Keimbahnmutationen, sondern somatische MLH1-Defizienzen, möglicherweise aufgrund erworbener Mutationen oder epigenetischer Veränderungen, wie z.B. Hypermethylierung. Von den 24 Patienten ohne familiäre Vorgeschichte des Lynch-Syndroms hatten 15 (41,7%) einen somatischen MLH1-Mangel aufgrund von Hypermethylierung oder somatischen Mutationen. Die restlichen 9 Patienten ohne Familienanamnese wiesen normale MLH1-Expressionswerte auf, was auf andere Mechanismen hindeutet, die das Darmkrebs antreiben.

Die erbliche MLH1-Defizienzgruppe zeigte die signifikanteste Reduktion der MLH1-Expression mit einer durchschnittlichen Faltungsänderung von 0,4, was statistisch signifikant war (p <0,01). Die somatische MLH1-Defizienzgruppe zeigte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Expression mit einer durchschnittlichen Faltenänderung von 0,6 (p <0,001). Die Gruppe mit normalen MLH1-Expressionswerten zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied zur gesunden Kontrollgruppe (Tabelle 6).

Abbildung 1 vergleicht die MLH1-Genexpressionsniveaus zwischen den beiden Gruppen. Insbesondere wiesen Darmkrebspatienten im Vergleich zu gesunden Personen eine signifikant geringere MLH1-Genexpression auf (p ≤ 0,001; Abbildung 1).

Das Ausmaß der Genexpression in jedem Stadium der Erkrankung im Vergleich zu dem bei gesunden Menschen ist in Tabelle 7 dargestellt. Das Ausmaß der MLH1-Genexpression war in Stadium II (p ≤ 0,02), Stadium III (p ≤ 0,01) und Stadium IV (p ≤ 0,03) signifikant. Dies deutet auf eine Abnahme der Genexpression in diesen Stadien der Erkrankung bei kranken Menschen im Vergleich zu gesunden Menschen hin.

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Abbildung 1: MLH1-Genexpression . Vergleich der MLH1-Genexpression in Blutproben von zwei Gruppen von Darmkrebspatienten und gesunden Menschen. Die Differenz ist signifikant (p ≤ 0,001). Der verwendete statistische Test ist der unabhängige t-Test. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

FibelSequenz der GrundierungLängeTa (°C)
MLH1 Vorwärts-GrundierungTCAGGTCATCGGAGCAAGCAC2360
MLH1 Umgekehrte GrundierungCGATCTTCCTCTGTCAAGCCAC2058

Tabelle 1: In der Studie verwendete Primer. Die Sequenz der entworfenen Primer und die Länge des PCR-Produkts für das MLH1-Zielgen . Die Glühtemperatur (Ta) wird ebenfalls angegeben.

ReagenzVolumen (μL)Endkonzentration
2x PCR-Mastermix101x (gemäß den Anweisungen des Kits)
Vorwärts-Grundierung (10 μM)10,5 μM
Umgekehrter Primer (10 μM)10,5 μM
cDNA-Vorlage2100 ng/μL hypothetisch angenommen
Nukleasefreies Wasser6So stellen Sie die Lautstärke ein

Tabelle 2: Reaktionsaufbau.

45 Zyklen
PhaseTemperaturDauer
Denaturierung95 °Cca. 20 Minuten
Glühen54 °C30 Sek.
Erweiterung72 °C30 Sek.

Tabelle 3: Temperaturzyklus und Zeitaufwand für die Technik der Real-Time-PCR.

GeduldigStatus
Alter4.22 ± 57.35(26-86) Jahr
GeschlechtMännlich(58.4%) 21
Weiblich(41.6%) 15
BMInormal(38.8%) 14
Abnorm(61.2%) 22
Familiärer Darmkrebs in der Vorgeschichte(33.3%) 12
Histopathologische DiagnostikGut differenziert(33.3%) 12
Mäßig differenziert(50%) 18
Schlecht differenziert(16.7%) 6
InvasionLymphovaskulär(38.9%) 14
Perineurale(25%) 9
Andere(36.1%) 13
Resektionsränderklar(100) 36
OrtDoppelpunkt(55.5%) 20
Mastdarm(45.5%) 16
Größe< 10 mm(11.1%) 4
> 10 mm(88.9%) 32

Tabelle 4: Demografische und klinische Merkmale von Patienten.

GruppeAnzahl der PatientenProzentsatz
MLH1-Hypermethylierung1027.80%
Lynch-Syndrom513.90%
Weder2158.30%

Tabelle 5: Daten zur Hypermethylierung des MLH1-Promotors und zum Status des Lynch-Syndroms.

GruppeAnzahl der PatientenProzentsatzDurchschnittliche Fold-Änderungp-Wert
Hereditärer MLH1-Mangel513.90%0.40,01 <
Somatischer MLH1-Mangel2261.10%0.60,001 <
Normaler MLH1-Ausdruck925%0.90,05 >

Tabelle 6: MLH1-Genexpressionsniveaus bei Darmkrebspatienten. Die mittlere Faltungsänderung gibt an, wie hoch die MLH1-Genexpression im Verhältnis zur Kontrollgruppe ist. Eine Fold-Änderung von weniger als 1 deutet auf eine Verringerung der Expression hin.

BühneFalten-Wechselgeldp-Wert
AbnehmenZunahme
Stufe 01.8-0.33
Stufe I1.7-0.12
Stufe II2.2-0.02
Stufe III5.2-0.01
Stufe IV7.3-0.03

Tabelle 7: Genexpression in verschiedenen Stadien. Das relative Niveau der Genexpression in jedem der verschiedenen Stadien der Krankheit im Vergleich zu gesunden Menschen.

Diskussion

Diese Studie wurde mit dem Ziel durchgeführt, die Expression des MLH1-Gens zu untersuchen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die MLH1-Genexpression bei kranken Menschen im Vergleich zu gesunden Menschen verringert war. Basierend auf Studien zur Faltenveränderung konnte gezeigt werden, dass die Expression des MLH1-Gens im Stadium II, III und IV bei kranken Menschen im Vergleich zu gesunden Menschen signifikant abnahm.

Darmkrebs ist aufgrund seiner Prävalenz und Überlebensrate weltweit ein großes Problem bei der Behandlung von Krebs 3,27. In Anbetracht der Tatsache, dass die Lebenserwartung einiger Patienten mit Darmkrebs nicht einmal 5 Jahre erreicht und auch die Bedürfnisse von Patienten mit Krebs in den verschiedenen Jahren nach der Diagnose unterschiedlich sind, ist eine vollständige Abklärung des Darmkrebses ein wesentliches Bedürfnis28,29.

In der Zwischenzeit kann die Einführung rein spezifischer molekulardiagnostischer Tests zusammen mit klinischen Symptomen eine wirksame Hilfe sein, um Risikopersonen und sogar Menschen ohne klinische Symptome von Darmkrebs zu diagnostizieren30,31. Defekte in Mismatch-Reparaturproteinen können durch Mutationen in Genen wie MLH1 entstehen. Das wichtigste Protein der DNA-Mismatch-Reparatur, das an Darmkrebs beteiligt ist, ist MLH132,33.

Studien zufolge ist das MLH1-Gen mit vielen Krebsarten verwandt, darunter Darm-, Magen-, Speiseröhren- und Gebärmutterhalskrebs34. Das MLH1-Gen spielt eine wesentliche Rolle bei der DNA-Reparatur und hilft, Fehler zu korrigieren, die während der DNA-Replikation zur Vorbereitung der Zellteilung auftreten35. Daher kann eine bessere Identifizierung des Mechanismus und der Expression des MLH1-Gens bestimmen, wie Darmkrebs entsteht, und durch die Identifizierung dieses Mechanismus können geeignete Maßnahmen zur Vorbeugung und Behandlung von Darmkrebs ergriffen werden36.

Guo et al. führten eine Studie in China durch, mit dem Ziel, die MLH1 - und MSH2-Genexpression mit klinisch-pathologischen Merkmalen bei Darmkrebs zu untersuchen. In dieser Studie wurden klinische und pathologische Daten von 88 Patienten gesammelt, die sich einer Krebsbehandlung unterzogen. Die Faltenveränderung von MLH1 und MSH2 in den Geweben wurde mittels qRT-PCR gemessen, und die Beziehung zwischen MLH1 und MSH2 wurde anhand der pathologischen Daten der Patienten analysiert. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigten die Ergebnisse unserer Studie und zeigten, dass die Expression der Gene MLH1 und MSH2 in Krebsgeweben geringer ist als in anderen Geweben37.

In einer weiteren Studie, die von Liu et al. durchgeführt wurde, wurde die Analyse der Expression von MLH1 - und PMS2-Genen bei älteren Patienten mit Darmkrebs und deren Zusammenhang mit klinischen pathologischen Merkmalen untersucht. In dieser retrospektiven Kohortenstudie wurden ältere Patienten mit Darmkrebs von Januar 2014 bis Dezember 2018, die in ein Krankenhaus in Peking eingeliefert wurden, in zwei Gruppen, MLH1 und PMS, eingeteilt. Die pathologischen Merkmale und die Genexpression wurden in zwei Gruppen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die MLH1-Genexpression bei Patienten verringert ist und diese Abnahme der Genexpression auch in verschiedenen Krebsstadien offensichtlich ist und die Abnahme der Genexpression bei Patienten mit dem Erkrankungsalter, der schnellen Tumorprogression, der schlechten Differenzierung und dem pathologischen Staging zusammenhängt38.

Diese Abnahme der Genexpression wurde in anderen Studien in anderen Ländern gezeigt. In Studien, die in den Vereinigten Staaten39, Iran40 und Irland41 durchgeführt wurden, wurde eine Abnahme der MLH1-Genexpression bei Patienten mit Darmkrebs gezeigt.

Der derzeitige Standard beinhaltet die universelle Tumoranalyse von resezierten Darmkrebsproben unter Verwendung von IHC und molekularen Techniken. Patienten mit abnormalen IHC-Befunden werden anschließend für definitive Mutationstests überwiesen. Jüngste Entwicklungen in unserem Verständnis der Molekulargenetik haben jedoch die Screening- und Diagnosepraktiken für das Lynch-Syndrom verändert42. Eine Studie von Alipoor et al. analysierte quantitativ die MLH1-Genexpression und ihre Assoziation mit der Tiefe der Tumorinvasion (T) und der Lymphknoteninvasion (N) in Blutproben iranischer Patienten mit Darmkrebs. Die Studie ergab, dass die MLH1-Genexpression signifikant mit den T- und N-Stadien assoziiert war, was darauf hindeutet, dass die MLH1-Genexpressionsanalyse zusätzliche Informationen über die IHC-Techniken hinaus liefern könnte43. Darüber hinaus analysierte eine Studie von Halil et al. die Auswirkungen jedes spezifischen MMR-Genverlusts und die klinischen Merkmale von Patienten mit dMMR-Darmkrebs, die Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) erhielten. Die Studie ergab, dass die Gesamtansprechraten (ORRs) in den Gruppen MLH1 ± PMS2 und MSH2 ±MSH6 68 % bzw. 57,1 % betrugen, ohne statistischen Unterschied. Dies deutet darauf hin, dass die MLH1-Genexpressionsanalyse ein wertvolles Instrument zur Vorhersage des Ansprechens auf die ICI-Therapie bei dMMR-Darmkrebs-Patienten sein könnte44. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Rolle der MLH1-Genexpressionsanalyse im Darmkrebsmanagement zu validieren und in die klinische Praxis zu integrieren.

Unter Berücksichtigung der wichtigen und Schlüsselrolle des MLH1-Gens bei der Reparatur von DNA-Inkonsistenzen und in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Studien kann der Schluss gezogen werden, dass Darmkrebs mit der Abnahme der Expression des MLH1-Gens zusammenhängt. Daher gibt es mit der Verringerung der Genexpression keine Möglichkeit, den defekten Replikationszyklus zu korrigieren, und das Risiko, eine Mutation zu erzeugen, steigt. Daher wird diese Abnahme der Genexpression eine wichtige Rolle im Prozess der Krankheitsentwicklung, der Behandlung und des Endergebnisses der Krankheit für den Menschen spielen.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Verringerung der MLH1-Genexpression eine wirksame Rolle bei der Entstehung von Darmkrebs spielt. Der Punkt bei der Bedeutung dieses Gens ist jedoch seine Rolle in Krebsstadien, die die Genexpression in jedem Stadium der Krankheit reduziert. Daher kann dieses Gen in zukünftigen Studien stärker berücksichtigt werden; Denn es besteht die Möglichkeit, dass es in Zukunft eine wirksame Rolle bei der Verbesserung des Behandlungsstatus von Darmkrebs spielen kann. Auch die Durchführung weiterer Studien scheint notwendig, um andere Aspekte herauszufinden.

Zu den kritischen Schritten innerhalb des Protokolls gehört die strikte Einhaltung der RNA-Extraktions- und Reinigungsverfahren, da die Qualität der RNA für eine genaue Genexpressionsanalyse von größter Bedeutung ist. Darüber hinaus sind der real-time PCR-Aufbau und die spezifischen Zyklusbedingungen entscheidend für eine zuverlässige Amplifikation und Quantifizierung des MLH1-Gens . Modifikationen und Fehlerbehebungen der Technik wurden während der gesamten Studie behandelt. Wenn beispielsweise zunächst eine suboptimale RNA-Reinheit festgestellt wurde, wie Spektralphotometermessungen zeigten, wurde das Extraktionsprotokoll verfeinert, um zusätzliche Waschschritte zur Entfernung potenzieller Verunreinigungen einzubeziehen. Zu den Einschränkungen der Technik gehört die Abhängigkeit von peripherem Blut, das die MLH1-Expressionsniveaus in der Tumormikroumgebung möglicherweise nicht vollständig repräsentiert.

In dieser Studie analysierten wir die MLH1-Genexpression in peripheren Blutproben von 36 Darmkrebspatienten. Wir sind uns bewusst, dass diese Stichprobengröße begrenzt ist, was sich auf die statistische Aussagekraft unserer Ergebnisse auswirken könnte. Zukünftige Studien mit größeren Kohorten sind gerechtfertigt, um unsere Ergebnisse zu validieren und die Rolle der MLH1-Expression bei Darmkrebs besser zu verstehen. Darüber hinaus kann die Convenience-Sampling-Methode zu Selektionsverzerrungen führen, die möglicherweise die Generalisierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Wir möchten allen, die uns geholfen haben, dieses Forschungsvorhaben abzuschließen, unseren Dank und unsere Anerkennung aussprechen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose-Gelelektrophorese-AusrüstungBio-RadMini-Sub-Zelle GT-SystemeZur Überprüfung der RNA-Qualität
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma-AldrichE9884Wird als Antikoagulans für Blutproben verwendet
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spektralphotometer zur Bestimmung der RNA-Reinheit
BiosystemsA34322Wird für RT-PCR-Reaktionen
verwendet RNA-ExtraktionskitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Wird für die RNA-Extraktion aus Blutproben verwendet
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagenzien für RT-PCR-Experimente

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