Forschungsanwendung der laserinduzierten Stoßwelle zur Untersuchung von blast-induzierten Cochlea-Verletzungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zur Erstellung eines Tiermodells für blasteninduzierte Cochlea-Verletzungen mittels laserinduzierter Stoßwelle (LISW). Die Exposition des Schläfenbeins gegenüber LISW ermöglicht die Reproduktion der Blast-induzierten Cochlea-Pathophysiologie. Dieses Tiermodell könnte eine Plattform für die Aufklärung der Cochlea-Pathologie und die Erforschung möglicher Behandlungen für Explosionsverletzungen sein.

Zusammenfassung

Das Ohr ist das Organ, das am anfälligsten für Explosionsüberdruck ist, und Cochlea-Verletzungen treten häufig nach Explosionsbelastung auf. Eine Explosionsbelastung kann zu Schallempfindungsschwerhörigkeit (SNHL) führen, einem irreversiblen Hörverlust, der sich negativ auf die Lebensqualität auswirkt. Detaillierte Blasten-induzierte Cochlea-Pathologien, wie z. B. der Verlust von Haarzellen, Spiralganglienneuronen, Cochlea-Synapsen und Störungen der Stereozilien, wurden bereits dokumentiert. Die Bestimmung der sensorineuralen Verschlechterung der Cochlea-Cochlea nach einer Explosionsverletzung ist jedoch eine Herausforderung, da Tiere, die einem Explosionsüberdruck ausgesetzt sind, in der Regel eine Trommelfellperforation (TMP) erleiden, die gleichzeitig zu Schallleitungsschwerhörigkeit führt. Um die reine sensorineurale Cochlea-Dysfunktion zu bewerten, haben wir ein experimentelles Tiermodell der blasteninduzierten Cochlea-Schädigung unter Verwendung einer laserinduzierten Stoßwelle entwickelt. Diese Methode vermeidet TMP und begleitende systemische Verletzungen und reproduziert den Funktionsabfall der SNHL-Komponente energieabhängig nach LISW-Exposition. Dieses Tiermodell könnte eine Plattform sein, um die pathologischen Mechanismen aufzuklären und mögliche Behandlungen für die blasteninduzierte Cochlea-Dysfunktion zu erforschen.

Einleitung

Hörverlust und Tinnitus gehören zu den häufigsten Behinderungen, die bei bis zu 62 % der Veteranen gemeldet^{werden 1}. Mehrere durch Explosionen induzierte auditive Komplikationen, einschließlich Schallempfindungsschwerhörigkeit (SNHL) und Trommelfellperforation (TMP), wurden bei Personen berichtet, die einem Explosionsüberdruck ausgesetzt waren². Darüber hinaus deuten Untersuchungen an Personen, die Explosionen ausgesetzt waren, darauf hin, dass die Exposition gegenüber Explosionen häufig zu Defekten in der auditiven zeitlichen Auflösung führt, selbst wenn die Hörschwellen im normalen Bereich liegen, was als "versteckter Hörverlust (HHL)" bezeichnet ^wird3. Es ist allgemein bekannt, dass es bei der blastenbedingten Cochlea-Pathologie zu einem erheblichen Verlust von Cochlea-Synapsen zwischen inneren Haarzellen (IHCs) und auditorischen Neuronen (ANs) kommt⁴. Die synaptische Degeneration führt zu einer Beeinträchtigung der auditiven Verarbeitung und ist ein wichtiger Faktor für die Entwicklung von HHL⁵. Auditorische Organe sind also fragile Komponenten, die komplexe und hochorganisierte Strukturen enthalten. Der genaue Mechanismus, durch den Druckwellen auf zellulärer Ebene auf das Innenohr einwirken, bleibt jedoch unklar. Dies ist auf die Herausforderungen bei der Replikation der präzisen klinischen und mechanischen Feinheiten von Blastenverletzungen in Laborumgebungen und die Komplexität von blasteninduzierten Cochlea-Pathologien zurückzuführen.

Die Hauptkomponente einer Explosionsverletzung ist die Stoßwelle (SW), die durch einen schnellen und hohen Anstieg des Spitzendrucks^{gekennzeichnet ist 6}. Die Komplexität von Explosionsverletzungen wurde in zahlreichen retrospektiven Studien ausführlich untersucht ^7,8,9. Es gibt verschiedene Vorrichtungen zur Explosionserzeugung, wie z. B. Druckgas¹⁰, Stoßrohre¹¹ und Sprengstoffe kleiner Stärke¹², bei unterschiedlichen Druckniveaus. Die von neu entwickelten Geräten erzeugte Druckwellenform der SW ähnelte stark der einer tatsächlichen Explosion. Ein wichtiges Konzept bei der Etablierung eines Tiermodells für explosionsinduzierten Schallempfindungsschwerhörigkeit besteht darin, Begleitverletzungen, abgesehen von Hörschäden, zu minimieren, um den Tod von Tieren zu reduzieren. So wurden Studien zu Explosionsverletzungen entwickelt, bei denen Schockrohre miniaturisiert wurden und die Leistung präzise gesteuert werden kann, so dass exponierte Tiere selten sterben. Obwohl diese Tiermodelle in der Regel Komplikationen wie TMP entwickeln, ist die Beurteilung der Cochlea-Funktion aufgrund des gleichzeitigen Schallleitungsschwerhörverlusts schwierig². Wir haben zuvor eine gehörgeschützte Tierstudie zu Explosionsverletzungen mit Ohrstöpseln durchgeführt und keine Inzidenz von TMP¹³ festgestellt. Die Ohrstöpsel konnten schwere Cochlea-Schäden teilweise abschwächen, nicht aber die zentrale auditorische Neurodegeneration oder die Entwicklung von Tinnitus. So schützen Ohrstöpsel sowohl die Hörschnecken als auch das Trommelfell. Ein Tiermodell für blasteninduzierte reine Cochlea-Schädigung ohne TMP ist jedoch erforderlich, um die Cochlea-Pathophysiologie zu untersuchen, die durch Blastenverletzungen verursacht wird.

Zuvor haben wir ein topisches Blastenverletzungsmodell des Innenohrs bei Ratten und Mäusen mit Hilfe einer laserinduzierten Stoßwelle (LISW) ^{entwickelt14,15}. Diese Methode kann sicher und einfach auf Standardlaborniveau durchgeführt werden und wurde zur Erstellung von Modellen von Lungen- und Kopfexplosionsverletzungen verwendet^16,17. Die Energie des LISW kann durch Ändern des Lasertyps und der Laserleistung angepasst werden, wodurch der Grad der Cochlea-Schädigung kontrolliert werden kann. Das LISW-induzierte Cochlea-Verletzungsmodell ist wertvoll für die Untersuchung der Mechanismen von SNHL, die durch Blastenverletzungen verursacht werden, und für die Untersuchung möglicher Behandlungen. In dieser Studie beschreiben wir detaillierte experimentelle Protokolle zur Erstellung eines Mausmodells für blasteninduzierte Cochlea-Schäden mit LISW und zeigen die Cochlea-Degeneration, einschließlich des Verlusts von Haarzellen (HCs), Cochlea-Synapsen und Spiralganglien-Neuronen (SGNs), in einer energieabhängigen Weise bei Mäusen nach LISW-Exposition.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Defense Medical College (Genehmigung #18050) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie durchgeführt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der Tiere und ihr Leid zu minimieren.

1. Tiere

1. Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche CBA/J-Mäuse, um dieses Protokoll zu befolgen. Vor dem Experiment werden die Mäuse einem Hörfunktionstest und einer endoskopischen Beobachtung des Trommelfells unterzogen, um die Normalität sicherzustellen.
2. 27 CBA/J-Mäuse werden in drei Gruppen eingeteilt: (1) 2,0 J/^{cm 2} exponierte Gruppe (n = 9 Mäuse); (2) 2,25 J/cm² exponierte Gruppe (n = 9 Mäuse); und (3) 2,5 J/cm² exponierte Gruppe (n = 9 Mäuse). Entfernen Sie alle Ohren zur Beurteilung 1 Monat nach der LISW-Exposition.

2. Experimentelle Einstellungen der LISW-Exposition

1. Das Lasertarget ist eine schwarze Scheibe aus Naturkautschuk mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Dicke von 0,5 mm. Um den LISW-Impuls zu erhöhen, wird mit einem Acrylharz-Schweißkleber eine 1,0 mm dicke, transparente Polyethylenterephthalat-Platte (PET) mit der Oberseite des Zielbereichs verklebt. Bestrahlen Sie einen 532 nm gütegeschalteten Nd:YAG-Laser, um das LISW hinter dem Target zu erzeugen (Abbildung 1A).
2. Fokussieren Sie den Laserpuls mit einer plankonvexen Linse auf einen Punkt mit einem Durchmesser von 3,0 mm auf dem Lasertarget.
3. Verwenden Sie die LISW-Bestrahlung, um Plasma an der Bindungsfläche der beiden Materialien zu erzeugen und den Gummi zu verdampfen (plasmavermittelte Ablation), wobei der verdampfte Gummi im Hohlraum verbleibt.
4. Verwenden Sie ein Hydrophon, um die Druckwelle von LISW bei 1,0 mm unter Wasser zu messen, nicht in lebendem Gewebe. Platzieren Sie ein faseroptisches Hydrophon mit einem Durchmesser von 0,25 mm unter dem schwarzen Gummi 1,0 mm unter der Wasseroberfläche, um die LISW-Druckwellenformen aufzuzeichnen und mit einem digitalen Oszilloskop zu messen.
   HINWEIS: Die Druckwellenformen zeigten stabile Eigenschaften mit ähnlichem maximalen Druck und Impuls wie in Abbildung 1B gezeigt.
5. Führen Sie alle tierischen Eingriffe unter Vollnarkose mit intraperitonealen Injektionen von 1 mg/kg Medetomidinhydrochlorid und 75 mg/kg Ketamin durch. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen der Maus auf, um ein Austrocknen zu verhindern und die Wärme zu unterstützen.
6. Rasieren Sie vorsichtig die postaurikulären Regionen, um zu vermeiden, dass die eingeschlossene Luft im Fell zurückbleibt. Fixieren Sie die Mäuse auf einer Platte und positionieren Sie die postaurikulären Regionen im Fokusbereich des LISW vertikal nach oben.
7. Befestigen Sie ein schwarzes Gummitarget perkutan an der postaurikulären Region des Mausohrs. Um eine Anpassung der akustischen Impedanz zu gewährleisten, verwenden Sie ein leitfähiges Ultraschallgel zwischen dem Laserziel und der Hautoberfläche.
8. Wenden Sie einen einzelnen LISW-Impuls über das Schläfenbein an die Cochlea an. Stellen Sie die Ausgänge der Laserpulse auf drei Energiedichten ein: 2,0 J/cm² , 2,25 J/cm² und 2,5 J/cm².

3. Cochlea-Funktionstest

HINWEIS: Die Tests zur auditiven Hirnstammreaktion (ABR) wurden wie zuvor berichtet durchgeführt^14,15.

1. Führen Sie die ABR-Messung 1 Tag vor und 1 Tag und 1 Monat nach der LISW-Exposition durch.
2. ABR ist ein auditiv evoziertes Potential als Reaktion auf auditive Reize und wird häufig zur Beurteilung von Hörschwellen bei vier Frequenzen (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz und 24,0 kHz) verwendet.
3. Präsentieren Sie den Stimulationsklang über einen kleinen Kopfhörer und messen Sie den Schalldruckpegel in der Nähe des Trommelfells der Maus mit einem kleinen Mikrofon, das in der Nähe des Kopfhörers platziert ist. Geben Sie Burst-Stimuli von einem Schallgenerator mit 37 Zyklen/s aus und verstärken Sie den Schalldruck von einem Schalldruckpegel (SPL) von 20 dB auf 80 dB SPL in 5 dB SPL-Schritten.
4. Führen Sie eine Nadelelektrode aus Edelstahl für die Aufzeichnung von Elektroenzephalogrammen unter den Gehörgang und den Frontalbereich des Ohrs ein und führen Sie eine Masseelektrode unter dem kaudalen Bereich des Schwanzes ein.
5. Bewerten Sie die Cochlea-Funktionen, indem Sie die Amplitude des ABR-Peaks I (P1) messen. Analysieren Sie die ABR-Wellenformen automatisch in Bezug auf die Hörschwellen und die ABR P1-Amplitude mit der ABR-Peak-Analysesoftware, wie bereits berichtet¹⁸.
6. Berechnen Sie die ABR-Schwellenwertverschiebungen, indem Sie die vor der Exposition erhaltenen Schwellenwerte subtrahieren. Vergleichen Sie die Verschiebungen der ABR-Schwellenwerte in den drei exponierten Gruppen mit denen der nicht exponierten kontralateralen Ohren (Kontrolle). Messen Sie ABR-Amplituden mit der ABR-Wellenform während einer SPL-Stimulation von 80 dB.

4. Histologische Beurteilung

HINWEIS: Die histologische Beurteilung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt ^14,15.

1. HCs und Cochlea-Synapse
   1. Führen Sie die pathologische Untersuchung der Cochlea 1 Monat nach der LISW-Exposition durch.
   2. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen vor der Perfusion. Nach der Hämoperfusion mit Laktat-Ringer-Lösung ist eine transkardiale Perfusion mit 1 ml/g 4% Paraformaldehyd (PFA) durchzuführen. Nach der Enthauptung die Cochlea entfernen und direkt mit 4 % PFA durchbluten, anschließend über Nacht bei 4 °C fixieren.
   3. Nach der Fixierung entkalken Sie die Cochlea, indem Sie 2 Tage lang 0,5 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung einschütteln.
   4. Teilen Sie die demineralisierte Cochlea in vier Stücke. Nachdem Sie jedes Stück Cochlea 10 Minuten lang auf Trockeneis eingefroren haben, führen Sie eine Blockierung bei Raumtemperatur für 1 h in 5 % normalem Pferdeserum durch, das einfach mit 0,3 % Triton X zur Permeabilisierung konjugiert wurde.
   5. Verwenden Sie Anti-Myosin 7a (Myo7A), Anti-C-terminales Bindungsprotein (CtBP2) und Anti-Neurofilament (NF)-Antikörper als primäre Antikörper und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Verwenden Sie Myo7A-, CtBP2- und NF-Antikörper, um HCs, präsynaptische Bänder bzw. Cochlea-Nervenfasern zu bewerten.
   6. Waschen Sie den ungebundenen Primärantikörper mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 x 3 min ab. Die Proben werden mit den entsprechenden Sekundärantikörpern bei 37 °C für 2 h inkubiert. Waschen Sie die Proben nach dem Färben 3 x 5 min lang mit PBS und verkapseln Sie die Proben auf dem Objektträgerglas mit einem wasserlöslichen Verkapselungsmittel unter Verwendung von Deckglas.
   7. Zur Auswertung nehmen Sie das gesamte Bild der Cochlea (in vier Teile unterteilt) bei 10-facher Vergrößerung auf und berechnen die Cochlea-Frequenzkarte mit dem referenzierten ImageJ-Software-Plug-in, um die spezifischen Cochlea-Regionen bei Frequenzen von 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz und 24,0 kHz präzise zu lokalisieren.
   8. Berechnen Sie die Überlebensraten von HC und die Anzahl der Synapsen bei jeder Frequenz.
      1. Um die Überlebensraten von HC zu berechnen, zählen Sie die Anzahl der überlebenden und fehlenden HCs pro 200 μm Länge bei jeder Frequenz und berechnen Sie die Überlebensrate der HCs mit der unten gezeigten Gleichung (1):
         HC-Überlebensrate (%) = (Anzahl der überlebenden HC / Anzahl der überlebenden und fehlenden HCs) × 100 (1)
      2. Um die Anzahl der Synapsen zu berechnen, erhalten Sie hochauflösende Z-Stapel-Bilder des inneren HC-Bereichs mit einem Öl-Immersionsobjektiv (63×) mit einem 3,1-fachen Digitalzoom und einer Schrittweite von 0,25 μm unter konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Importieren Sie die Bildstapel in ImageJ und zählen Sie automatisch die CtBP2-Puncta pro IHC innerhalb eines Bereichs von 50 μm in jedem Bildstapel. Berechnen Sie die Überlebensrate der synaptischen Bänder mit Hilfe von Gleichung (2):
         Überlebensrate synaptischer Bänder (%) = (Anzahl der synaptischen Bänder in LISW-exponierten Ohren / Anzahl der synaptischen Bänder in Kontrollohren) × 100 (2)
   9. Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) die Cochlea wie zuvor beschrieben entfernen und dann über Nacht mit 2 % PFA und 2,5 % Glutaraldehyd zusammen bei 4 °C fixieren. Nach der Entkalkung der Cochlea durch Schütteln in 0,5 mol/l EDTA-Lösung bei 4 °C für 7 Tage die Cochleae in vier Stücke zerlegen, um sie als Ganzes zu präparieren.
   10. Das Gewebe 30 min lang mit 1 % Osmiumtetroxid bei 4 °C fixieren, 10 min in 50 % Ethanol bei Raumtemperatur dehydrieren, mit 70 %, 80 %, 95 % und dann 100 % Ethanol wiederholen, mit Osmium bestäuben und unter dem Elektronenmikroskop bei 5,0 kV untersuchen, wie bereits berichtet¹⁴.
   11. Führen Sie eine quantitative Analyse der Stereozilienbündelstörung in äußeren Haarzellen (OHCs) durch, indem Sie das Verhältnis der gestörten Stereozilien (Anzahl der gestörten OHC-Stereozilien/Gesamtzahl der OHC-Stereozilien) in jeder Energiegruppe unter Verwendung der REM-Bilder^{berechnen 14}. Zählen Sie die Anzahl der Stereozilien pro 100 μm in der Mitte des 16,0- und 24,0-kHz-Bereichs. Kennzeichnen Sie eine oder mehrere Reihen von OHC-Bündeln, die zur Seitenseite gebogen sind, sich verheddern oder denen ihre Basis fehlt, als unterbrochen.
2. SGNs
   1. Um die Anzahl der SGNs 1 Monat nach LISW-Exposition quantitativ zu bestimmen, führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 4 % PBS durch, enthaupten Sie, entfernen Sie die Cochlea und führen Sie eine posteriore Fixation unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durch. Entkalken Sie die Cochlea 1 Woche lang in 0,5 M EDTA.
   2. Nach der Entkalkung tauchen Sie die Cochleae über Nacht in 30%ige Saccharose, betten sie in die Kryosektionsmasse ein, frieren sie in flüssigem Stickstoff ein, um Schnitte in der Nähe des Rosenthal-Kanals mit einer Dicke von 15 μm herzustellen, färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin und betrachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop¹⁴.
   3. Für die SGN-Dichtemessung zählen Sie die Anzahl der SGNs in der mittleren Windung des Rosenthal-Kanals und berechnen Sie das SGN-Überleben pro Kontrolle.

5. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit der Software Ihrer Wahl durch.
2. Analysieren Sie statistische Unterschiede in der ABR-Schwellenverschiebung, HC, SGN und synaptischen Zählung unter Verwendung von Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen ["Häufigkeit oder Cochlea-Anteile (apikal/Mitte/Basis)" × "Tiergruppen"], Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest.
3. Stellen Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler dar, und legen Sie das statistische Signifikanzniveau auf p < 0,05 fest.

Ergebnisse

LISW-Wellenform
Die Reproduzierbarkeit der LISW-Druckwellenform wurde 5x bei 2,0 J/^cm2 wie folgt gemessen. Die Wellenformen waren im Allgemeinen ähnlich und stabil und zeigten einen starken Anstieg mit Zeitbreite, Spitzendruck und Impuls von 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa und 14,1 ± 1,9 Pa∙s (Median ± SD), was den SW-Eigenschaften entspricht (Abbildung 1B). LISWs zeichnen sich durch eine schnelle Anstiegszeit, einen hohen Spitzendruck, eine kurze Dauer und eine Überdruckdominanz aus. Bei der Anwendung auf biologisches Gewebe wird das Ziel durch das Gelee direkt auf das lebende Gewebe aufgebracht, und es kann davon ausgegangen werden, dass das SW fast die gleichen Eigenschaften aufweist wie das gemessene SW, das auf das Gewebe aufgetragen wird. Nach Exposition gegenüber LISW wurde das Auftreten von TMP mit einem kleinen digitalen Endoskop beurteilt. Keine der Mäuse in der LISW-Energiegruppe zeigte nach der Exposition TMP (Abbildung 1C).

Auditive Bewertung
Zur Bestimmung der Hörfunktion wurde eine ABR-Untersuchung durchgeführt. ABR ist ein Maß für das schallevozierte Potential in der Hörbahn, und ABR P1 steht für die akkumulierte neuronale Aktivität im Cochlea-Nerv. Einen Tag nach der LISW-Exposition zeigte das exponierte Ohr einen signifikanten Unterschied in der ABR-Schwellenwertverschiebung zwischen den verschiedenen LISW-Gruppen (Zwei-Wege-ANOVA, p < 0,0001; Abbildung 2A). Dieser Anstieg der ABR-Schwellenwertverschiebung hielt bis zu 1 Monat nach der LISW-Exposition in den Gruppen 2,25 und 2,5 J/cm² an (Zwei-Wege-ANOVA, 2,25 J/cm², p < 0,0001; 2,5 J/cm², p < 0,0001). Insbesondere im Hochfrequenzbereich zeigte sich eine deutliche Zunahme der ABR-Schwellenverschiebung. Die ABR-Schwellenwerte erholten sich jedoch auf ein Niveau, das sich nicht signifikant von der Vorbestrahlung in der 2,0 J-Gruppe unterschied (Zwei-Wege-ANOVA, 2,0 J/cm², p = 0,76), was darauf hindeutet, dass die Schwellenerhöhung energieabhängig war. Bezogen auf die ABR P1-Amplituden zeigten alle LISW-bestrahlten Gruppen eine signifikante Abnahme der ABR P1-Amplituden bei allen Frequenzen 1 Tag und 1 Monat nach der LISW-Exposition (bidirektionale ANOVA, p < 0,0001; Abbildung 2B). Das nicht exponierte Ohr (Kontrolle; linkes Ohr) zeigte nach LISW-Exposition keine merklichen Veränderungen der ABR-Hörschwelle (Daten nicht gezeigt).

Überleben von HC und SGN
Die mikroskopische Betrachtung von LISW-exponierten Ohren ergab keine mechanischen Schädigungen der Cochleae, wie z. B. Fraktur und Dislokation der Gehörknöchelchen, Ruptur der Rundfenstermembran oder intracochleäre Blutung, nach LISW-Exposition (Daten nicht gezeigt), was mit früheren Befunden übereinstimmt ^6,14.

Die fluoreszierende Immunfärbung von HCs mit Myo7A, synaptischen Bändern mit CtBP2 und dem Cochlea-Nerv mit NF ist in Abbildung 3A dargestellt. In keiner der Gruppen wurden schwere Cochlea-Schäden, wie z. B. der Verlust von HCs oder Nervenfasern, beobachtet. Die quantitative Bewertung des Überlebens von Myo7A-positiven OHCs unterschied sich jedoch signifikant zwischen den Gruppen (bidirektionale ANOVA, p = 0,002; Abbildung 3B). Die 2,5 J/cm^2-Gruppe zeigte signifikant niedrigere Überlebensraten von OHCs als die Kontrollgruppe, insbesondere im Hochfrequenzbereich (bidirektionale ANOVA, 2,5 J/cm², p = 0,0002). Die Überlebensraten von IHCs waren jedoch zwischen den Gruppen vergleichbar, was darauf hindeutet, dass OHCs anfällig für hochenergetische LISW sind (bidirektionale ANOVA, p = 0,76). Eine quantitative Bewertung des Überlebens des synaptischen Bandes ist in Abbildung 3C dargestellt. Synaptische Bänder waren sowohl in der 2,25- als auch in der 2,5 J/^cm2-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert (Zwei-Wege-ANOVA, 2,25 J/cm², p < 0,0001; 2,5 J/cm², p < 0,0001), und die höheren Frequenzen zeigten eine stärkere Tendenz zur Abnahme, ähnlich wie bei der ABR-Schwellenverschiebung und dem OHC-Überleben.

Als nächstes wurde die SGN-Dichte bewertet, wie in Abbildung 3D dargestellt. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied in der SGN-Dichte zwischen den Gruppen (bidirektionale ANOVA, p = 0,76), und die Gruppe mit 2,5 J/cm² zeigte signifikant niedrigere Überlebensraten von SGN im Vergleich zu den Kontrollgruppen (bidirektionale ANOVA, 2,5 J/cm², p = 0,007). Die Gruppen mit 2,0 und 2,25 J/cm² zeigten jedoch ein vergleichbares SGN-Überleben im Vergleich zu den Kontrollen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Schweregrad der Cochlea-Degeneration und der Hördysfunktion von der LISW-Energieexposition abhängt, die mit den Überlebensergebnissen von ABR und HC übereinstimmt.

Stereoziliäres Bündel
Wir beobachteten einen bemerkenswerten Anstieg der ABR-Schwelle von etwa 30 dB sowohl in der 2,25- als auch in der 2,5 J/^cm2-Gruppe bei Frequenzen über 20 kHz, der bis zu 1 Monat nach der LISW-Exposition anhielt (wie in Abbildung 2A gezeigt). Die von uns beobachtete Verschiebung der Schwelle um 30 dB kann jedoch nicht allein auf den Verlust von OHCs, die Degeneration der Cochlea-Synapsen oder eine verringerte Anzahl von SGCs zurückgeführt werden (Abbildung 3). Eine frühere Studie deutete darauf hin, dass die Verschiebungen der ABR-Schwellenwerte minimal waren, wenn die Anzahl der synaptischen Bänder um 50 % ^abnahm19. Daher führten wir REM durch, um die Ursache für die Erhöhung der ABR-Schwelle zu untersuchen. Nach LISW-Exposition bei einer Intensität von 2,5 J/cm² schienen einige stereoziliäre OHC-Bündel gestört zu sein, insbesondere in hochfrequenten Bereichen (Abbildung 4A), was eine der Ursachen für eine erhöhte ABR-Schwelle nach LISW-Exposition sein könnte. Die quantitative Bewertung der stereoziliären Störung zeigte, dass das Störungsverhältnis im höherfrequenten Bereich energieabhängig tendenziell höher war (Abbildung 4B).

Abbildung 1: Versuchsanordnungen und Druckprofil von LISW. (A) Versuchsaufbau zur Erzeugung von LISW bei Tieren. (B) Eigenschaften der LISW-Druckwellenformen mit einem Wert von 2,0 J/cm². (C) Repräsentative Bilder des Trommelfells. TMPs wurden bei keinem der LISW-exponierten Ohren beobachtet. Als Referenz ist eine repräsentative blast-induzierte TMP (gelbe Pfeilspitzen) anhand eines Hochdruckrohrs dargestellt. Abkürzungen: LISW = laserinduzierte Stoßwelle; PET = Polyethylenterephthalat; TMP = Perforation des Trommelfells; YAG = Yttrium-Aluminium-Granat; SHG = Erzeugung der zweiten Harmonischen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: ABR-Ergebnisse nach Exposition gegenüber LISW. (A) Signifikante Verschiebungen der ABR-Schwellenwerte wurden in allen Gruppen 1 Tag nach der Exposition gegenüber LISW beobachtet. Die ABR-Schwellenwertverschiebungen in den Gruppen 2,25 und 2,5 J/cm² blieben bis zu 1 Monat nach der Exposition gegenüber LISW signifikant erhöht. (B) Die ABR P1-Amplitude 1 Tag und 1 Monat nach der Exposition gegenüber LISW nahm in allen Gruppen signifikant ab. Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen im Vergleich zu den Präexpositionswerten hin (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Abkürzungen: ABR = auditory brainstem response; LISW = laserinduzierte Stoßwelle; P1 = Spitze 1; SPL = Schalldruckpegel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Cochlea-Pathologie nach Exposition gegenüber LISW. (A) Konfokale Fluoreszenzbilder des Corti-Organs im 20-kHz-Bereich, gefärbt mit Myo7A (blau), CtBP2 (rot) und NF (grün) nach Exposition gegenüber LISW. (B) Die durchschnittlichen Prozentsätze der überlebenden HC sind in den Zytocochleogrammen angegeben. Die quantitative Bewertung ergab einen signifikanten Verlust von OHCs bei 2,5 J/cm², obwohl es keinen signifikanten Unterschied im IHC-Überleben zwischen den Gruppen gab. (C) Die Überlebensrate präsynaptischer Bänder im Vergleich zu den Präexpositionswerten war in den Gruppen 2,25 und 2,5 J/^cm2 signifikant verringert. (D) Repräsentative Mikrofotoaufnahmen von SGNs in allen Gruppen 1 Monat nach Exposition gegenüber LISW. Die SGN-Überlebensrate sank signifikant bei 2,5 J/cm². Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zu den Prä-Exposure-Werten hin (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Maßstabsleisten = 5 μm (A), 100 μm (D). Abkürzungen: LISW = laserinduzierte Stoßwelle; IHC = innere Haarzelle; NF = Neurofilament; OHC = äußere Haarzelle; SGN = Spiralganglien-Neuron. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Oberflächenstrukturen von OHCs. (A) Repräsentative Rasterelektronenmikroskopie-Aufnahmen von OHC-Stereozilien in den 16 kHz und 24 kHz Regionen des Corti-Organs einen Monat nach Exposition mit LISW. Stereoziläre Störungen sind in vergrößerten Bildern des Boxed-Bereichs in der Gruppe von 2,5 J/cm² (24 kHz-Bereich) zu sehen. Maßstabsbalken -= 2 μm. (B) Die stereoziliäre Störungsrate war mit zunehmendem LISW-Überdruck höher. Abkürzungen: LISW = laserinduzierte Stoßwelle; OHC = äußere Haarzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Ziel dieser Studie war es, ein Mausmodell für blasteninduzierte Cochlea-Schäden mit LISW zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das exponierte Ohr der Maus nach der LISW-Applikation durch das Schläfenbein einen konsistenten pathologischen und physiologischen Rückgang der Cochlea aufwies, der mit einem Anstieg des LISW-Überdrucks einherging. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Mausmodell geeignet ist, verschiedene Cochlea-Pathologien durch Anpassung der LISW-Ausgabe zu replizieren. Insbesondere könnte dieses LISW-induzierte Mausmodell für Cochlea-Dysfunktion aufgrund seiner kontrollierten, reproduzierbaren und quantifizierbaren Natur sowie seiner Fähigkeit, den pathophysiologischen Cochlea-Rückgang unter kontrollierten Bedingungen zu reproduzieren, als gutes Cochlea-Verletzungsmodell dienen.

In unserer vorherigen Studie wurde ein Rattenmodell verwendet und eine LISW-induzierte Cochlea-Degeneration beobachtet, einschließlich einer Erhöhung der Hörschwellen, des Verlusts von synaptischen Bändern und einer Störung des Stereoziliarbündels¹⁴. Eine andere Studie untersuchte die pathophysiologische Cochlea-Degeneration nach Blastenverletzung bei Mäusen mit zwei Arten von Blasten mit unterschiedlichen Eigenschaften: niederfrequent-dominant mit einem Hochstrahlrohr und hochfrequent-dominant mit LISW¹⁵. Sie stellten fest, dass die dominante Frequenz des Explosionsleistungsspektrums der Hauptfaktor bei der Bestimmung des Bereichs der Cochlea-Schädigung war, wie bereits berichtet^{wurde 15}. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die die detaillierte Methodik der LISW-Cochlea-Exposition und der energie- und frequenzabhängigen LISW-induzierten Cochlea-Degeneration demonstriert.

Wir nutzten die LISW-Exposition, um die Cochlea durch das postaurikuläre Schläfenbein und nicht durch den äußeren Gehörgang zu schädigen, um ein Modell zu erstellen, das ausschließlich Cochlea-Schäden ohne TMP oder Gehörknöchelchenkettenabbruch umfasste. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die in dieser Studie nachgewiesene Hörbeeinträchtigung auf die Verschlechterung der sensorineuralen Komponenten in der Hörbahn zurückzuführen ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass das TMP als Puffer gegen Schäden an der Cochlea dienen kann, indem es SW-Energie^{absorbiert 2,20,21}. Dieses LISW-Modell war nicht in der Lage, TMP zu induzieren, selbst bei hochintensiver LISW, da das SW direkt in das Innenohr und nicht durch das Trommelfell bestrahlt wurde. Daher ist für die Analyse von kombiniertem Hörverlust mit TMP und SNHL eine hochintensive Explosion ideal, die mit einer echten Explosion oder einem Stoßdämpfer erzeugt wird. Die Wahl des Strahltyps hängt von der spezifischen Verwendung oder dem Ziel der Studie ab. Daher ist dieses LISW-basierte Tierverletzungsmodell nützlich, um die reine blasteninduzierte Cochlea-Pathophysiologie ohne TMP aufzuklären, die zu Schallleitungsschwerhörigkeit führt. Aus einer anderen Perspektive erforderte die LISW-Bestrahlung 1 h/Tier, einschließlich des Aufbaus der Ausrüstung und der Überprüfung des Trommelfells nach der Bestrahlung. Wenn also mehrere Tiere innerhalb von 1 Tag hintereinander LISW ausgesetzt waren, ist es schwierig, die LISW-Bestrahlung und die ABR am selben Tag mit einer einzigen Anästhetikumsdosis zu messen. Aufgrund des Todesrisikos bei der Erhöhung der Anästhesiedosis haben wir uns in dieser Studie entschieden, ABR-Messungen am nächsten Tag und nicht unmittelbar nach der Bestrahlung am selben Tag durchzuführen.

Bei der Explosionsverletzung wird die Primärphase durch die physikalischen Kräfte der Explosion und die schnelle SW-Übertragung mit signifikanten Veränderungen der Gewebedichte, wie z. B. Gewebe-Luft-Verbindungen, verursacht²². Daher wird davon ausgegangen, dass die meisten blasteninduzierten Cochlea-Verletzungen während der primären Phase⁶ aus der SW entstanden sind, was darauf hindeutet, dass Studien zu SW-exponierten Cochlea-Verletzungen für das Verständnis der Mechanismen der blasteninduzierten Cochlea-Dysfunktion von entscheidender Bedeutung sind. Die Erzeugung einer SW mit einem hochenergetischen Laserpuls auf einem festen Material wird als LISW bezeichnet. Frühere Studien haben LISW verwendet, um Tiermodelle für blasteninduzierte traumatische Hirn- und Lungenverletzungen zu entwickeln^16,17. Zu den Vorteilen der Verwendung von LISW für blastenbezogene Studien gehören das von der Laserintensität abhängige, wiederholbare Schadensmodell und die spezifische Ausrichtung auf das verletzte Organ, da LISW keine Bereiche außerhalb des Zielbereichs beeinflusst.

In dieser Studie entdeckten wir, dass LISW pathologische Veränderungen in cochleären HCs, SGNs, ihren Synapsen und dem stereozilären Bündel hervorruft, ähnlich wie die Schäden, die durch eine echte Explosionsverletzung verursacht werden¹². Die Schäden, die durch verschiedene Formen von Cochlea-Insultationen, wie z. B. lärmbedingter Hörverlust, verursacht werden, können auf zwei grundlegende Faktoren zurückgeführt werden: direkte mechanische Belastung und sekundäre Stoffwechselstörungen. Wir schlagen vor, dass die Störung des stereoziliären Bündels die primäre Pathologie ist, die sich aus der direkten mechanischen Belastung des LISW ergibt. Stereoziliäre Störungen sind häufige Pathologien, die mit altersbedingten und lärmbedingten Hörstörungen einhergehen^23,24. Der genaue Mechanismus, der dieser stereoziliären Störung zugrunde liegt, ist bisher nicht geklärt. Eine frühere Studie zeigte, dass 1 Woche nach der Blastenexposition eine stereoziliäre Störung beobachtet wurde¹². Ein möglicher Grund für diese einzigartige morphologische Veränderung könnte die Trennung von Spitzen- und Seitengliedern zwischen den gestörten Stereozilien der äußersten Reihe und den Stereozilien der mittleren Reihe^{sein 14}. Darüber hinaus werden auch Wurzelchen der äußersten Reihe von Stereozilien, die aus Aktin und Bündelungsproteinen wie TRIOBP bestehen, mechanisch geschädigt¹⁵.

Cochlea-Schädigungen führen in der Regel zu einer weiteren Störung der Stoffwechselprozesse, die tage- oder sogar monatelang anhalten können¹⁹. Insbesondere die Synapsen in der Cochlea, die für die auditive Klangverarbeitung verantwortlich sind, sind sehr anfällig für Explosionsexposition²⁵. Unsere Tiermodelle zeigten, dass die Degeneration der ANs-Funktion, wie sie durch den Rückgang der ABR P1-Amplituden gezeigt wird, durch LISW-induzierte Cochlea-Schäden verursacht wurde. Ein möglicher Mechanismus der LISW-induzierten Cochlea-Synaptopathie ist die übermäßige Freisetzung von Glutamat durch die IHCs, wie z. B. die Glutamat-Ototoxizität²⁶. Die LISW-Exposition führt dazu, dass die Basilarmembran heftig vibriert, was zu einer übermäßigen Freisetzung von Glutamat aus dem IHC führt, was zu einer AN-Degeneration führt. LISW kann die Art der Glutamattoxizität replizieren, die die Cochlea betrifft, was zu einer Cochlea-Synaptopathie und einer Abnahme der Anzahl der Synapsen führt, ohne HCs zu schädigen. Ein weiterer möglicher Mechanismus ist, dass die LISW-Exposition die Cochlea-Stützzellen schädigen kann, was zum Überleben von ANFs in Abhängigkeit von der Freisetzung von Neurotrophinen beiträgt²⁷. Darüber hinaus kann LISW direkt auf ANFs übertragen werden und neuronale Schäden verursachen. Daher könnten unsere LISW-induzierten Cochlea-Schädigungsmodelle sowohl für die Blastenforschung als auch für die Untersuchung verschiedener Formen der Cochlea-Degeneration, die an einer Cochlea-Synaptopathie beteiligt sind, wertvoll sein.

Es besteht ein dringender Bedarf an therapeutischen Interventionen zur Behandlung von blasteninduziertem Hörverlust, was die Bedeutung von Behandlungsstrategien unterstreicht, die sich auf die Cochlea-Synaptopathie oder die Störung des Stereoziliarbündels bei OHC konzentrieren. Diese Ansätze können auch auf andere Arten von Hörstörungen mit ähnlichen pathologischen Mechanismen angewendet werden. In unserem Modell der blasteninduzierten Cochlea-Dysfunktion wurde eine Cochlea-Synaptopathie beobachtet, was darauf hindeutet, dass sie ein vielversprechendes therapeutisches Ziel sein könnte. LISW kann verwendet werden, um Mausmodelle zu erstellen, die die durch Blasten verursachte Cochlea-Pathophysiologie genau replizieren, und diese Modelle können zur Untersuchung verschiedener Arten von Cochlea-Dysfunktionen verwendet werden.

Unsere Studie hat mehrere Einschränkungen. Zuerst haben wir die ABR-Schwellenwerte bei 12-24 kHz gemessen. Einer früheren Studie zufolge führt eine LISW-induzierte Cochlea-Schädigung bei Tieren aufgrund der Eigenschaften von SW und der Anfälligkeit der Cochlea-Basis zu einem hochfrequenten Hörverlust. Weitere ABR-Untersuchungen sind in breiteren Frequenzbereichen (>24 kHz) erforderlich. Zweitens haben wir in dieser Studie nur eine histologische Bewertung der Cochlea durchgeführt und nicht die zentrale Hörbahn. Die Hörschädigung bei Blastenverletzungen ist nicht nur auf die Cochlea beschränkt, sondern ist eine komplizierte Beeinträchtigung des Hirnstamms und des zentralen Gehörs. In Zukunft wäre es wünschenswert, das auditorische Zentrum in LISW-exponierten Tiermodellen zu evaluieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
532 nm gütegeschalteter Nd:YAG-Laser	Quantel	Brilliant b
ABR-Peak-Analysesoftware	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Schweißklebstoff aus Acrylharz	Acrysunday Co., Ltd	N/A
konfokale Fluoreszenzmikroskopie	Leica	TCS SP8
Kryosektionsverbindung	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 Antikörper	BD Transduktion	# 612044
Dielektrische Mehrschichtspiegel	SIGMAKOKI CO., LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digitales Oszilloskop	Tektronix	DPO4104B
Kopfhörer	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.
Image J Software-Plug-in	NIH-Messlinie		https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Lichtmikroskop	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A Antikörper	Proteus Biosciences	#25– 6790
Neurofilament-Antikörper	Sigma	#AB5539
Plankonvexe Linse	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prismen-Software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Rasterelektronenmikroskop	JEOL Ltd	JSM-6340F
Kleines digitales Endoskop	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultraschall-Gelee	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variabler Dämpfer	Showa Optronics Co.	N/A	Aktuell verfügbarer Nachfolger: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Wasserlösliches Verkapselungsmittel	Dako	#S1964