Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren

Summary

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Assay, der schnell und kostengünstig die Fähigkeit neuartiger Verbindungen bestätigen kann, Eisen zu chelatisieren. Der Assay misst die Fähigkeit von Verbindungen, die Eisenbindungsaktivität der schwachen Eisenchelat-Fluoreszenzsonde Calcein zu übertreffen, was zu einem quantifizierbaren Anstieg der Fluoreszenz führt, wenn eine Chelatbildung auftritt.

Abstract

Krebszellen benötigen große Mengen an Eisen, um ihre Proliferation aufrechtzuerhalten. Der Eisenstoffwechsel gilt als Kennzeichen von Krebs, was Eisen zu einem gültigen Ziel für Ansätze zur Krebsbekämpfung macht. Die Entwicklung neuartiger Verbindungen und die Identifizierung von Leitstrukturen für weitere Modifikationen erfordert die Durchführung von Assays zum Nachweis des Mechanismus. Es gibt viele Assays, um die Auswirkungen auf die Proliferation zu bewerten. Die Fähigkeit, Eisen zu chelatisieren, ist jedoch aufgrund der hohen Gerätekosten und der Herausforderung, die Stärke der Chelatbildung schnell und reproduzierbar zu quantifizieren, ein wichtiges und manchmal übersehenes Endpunktmaß. Hier beschreiben wir eine quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode, um die Fähigkeit neuartiger Verbindungen zu bestätigen, Eisen zu chelatisieren. Unser Assay basiert auf dem kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Fluoreszenzfarbstoff Calcein, dessen Fluoreszenz auf den meisten fluoreszierenden Mikrotiterplatten-Readern quantifiziert werden kann. Calcein ist ein schwacher Eisenchelator, und seine Fluoreszenz wird gelöscht, wenn er Fe^2+/3+ bindet; Die Fluoreszenz wird wiederhergestellt, wenn ein neuartiger Chelator Calcein um gebundenes Fe^2+/3+ verdrängt. Durch die Entfernung des Fluoreszenz-Quenchings und die daraus resultierende Erhöhung der Fluoreszenz kann die Chelatfähigkeit eines neuartigen putativen Chelators bestimmt werden. Daher bieten wir einen kostengünstigen Hochdurchsatz-Assay an, der ein schnelles Screening neuartiger Chelatorkandidaten ermöglicht.

Introduction

Phänotypische Veränderungen an Zellen, die mit der Entwicklung von Krebs durch eine gemeinsame Reihe veränderter biologischer Fähigkeiten zusammenhängen, werden heute allgemein als Kennzeichen von Krebs bezeichnet. Darunter befinden sich Veränderungen durch die Umprogrammierung des Energiestoffwechsels, die in der Krebszellbiologie weit verbreitet sind¹. Eine solche metabolische Reprogrammierung beinhaltet einen erhöhten Bedarf an Eisen, um eine schnelle Proliferation und ein schnelles Tumorwachstum zu unterstützen². Dieser Eisendurst führt zu einem dysregulierten Eisenstoffwechsel, der an und für sich als Kennzeichen von Krebs gilt ^3,4, wobei eine Fehlregulation in allen Stadien auftritt⁵. Zu den Kennzeichen der Metastasierung, die in jüngerer Zeit von Welch und vorgeschlagen wurden, gehört eine Rolle für Eisen⁶, da Eisen oxidativen Stress induzieren kann, was wiederum Veränderungen des Genoms, des Epigenoms und des Proteoms vermitteln kann, was die Möglichkeit einer Metastasierung erhöht⁷. Ein Zusammenhang zwischen dem Eisenspiegel und einem erhöhten Auftreten von Krebs wurde in epidemiologischen Studien nachgewiesen⁸.

Da Krebszellen große Mengen an Eisen benötigen, sind sie anfällig für Eisenmangel und damit für Eisenchelatbildung. Wir haben kürzlich einen Übersichtsartikel veröffentlicht, in dem wir das Potenzial der Eisenchelatbildung bei der Umkehrung mehrerer Kennzeichen von Krebs durch NDRG1 hervorheben, die die onkogenen Signalwege stören⁹. Die Verwendung von Eisenchelaten als eigenständige Krebstherapie hat jedoch in klinischen Studien aufgrund ihrer Toxizität, ihrer kurzen Halbwertszeit, ihres schnellen Stoffwechsels und ihrer aufkommenden Resistenzmechanismen keine positiven Ergebnisse gebracht. Nichtsdestotrotz haben sich Eisenchelatoren in In-vitro - und In-vivo-Untersuchungen als vielversprechend erwiesen, was darauf hindeutet, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um wirksame Eisenchelatoren für die Krebstherapie zu entwickeln. Die spezifische Eisenchelatbildung ist eine validierte Strategie in der Forschung von Krebsmedikamenten, aber bisher wurden nur über wenige Klassen berichtet¹⁰.

Die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Eisenchelatoren erfordert die Fähigkeit, ihre Wirkung auf mehrere Endpunkte zu messen. Viele davon (wie Proliferation, Apoptose, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies) werden routinemäßig gemessen und wurden in der Literatur als Methoden zur Bewertung der Kennzeichen von Krebs beschrieben und überprüft¹¹. Bei der Evaluierung eines neuartigen Eisenchelators untersuchen viele Gruppen routinemäßig die Wirkung auf antiproliferative und Redoxaktivitäten sowie die Auswirkungen auf den Eiseneinstrom oder -ausfluss. In-silico-Vorhersagetechniken ¹² vergrößern den wachsenden Pool an Eisenchelatoren, die gescreent werden können, weiter.

DieHerstellung von Eisenchelatoren erfordert die Fähigkeit, ihre Wirkung auf den Eisenspiegel zu messen, um den Grundsatznachweis wirksam zu demonstrieren. Die derzeit gebräuchlichste Methode dafür ist die Durchflusszytometrie¹³ , die kostspielig, zeitaufwändig und schlecht quantifizierbar ist. Die Wahl des Assays hängt oft von der Verfügbarkeit der experimentellen Ausrüstung, der Geschwindigkeit und den Kosten eines Assays ab. Daher kann die Fähigkeit, Eisen zu chelatisieren, aufgrund der hohen Kosten für die Ausrüstung und der Herausforderung, die Stärke der Chelatbildung schnell und reproduzierbar zu quantifizieren, ein übersehenes Endpunktmaß sein. Hier beschreiben wir eine quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode, um die Fähigkeit neuartiger Verbindungen zu bestätigen, Eisen zu chelatisieren.

Protocol

1. Vorbereitung der Stammlösung

1. Verhindern Sie bei der Zubereitung von Calcein-Lagerlösungen eine Verschlechterung des Lichtbildes, indem Sie die Lösungen im Dunkeln aufbewahren. Bereiten Sie eine 1 mM Lösung von Calcein in Dulbecco's PBS ohne Magnesium oder Calcium¹⁴ vor. Für 5 mL 1 mM Calcein-Lösung fügen Sie 3,1 mg Calcein (622,5 g/M) zu 5 mL PBS von Dulbecco hinzu. Bereiten Sie unter Verwendung der 1-mM-Socke von Calcein 1 ml-Aliquots von sekundären Stammlösungen in einem Mikrofuge-Röhrchen her, wie in Tabelle 1 beschrieben.
2. Bereiten Sie Eisenammoniumsulfat-Hexahydrat-Stämme vor, indem Sie 19 mg FAS-Hexahydrat (392,1 g/M) in 5 mL PBS von Dulbecco auflösen, um eine 10 mM Eisenammoniumsulfat (FAS)-Lösung zu erhalten. Bereiten Sie Sekundärbestände von FAS durch Verdünnung vor. Zur Herstellung eines Stammes von 2 mM FAS (fA) werden 200 μl des 10 mM FAS-Stammes mit PBS mit 800 μl PBS von Dulbecco verdünnt. Zur Herstellung eines Stammes von 100 μM FAS (fB) werden 50 μl des Stoffes fA mit 950 μl PBS von Dulbecco verdünnt.
3. Zur Herstellung von 10 mM Deferipron-Stamm lösen Sie 2,8 mg (139,15 g/M) in 2 ml PBS von Dulbecco. Bereiten Sie Sekundärstämme mit 2 mM Eisenchelator vor, indem Sie 200 μl des 10 mM-Stammes mit 800 μl PBS von Dulbecco verdünnen.
   HINWEIS: In diesem Assay sollte der Eisenchelator der Wahl in Dulbecco's PBS ohne Magnesium oder Calcium gelöst werden. Als Arbeitsbeispiel haben wir den Eisenchelator Deferiprone verwendet.

2. Assay-Validierung durch Bestimmung des linearen Bereichs der Calcein-Fluoreszenz

1. Bereiten Sie eine Reihe von Calcein-Stämmen von 1 mM bis 1 μM vor, wie in der Stammlösungstabelle beschrieben (siehe Tabelle 1). Bewahren Sie Stammlösungen im Dunkeln auf, um eine photochemische Degradation zu verhindern.
2. Pipettieren Sie 90 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer manuellen Einkanalpipette oder einer manuellen Mehrkanalpipette in die Vertiefungen A bis H und 1 bis 12 einer 96-Well-Platte.
3. Geben Sie 10 μl 1 mM Calcein-Stamm mit einer manuellen Einkanalpipette in Spalte 12, Reihen A bis H, der 96-Well-Platte.
4. Geben Sie 10 μl des vorbereiteten 800 μM Calcein-Rohmaterials (Tabelle 1) mit einer manuellen Einkanalpipette auf eine 96-Well-Platte in Spalte 11, Reihen A bis H.
5. Wiederholen Sie den Additionsvorgang mit den Rohlingen aus Tabelle 1 , so dass Spalte 10 10 μL des 400 μM-Stammes und Spalte 9 10 μL des 200 μM-Stammes enthält usw. Fahren Sie mit diesem schrittweisen Verfahren über die Säulen fort, bis Spalte 2 10 μl des 1 μM-Stammes enthält.
   HINWEIS: Die Endkonzentration von Calcein in jeder Vertiefung ist aufgrund der 1:10-Verdünnung 10-mal niedriger als bei den Stammlösungen.
6. Geben Sie 10 μl PBS in Spalte 1, Reihe A bis E.
7. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und stellen Sie den Analysator auf einem Mikroplatten-Reader auf eine Anregung von 490 nm und eine Detektion von 530 nm ein (oder ein geeignetes Filterset für Calcien-Fluoreszenz).

3. Assay-Validierung durchFe^2+-Ionen-Quenchung zur Reduzierung der Calcein-Fluoreszenz

1. Es ist ein Calcein (cB)-Stamm von 10 μM und ein FAS-Stamm (fA) von 2 mM herzustellen (siehe Materialtabelle). Bewahren Sie den Calcein-Vorrat im Dunkeln auf, um eine Photodegradation zu vermeiden.
2. Geben Sie mit einer manuellen Einkanalpipette oder einer manuellen Mehrkanalpipette 50 μl PBS in die Spalten 2 bis 10, Zeilen A bis E. Fügen Sie PBS nicht zu Spalte 11 hinzu.
3. Geben Sie 100 μl eines FAS (fA)-Stammes von 2 mM mit einer manuellen Einkanalpipette in eine 96-Well-Platte in Spalte 11 (Reihen A bis E).
4. Entnehmen Sie mit einer manuellen Mehrkanalpipette 50 μl fA aus Säule 11 und pipettieren Sie sie in das PBS bereits in Säule 10. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren.
5. Führen Sie dieses schrittweise Verfahren zur doppelten Verdünnung in den Spalten 9-2 in den Reihen A bis E der 96-Well-Platte fort und mischen Sie durch Pipettieren.
6. Entfernen Sie 50 μl der Lösung, indem Sie aus Spalte 2 pipettieren und die Lösung in den Abfall werfen.
7. Geben Sie 40 μl PBS in alle Vertiefungen mit einer Lösung, Spalten 2-12, Zeilen A bis E.
8. 90 μl PBS in die Vertiefung Spalte 1, Zeilen A-E geben. Diese Wells fungieren als Positivkontrolle von 1 μM Calcein und 0 μM FAS.
9. Geben Sie 10 μl 10 μM Calcein-Stamm (cB) in jede Vertiefung mit einer Lösung (Spalten 1 bis 12, Zeilen A bis E). Daraus ergibt sich eine Spitzenkonzentration von 1000 μM FAS in Spalte 11, wobei sich die FAS-Konzentration für die Spalten 10, 9, 8 bis Säule 2 halbiert. Jede der resultierenden Vertiefungen aus den Säulen enthält 1 μM Calcein und eine Verdünnung von FAS.
10. Geben Sie 100 μl PBS in Zeile F der Spalten 1 bis 5 für die PBS-Kontrolle allein. 100 μl 2 mM FAS in Reihe F der Spalten 6 bis 10 für die alleinige FAS-Kontrolle hinzufügen. Bei Raumtemperatur 10 min im Dunkeln inkubieren.
11. Analysieren Sie auf einem Mikroplatten-Reader, der auf eine Anregung von 490 nm und eine Detektion von 530 nm eingestellt ist (oder ein geeignetes Filterset für Calcein-Fluoreszenz).

4. Assay zur Quantifizierung der Fähigkeit von Eisenchelatoren, den schwachen Chelator Calcein bei Fe²⁺ -Ionen zu übertreffen

1. Es wird ein Calcein-Stamm (cB) von 10 μM, ein FAS-Stamm (fB) von 100 μM und die Eisenchelator-Stammstöcke von 2 mM hergestellt, wie in Tabelle 1 dargestellt. Bewahren Sie das Calcein-Lager im Dunkeln auf, um eine Photodegradation zu verhindern.
2. Geben Sie mit einer manuellen Einkanalpipette oder einer manuellen Mehrkanalpipette 50 μl PBS in die Spalten 2 bis 10, Reihen A bis E, einer 96-Well-Platte. Fügen Sie PBS nicht zu Spalte 11 hinzu.
3. 100 μl des 2 mM-Stammes (fA) der Eisenchelatoren werden mit einer manuellen Einkanalpipette in eine 96-Well-Platte in Spalte 11, Reihen A bis E gegeben.
4. Entnehmen Sie mit einer manuellen Mehrkanalpipette 50 μl fA aus Spalte 11 und pipettieren Sie sie in das PBS in Spalte 10, Reihen A bis E, wobei Sie sie durch Pipettieren gründlich mischen.
5. Fahren Sie mit diesem schrittweisen Doppelverdünnungsverfahren in den verbleibenden Spalten 9-2, Reihen A bis E der Platte, fort und mischen Sie jede Vertiefung durch Pipettieren. 50 μl aus Spalte 2 entnehmen und verwerfen. Dies gewährleistet eine doppelte Verdünnung von 2 mM des Eisenchelators (Deferiprone) über die 96-Well-Plattenspalten 11 bis 2, Reihen A bis E.
6. Pipettieren Sie 30 μl PBS in alle Vertiefungen mit einer Lösung (z. B. Spalten 2-11 Zeilen A bis E).
7. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 μl 100 μM FAS-Material (fB) in die Spalten 2-12, Zeilen A bis E. Dies führt zu einer Konzentration von 1 μM Calcein und 10 μM FAS in jeder Vertiefung und einer doppelten Verdünnung der Chelatoren, wobei sich die Konzentration in jeder Säule auf der Platte, in den Spalten 11-2, halbiert, wobei die höchste Konzentration des Eisenchelators bei 1000 μM in den Vertiefungen A bis E der Säule 11 liegt.
8. Mit einer Mehrkanalpipette 10 μl 10 μM Calcein-Stamm (cB) in die Spalten 2-12 in den Reihen A bis E geben.
9. 80 μl PBS und 10 μl Calcein-Stamm (cB) und 10 μl FAS-Stamm (fB) mit einer Pipette in Spalte 1, Reihen A-E pipettieren. Mischen Sie die Proben durch Pipettieren. Dies ermöglicht die Kontrolle von 1 μM Calcein mit 10 μM FAS und ohne Chelator.
10. Pipettieren Sie 100 μl PBS in die Spalten 1 bis 5 der Reihe F. Dies bietet die PBS-Negativkontrolle.
11. 100 μl 2 mM Eisenchelator (Deferipron) werden in Zeile F, Spalten 6 bis 10 hinzugefügt. Dies ermöglicht dem Chelator allein die Kontrolle.
12. Bei Raumtemperatur 10 min im Dunkeln inkubieren. Analysieren Sie auf einem multimodalen Mikroplatten-Reader, der auf Anregung bei 490 nm und Detektion bei 530 nm eingestellt ist (oder mit einem geeigneten Filterset für Calcien-Fluoreszenz).

5. Datenanalyse

1. Analyse zur Assay-Validierung durch Bestimmung des linearen Bereichs der Calcein-Fluoreszenz.
   1. Berechnen Sie die mittleren relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) der Zeilen A-H für jede Konzentration von Calcein in den Spalten der 96-Well-Platte aus Schritt 1 und plotten Sie gegen die Konzentration. Zeichnen Sie das Liniendiagramm der Calcein-Konzentration auf der x-Achse gegen die mittlere RFU auf der y-Achse, und verwenden Sie eine lineare Regression, um die Linie der besten Anpassung zu erhalten.
   2. Quantifizieren Sie die statistische Signifikanz durch Vergleich der Calcein-Konzentrationen in jeder Spalte (2-11) mit der PBS-Kontrolle in Spalte 1 Zeilen A bis E. Führen Sie eine Varianzanalyse (ANOVA) durch und wenden Sie eine Post-hoc-Analyse unter Verwendung der niederwertigsten Differenz (LSD) mit einem Schwellenwert von p <0,001 an, um die statistische Signifikanz zu bestimmen (in Abbildung 1 durch ** gekennzeichnet).
2. Analyse zur Assay-Validierung durch Fe²⁺ -Ionen-Quenchung zur Reduzierung der Calcein-Fluoreszenz.
   1. Berechnen Sie die durchschnittlichen relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) der Zeilen A bis E für jede FAS-Konzentration in den Spalten 2-11. Plotten Sie die mittlere RFU für jede FAS-Konzentration auf der y-Achse. Auf der x-Achse werden die Konzentrationen von FAS unter Verwendung einer Log2-Skala dargestellt, da diese die Daten besser verteilt. Zeichnen Sie eine Linie der besten Anpassung mithilfe einer linearen Regression.
   2. Quantifizieren Sie die statistische Signifikanz durch Vergleich des Mittelwerts der Spalten mit dem Mittelwert RFU der PBS-Kontrolle, 1 μM Calcein, 0 μM FAS (Spalte 1 Zeile A bis E). Führen Sie eine APNOVA mit LSD-Post-hoc-Analyse mit einem Schwellenwert von p <0,001 durch, um die statistische Signifikanz zu bestimmen.
3. Analyse für den Assay: Quantifizierung der Fähigkeit von Eisenchelatoren, den schwachen Chelator Calcein um Fe²⁺ -Ionen zu übertreffen.
   1. Berechnen Sie die durchschnittlichen relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) der Zeilen A bis E für jede Chelatorkonzentration in den Spalten 2-11. Plotten Sie die mittlere RFU für jede Chelatorkonzentration auf der y-Achse. Plotten Sie auf der x-Achse die Chelatorkonzentrationen mit einer Log2-Skala, da sie die Daten besser verteilt.
   2. Quantifizieren Sie die statistische Signifikanz durch Vergleich des Mittelwerts der Spalten mit dem Mittelwert RFU der Kontrolle von PBS 1 μM Calcein und 10 μM FAS (Spalte 1 Zeile A bis E). Führen Sie eine APNOVA mit LSD-Post-hoc-Analyse mit einem Schwellenwert von p <0,001 durch, um die statistische Signifikanz zu bestimmen.

Results

Für die in Schritt 2 gezeigte Methode wurde in diesem ersten Experiment (Abbildung 1) der lineare Bereich des Mikrotiter-Fluoreszenzplatten-Readers bei der Detektion von Calcein-Fluoreszenzemissionen ermittelt. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen einen weiten linearen Bereich der Calcein-Fluoreszenz von 0-100 μM. Die ANOVA mit LSD-Post-hoc-Analyse zeigt, dass es für alle Calcein-Konzentrationen statistisch signifikante Unterschiede in der mittleren RFU im Vergleich zu einer Kontrolle von 0 μM Calcein gibt. In weiteren Experimenten wurde 1 μM Calcein verwendet (Schritte 3 und 4), da es statistisch signifikante Unterschiede zur 0 μM-Kontrolle aufweist und in den Bereich fällt, in dem es in der Durchflusszytometrie üblicherweise in Form von Calcein AM auf Zellen angewendet wird¹³.

Für die in Schritt 3 gezeigte Methode zeigen wir, dass die Fe²⁺-Ionen zu einer linearen Abnahme der Calcein-Fluoreszenz (RFU) führen, wenn Eisen in Form von Fe²⁺ in einem Bereich von 0-1000 μM (als FAS) zu 1 μM Calcein hinzugefügt wird. Dies ermöglicht die Beobachtung einer Fe^2+-basierten Quenchung der Calcein-Fluoreszenz. Calcein als schwacher Eisenchelator bindet Eisen und dies reduziert die Fluoreszenzleistung. In Abbildung 2 zeigten Konzentrationen von 8,9 μM FAS und höher eine signifikante Abnahme der Calcein-Fluoreszenz um p<0,001 im Vergleich zu 1 μM Calcein allein. Die Verwendung von 8,9 μM FAS entsprach einer 33%igen Reduktion der Calcein-Fluoreszenz (mittlere RFU). Für weitere Experimente (Schritt 4) wurde 10 μM FAS verwendet, da es im Bereich der Fluoreszenzlöschung von Calcein lag.

Für die in Schritt 4 gezeigte Methode ist in Abbildung 3 die Verdrängung von Calcein um Fe²⁺-Ionen durch einen Eisenchelator zu beobachten. Eisen in Form von Fe²⁺ verringert die Calcein-Fluoreszenz von der 1 μM-Kontrolle und der Eisenchelator Deferipron erhöht diese Fluoreszenz bis zu einem Peak, wodurch die Eisenabschreckung von Calcein freigesetzt und die Fluoreszenz (mittlere RFU) erhöht wird. Deferipron (als Beispiel verwendet) in Konzentrationen von 0,97-512 μM führte zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Fluoreszenz, wie bei der ANOVA- und LSD-Post-hoc-Analyse beobachtet wurde (p<0,001). Die größte Faltungsänderung war eine 3-fache Änderung der mittleren RFU bei 62,5 μM Chelator im Vergleich zur Kontrolle von 1 μM Calcein AM und 10 μM FAS. Oberhalb von 512 μM Deferipron gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen dem Chelator und der Kontrolle von 1 μM Calcein und 10 μM FAS.

Abbildung 1: Bestimmung der Calceinkonzentrationen und der Fluoreszenz (RFU) mit einem fluoreszierenden Mikrotiterplatten-Reader. Die Calcein-Konzentrationen von 0-100 μM bei 30 min Inkubation und Bestimmung der Fluoreszenz (RFU) sind hier dargestellt. Die Daten zeigen den Mittelwert von 8 Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, Fehlerbalken zeigen ein Konfidenzintervall von 95 % im Mittelwert. Die statistische Signifikanz wird mit ** bezeichnet, wobei p<0,001, bestimmt mit Hilfe der ANOVA und der LSD-Post-hoc-Analyse (berechnet mit dem Graph-Pad-Prisma). Die mittlere Calcein-RFU jeder Konzentration wird mit der Kontrolle von PBS und 0 μM Calcein verglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Eine Erhöhung der FAS-Konzentration führt zu einer linearen Abnahme der Calcein-Fluoreszenz. Die Konzentration von FAS wurde von 0 auf 1000 μM erhöht, was zu einer linearen Abnahme der 1 μM Calcein-Fluoreszenz nach 30-minütiger Inkubation in PBS führte. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert von 5 Replikaten pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, Fehlerbalken zeigen ein 95%-Konfidenzintervall im Mittelwert. Die statistische Signifikanz wird mit ** bezeichnet, wobei p<0,001, bestimmt mit Hilfe der ANOVA und der LSD-Post-hoc-Analyse (berechnet mit dem Graph-Pad-Prisma). Die mittlere Calcein-RFU jeder Konzentration von FAS und 1 μM Calcein wird mit der Kontrolle von 1 μM Calcein und 0 μM FAS in PBS verglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Steigende Konzentrationen von Deferipron. Die Konzentration von Deferipron wurde von 0-1000 μM durch Inkubation von 1 μM Calcein, 10 μM FAS in PBS erhöht. Die Fluoreszenz wurde auf einem multimodalen Mikroplatten-Reader gemessen. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert von 5 Wiederholungen pro Experiment und drei unabhängigen Experimenten, Fehlerbalken zeigen ein 95%-Konfidenzintervall im Mittelwert. Die statistische Signifikanz wird mit ** bezeichnet, wobei p<0,001, bestimmt mit Hilfe der ANOVA und der LSD-Posthoc-Analyse (berechnet mit dem Graph-Pad-Prisma). Mittlere RFU im Vergleich zu 1 μM Calcein in PBS mit 10 μM FAS und 0 μM Deferipron. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Konzentration (μm)	Volumen ab (1 Mio. Lagerbestand)	Volumen von PBS	Gesamtvolumen
800	800 μL	200 μL	1 mL
400	400 μL	600 μL	1 mL
200	200 μL	800 μL	1 mL
100	100 μL	900 μL	1 mL
50	50 μL	950 μL	1 mL
25	ca. 25 μl	975 μL	1 mL
10	10 μL	990 μL	1 mL
6	6 μL	994 μL	1 mL
2	2 μL	998 μL	1 mL
1	1 μL	999 μL	1 mL

Tabelle 1: Aufbereitung von Calcein-Sekundärstoffen.

Discussion

Die übermäßige Abhängigkeit von Krebserkrankungen von Eisen, um ihren Stoffwechsel anzukurbeln, macht die Eisenchelatbildung zu einer potenziellen Ergänzung zu therapeutischen Therapien⁴. Es gibt jedoch nur eine begrenzte Möglichkeit, neuartige Metallionenchelatoren schnell auf ihre Fähigkeit zur Bindung von Eisenionen zu untersuchen. Die häufig verwendete und weit verbreitete Fluoreszenzsonde Calcein ist dafür bekannt, dass sie als schwacher Eisenchelator wirkt und die Bindung durch Eisenionen die Calcein-Fluoreszenz löscht. Die Fluoreszenz kann dann wiederhergestellt werden, indem mit einem stärkeren Eisenchelator um die Bindung an Eisen konkurriert wird. Die beobachtete Verringerung der Fluoreszenz, da Calcein Eisen bindet, und die Wiederherstellung der Fluoreszenz, wenn sie von einem stärkeren Chelator verdrängt wird, bietet eine schnelle und einfache Methode zum Screening neuartiger Verbindungen mit Eisenchelat-Potenzial. Während Calcein-basierte Techniken¹³ bereits verwendet werden, um die Fähigkeit von Chelatoren zur Bindung von Eisen in Zellen sichtbar zu machen, erfordern diese Techniken kostspielige Durchflusszytometrie-Geräte, sind nur semi-quantitativ, erfordern eine umfangreiche Schulung des Personals und die Verwendung der teureren zellpermeierten Form von Calcein, Calcien-AM. Darüber hinaus ist die Technik schlecht reproduzierbar und erleichtert die Bestimmung der Datensignifikanz durch statistische Analyse nicht ohne weiteres. Aus diesem Grund haben wir eine einfache, kostengünstige in vitro Methode entwickelt, die als First-Pass-Screening für die chelatbildenden Fähigkeiten einer neuartigen Verbindung dienen kann. Dieser zellfreie Assay macht kostspielige Zellkulturmethoden überflüssig und bietet ein First-Pass-Screening mit hohem Durchsatz für die Fähigkeit der Eisenchelatbildung.

Es besteht ein zunehmendes Interesse an der Früherkennung oder Entwicklung neuartiger Eisenchelatoren, die zur Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt werden können, da sie auf Eisen angewiesen sind, um ihre metabolischen Anpassungen voranzutreiben². In dieser Arbeit beschreiben wir eine in vitro Technik, die verwendet werden kann, um die Fähigkeit neuartiger Verbindungen zu bestätigen, Eisen zu chelatieren, indem sie den schwachen Chelator Calcein verdrängen. Dies ermöglicht ein einfaches, quantitatives und kostengünstiges Screening neuartiger Verbindungen auf ihre Eisenchelatisierungsfähigkeit.

Einer der kritischen Schritte im Protokoll ist die Bestimmung des linearen Bereichs des fluoreszierenden Mikrotiterplatten-Readers (Abbildung 1). Calcein hat ein breites fluoreszierendes Anregungs- und Emissionsspektrum, das sich um einen Anregungspeak von 501 nm und einen Emissionspeak bei 521 nm konzentriert. Der lineare Bereich des Calceins kann jedoch von den Filtern abhängen, die zur Anregung und Detektion von Calcein-Fluoreszenzemissionen verwendet werden, und der lineare Bereich des Photomultipliers, der bei der Detektion verwendet wird, wird auch teilweise den linearen Bereich bestimmen. Daher ist es wichtig, zunächst den Konzentrationsbereich zu bestimmen, bei dem die Calcein-Fluoreszenz linear ist, um sicherzustellen, dass der Assay innerhalb des linearen Bereichs von Calcein auf dem Fluoreszenzplatten-Reader arbeitet. Angesichts der Tatsache, dass wir eine Linearität zwischen 0 und 100 mM Calcein beobachtet haben, zeigt dies, dass Calcein einen breiten linearen Bereich hat. Darüber hinaus verfügen fluoreszierende Mikrotiterplatten-Reader in der Regel über Filtersets, die die Calcein-Fluoreszenz messen können, da sie ähnliche Spektren wie einige der am häufigsten verwendeten grünlichtemittierenden Fluorophore aufweist. Daher ist dieser Assay für eine Vielzahl von Anwendern anwendbar.

Die Verwendung von FAS als Eisenionendonor wird bevorzugt, da es Fe²⁺ -Ionen liefert, das Haupteisenion im labilen Eisenpool in Zellen. Ähnliche Ergebnisse wie die hier gezeigten (Abbildung 2) wurden jedoch mit Eisenammoniumchlorid (FAC) erzielt, das Fe³⁺ liefert (Daten nicht gezeigt). Daher ist der Assay mit beiden Redoxzuständen von Eisenionen kompatibel, wodurch die Anwendbarkeit auf Chelatoren mit Präferenz für einen dieser Redoxzustände erweitert wird.

In dieser Studie präsentieren wir Daten für den Eisenchelator Deferiprone, aber wir haben auch die Fähigkeit anderer Eisenchelatoren, einschließlich Mimosin, untersucht, Calcein um die Eisenionenbindung mit diesem Assay zu übertreffen (Daten nicht gezeigt). Eine der Einschränkungen des Assays besteht darin, dass oberhalb von 512 mM des Chelators Deferipron kein statistisch signifikanter Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zu einer Kontrolle von 1 μM Calcein und 10 μM FAS zu verzeichnen war. Es ist unklar, warum höhere Konzentrationen von Chelatoren nicht zu einem Anstieg der Fluoreszenz führen, obwohl dies bei anderen Chelatoren beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Eine therapeutische Leitsubstanz sollte jedoch <100 μM wirken, damit der Assay in Konzentrationsbereichen arbeitet, die für die Wirksamkeit der Leitsubstanz erforderlich sind.

Dieser Assay ermöglicht daher ein schnelles Screening jedes potenziellen Eisenchelators auf die Fähigkeit, Eisen als Nachweis des Mechanismus zu chelatieren. Dies ist ein wichtiger erster Schritt, bevor die neuartigen Chelatoren in teuren und aufwendigen zellbasierten oder in vivo Assays gescreent werden. Eine Einschränkung dieses Assays besteht darin, dass er unter Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels durchgeführt wird und daher erfordert, dass der Chelator in wässrigen Puffern löslich ist. Da jedoch die höchste in dieser Studie verwendete Konzentration 10 mM Deferipron war, ein kleiner lipophiler Eisenchelator¹⁵, können Chelatoren mit begrenzter wässriger Löslichkeit weiterhin getestet werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich der hier beschriebene Assay als wertvoll für das Screening neuartiger Eisenchelatoren erweisen kann, das ein ständiger Schwerpunkt der Entwicklung von Krebstherapien ist.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammoniumeisen(II)-sulfat-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	215406	auch bekannt als FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferipron	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	D5652	magnesium- und calciumfreie
Greiner CELLSTAR 96-Well-Platten	Sigma-Aldrich	M0812	jede optisch transparente 96-Well-Platte funktioniert