Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen sind der grundlegendste Teil biologischer Phänomene. Protein-Protein-Wechselwirkungen machen einen wesentlichen Teil solcher Wechselwirkungen aus. Daher ist die Identifizierung des/der Interaktionspartners/-partners eines interessierenden Proteins von entscheidender Bedeutung, um die Funktion des interessierenden Proteins/Gens weiter aufzuklären. Die Hefe-Zwei-Hybrid-Methode (Y2H) ist eine beliebte Technik zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo¹. In diesem System werden zwei Proteine (X und Y), deren Interaktion getestet werden soll, mit der DNA-bindenden (DB) Domäne bzw. der transkriptionellen Aktivierungsdomäne (AD) fusioniert. Das DB-X-Fusionsprotein bindet an eine Erkennungssequenz der DB-Domäne; Wenn also die Proteine X und Y interagieren, kommt das AD-Y-Fusionsprotein in die Nähe der Erkennungssequenz. Dadurch wird die Transkription des Reportergens stromabwärts der Erkennungssequenz aktiviert. Daher kann das Vorhandensein oder Fehlen von Reportergenaktivität verwendet werden, um das Vorhandensein oder Fehlen der Protein-Protein-Interaktion^{zu bestimmen 1}.

Sobald ein spezifischer Interaktionspartner des interessierenden Proteins identifiziert ist, sollten weitere Analysen durchgeführt werden, um die biologische Funktion der Interaktion aufzuklären. Zu diesem Zweck können Mutanten der Proteine, die die spezifische Protein-Protein-Interaktion beeinträchtigen oder entfernen, isoliert werden, als mächtige Werkzeuge dienen. Das Y2H-System kann direkt verwendet werden, um solche Mutanten zu isolieren, indem "interaktionsnegative" Klone gescreent werden, beginnend mit dem "interaktionspositiven" Wildtyp-Klon. Um diesen Prozess zu beschleunigen, wurden "umgekehrte" Y2H-Systeme (rY2H) entwickelt ^2,3. In rY2H-Systemen beherbergen die Wirtshefestämme gegenselektierbare Markergene als Reportergene, was bedeutet, dass Hefezellen nur dann wachsen, wenn die Proteine AD-Y und DB-X nicht interagieren.

Obwohl sowohl das Y2H- als auch das rY2H-System die Isolierung von interaktionsnegativen Mutanten ermöglichen, ist der Prozess der Isolierung der Mutanten mühsam, da nicht alle durch das Screening erhaltenen Kandidaten die gewünschte Art von Mutationen (in der Regel Missense-Mutationen) tragen. Das schwerwiegendste Problem ist, dass ein erheblicher Teil der Kandidaten Frameshift- oder Nonsense-Mutationen aufweist und es notwendig ist, Western Blotting durchzuführen, um unerwünschte Klone auszuschließen. Um dieses Problem zu lösen, wurden neue Plasmidvektoren entwickelt⁴. In diesen Vektoren wird KanMX, ein Arzneimittelresistenzmarker, außerhalb des Rahmens stromabwärts der DB-Domäne oder AD positioniert. Das Markergen wird nur dann mit der DB-Domäne oder AD im Frame, wenn das interessierende Gen eingefügt wird. Wenn eine oder mehrere zufällige Mutationen in das interessierende Gen eingeführt werden, können unerwünschte Mutanten, wie z. B. solche mit Frameshift- oder Nonsense-Mutationen, durch eine Arzneimittelresistenzselektion leicht eliminiert werden, und Kandidaten, die erwünschte Missense-Mutationen tragen, können mit dem Y2H-Screening leicht identifiziert werden⁴. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten eines Proteins von Interesse unter Verwendung dieser Strategie vorgestellt.

1. Aufbau der Mutantenbibliothek

1. Richten Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein (ein Beispiel ist unten dargestellt). Im Allgemeinen werden 50 μl der Reaktion vorbereitet, die in zehn Aliquots von 5 μl unterteilt sind, und das Zielgenfragment in einer PCR-Maschine⁴ amplifiziert.
   HINWEIS: Benutzer sollten eine geeignete Polymerase auswählen, um Mutationen effizient einzuführen. Wenn das zu amplifizierende DNA-Fragment kurz ist, wird eine Polymerase mit einer höheren Fehlerrate benötigt, wie z. B. die Taq-Polymerase, der es an Korrekturleseaktivität mangelt. Wenn das zu amplifizierende DNA-Fragment lang ist, ist eine Polymerase mit höherer Genauigkeit erforderlich, um die Anzahl der Mutationen zu reduzieren. Mutationen treten alle paar hundert Basenpaare nach 30 Amplifikationszyklen mit regulärer Taq-Polymerase⁴ auf. In den repräsentativen Ergebnissen wurde eine andere Taq-Polymerase verwendet (siehe Materialtabelle), die eine höhere Genauigkeit als die reguläre Taq-Polymerase aufweist, und die Mutationsrate lag bei eins zu 600 Basenpaaren. Ein Beispiel für die PCR-Gemische, die Primer-Details und die Reaktionsbedingungen finden Sie in der Zusatzdatei 1.
2. Wenn die PCR abgeschlossen ist, kombinieren Sie alle Aliquots der Reaktion, bestätigen Sie, dass die interessierenden DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese usw. amplifiziert wurden, und reinigen Sie die DNA⁵.
3. Assemblieren Sie das in Schritt 1.2 erzeugte DNA-Fragment mit dem entsprechenden Y2H-Vektor unter Verwendung einer "nahtlosen" Klonierungsstrategie (Abbildung 1).
   HINWEIS: Das nahtlose Klonierungssystem, wie z. B. die Gibson-Assemblierung⁶, minimiert die Kontamination der konstruierten Mutantenbibliothek durch leere Vektoren, die durch Selbstligation erzeugt werden. Eine Liste der Y2H-Vektoren ist in Tabelle 1 enthalten. Sie können vor dem Zusammenbau durch BamHI-Aufschluss vorbereitet werden. Alle Plasmide sind über das National BioResource Project - Hefe erhältlich (siehe Materialtabelle).
4. Das in Schritt 1.3 erzeugte Reaktionsgemisch wird in Escherichia coli-kompetente Zellen eingebracht, die nach einem hocheffizienten E. coli-Transformationsprotokoll (z. B. Inoue et ^al.7) hergestellt wurden. Verteilen Sie alle kompetenten Zellen auf mehrere LB-Platten (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl und 2 % Agar), die geeignete Antibiotika enthalten (siehe Materialtabelle). Verteilen Sie an dieser Stelle eine kleine Menge (~1/100 der Gesamtreaktion) auf dieselbe Auswahlplatte, um den Bibliothekstiter zu berechnen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
5. Sobald eine große Anzahl von E. coli-Kolonien aufgetaucht ist, kratzen Sie alle Zellen mit einer Einweg-Plastikschlaufe von der Oberfläche der Platte ab. Gewinnen Sie Plasmid-DNA aus diesen Zellen mit gängigen Methoden, wie z. B. der alkalischen Lyse⁸. Zählen Sie gleichzeitig die Anzahl der Kolonien, die nach dem Verteilen kleiner Aliquots der Transformationsmischung auf der Platte erscheinen. Schätzen Sie anhand dieser Zahl die Gesamtzahl der unabhängigen Klone in der Bibliothek.
   HINWEIS: Nehmen Sie an dieser Stelle einige unabhängige Kolonien (4-6), die auf der Platte erscheinen, auf der die kleinen Aliquoten der Transformationsreaktion verteilt wurden, kultivieren Sie sie separat und isolieren Sie Plasmide von ihnen, um zu bestätigen, dass praktisch alle Klone die gewünschten DNA-Fragmente tragen⁵. Es gibt viele kommerzielle Kits, um Plasmide aus E. coli zu isolieren. Die Anzahl der Kolonien, die nach dem Ausbringen kleiner Aliquots auf der Platte erscheinen, kann manuell gezählt werden.
6. Messen Sie die Konzentration des DNA-Pools der Bibliothek. In der Regel reichen einige hundert Nanogramm Bibliotheks-DNA aus, um im nächsten Schritt mehrere tausend Transformanten zu erhalten.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die DNA-Konzentration mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu messen, der an die DNA bindet, da die Messung von A₂₆₀ häufig ungenau ist.

2. Transformation der Hefe mit der Mutantenbibliothek und Replikationsplattierung

1. Die mutierte Bibliothek wurde für den Y2H-Assay mit etwa 100 ng DNA in den Wirtshefestamm (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) für den Y2H-Assay eingeführt. Vortransformieren Sie die Wirtszellen mit dem "Köder"-Plasmid.
   1. Nach dem Transformationsverfahren werden Hefezellen in sterilem Wasser suspendiert und Aliquots in unterschiedlichen Mengen auf geeignete Platten verteilt (in der Regel SC-Medium ohne Leucin und Tryptophan: SC-LW [0,67 % Hefestickstoffbase, 2 % Glukose, 1,546 g/L SC-Doppeldrop-out-Mix -Leu-Trp und 2 % Agar, siehe Materialtabelle]). Inkubieren Sie diese Platten über Nacht bei 30 °C.
      HINWEIS: Das Standardprotokoll, wie z.B. die Lithiumacetat-PEG-Methode¹¹ mit ~5 × 10⁶ logarithmisch wachsenden Zellen, ist für die Umwandlung von Hefe ausreichend. Eine andere Methode mit einer hohen Umwandlungseffizienz, wie z. B. die Elektroporation, kann ebenfalls verwendet werden.
2. Am nächsten Tag, wenn winzige Kolonien erscheinen, wählen Sie die Platten mit einer geeigneten Anzahl von Zellen (500-2000) aus und replizieren Sie sie wie folgt.
3. Legen Sie zwei Blatt Filterpapier auf einen Replikblock, um mehrere Repliken herzustellen (Medium ist SC-LW und SC-LW mit Kanamycin) (siehe Materialtabelle). Bei 30 °C 1-2 Tage inkubieren.
   HINWEIS: Die Konzentration von Kanamycin (G418) beträgt 600 μg/ml. Verwenden Sie keinen Samt für die Nachbildung, da sonst die Auflösung der Kolonien verloren geht.
4. Sobald die Völker gewachsen sind, vergleichen Sie die Platten und wählen Sie Kandidaten aus. Führen Sie einen Y2H-Farbassay durch (siehe Schritt 3), wenn lacZ als Reporter verwendet wird.
   HINWEIS: Für den Y2H-Reporter ist lacZ in der Regel besser in der Lage, eine schwache Wechselwirkung zu erkennen als HIS3.

3. Y2H-Farbtest

1. Legen Sie ein Blatt Filterpapier, das Sie zuvor auf das entsprechende Format zugeschnitten haben, auf die mit Schritt 2 vorbereitete Replikplatte. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Filterpapier und der Platte bilden.
   HINWEIS: Verwenden Sie Filterpapier Nr. 4A oder Filterpapier der Güteklasse 50 (siehe Materialtabelle). Alle SC-LW oder SC-LW mit Kanamycin-Platten, die durch Replikatbeschichtung hergestellt werden, können für den Farbassay verwendet werden.
2. Wenn das Filterpapier auf der Platte vollständig angefeuchtet ist (wenn sich die Farbe des Filterpapiers vollständig ändert), legen Sie mehrere Blätter Papiertuch darauf und bringen Sie es in Kontakt mit dem Filterpapier, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Entfernen Sie das Papiertuch, wenn es das Wasser aufnimmt und seine Farbe ändert. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal.
3. Nehmen Sie die Ränder des Filterpapiers mit einer Pinzette auf, ziehen Sie es schnell von der Platte ab, tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff und frieren Sie es ein. Wenn kein flüssiger Stickstoff verfügbar ist, legen Sie das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf eine Kunststoffschale und legen Sie es sofort in einen Gefrierschrank (-20 °C bis -80 °C), um es vollständig einzufrieren.
4. Entfernen Sie das gefrorene Filterpapier und legen Sie es mit der Kolonieseite nach oben zum Auftauen auf ein trockenes Papiertuch. Unmittelbar nach dem Auftauen wird das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf ein anderes Filterpapier gelegt, das auf eine Kunststoffschale oder einen verschließbaren Behälter gelegt und mit Z-Puffer (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl und 1 mM MgSO₄, pH 7,0) getränkt wurde, das X-Gal (5-Brom-5-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 2-Mercaptoethanol⁹ enthält (siehe Materialtabelle). Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen zwischen dem oberen und unteren Filterpapier bilden.
5. Decken Sie die Plastikschale mit dem Filterpapier ab und geben Sie sie in einen luftdichten Behälter oder eine Plastiktüte. Verschließen Sie den luftdichten Behälter oder die Plastiktüte und inkubieren Sie sie bei 37 °C, bis eine blaue Farbe erscheint.
6. Wenn eine blaue Farbe erscheint, legen Sie das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf etwa 500 μl Stopplösung (1 M Na₂CO₃) auf eine saubere Kunststoffschale. Stopp, die Lösung zieht schnell ein; Entfernen Sie daher sofort den Filter, legen Sie ihn mit der Kolonieseite nach oben auf ein frisches Papiertuch und lassen Sie ihn trocknen.
7. Nachdem das Papiertuch ausgetauscht wurde und der Filter trocken genug ist, verwenden Sie einen Scanner oder ein anderes Gerät, um die Daten zu erfassen.

4. Wiederfindung und Bestätigung von Klonkandidaten

1. Wählen Sie weiße und Kan^{R-Kandidatenklone} aus der Originalplatte der Replik (oder der replizierten Platte, die nicht für den Farbassay verwendet wird) aus. Beispiele sind in Abbildung 1C dargestellt. Bestätigen Sie, dass die Klonkandidaten weiß und Kan^R sind, indem Sie sie als kleinen Fleck auf SC-LW-Medium, das Kanamycin enthält, erneut streifen und 1-2 Tage lang bei 30 °C inkubieren. Machen Sie mindestens zwei Sätze oder machen Sie Repliken am nächsten Tag.
   HINWEIS: Weiße Kolonien sollten ausgewählt werden, da hellblaue Kolonien die Wechselwirkung beibehalten können.
2. Sobald die Klonkandidaten gut nachgewachsen sind, wiederholen Sie den Farbtest mit mindestens einer Platte, die in Schritt 4.1 erzeugt wurde, wie in Schritt 3 beschrieben, und vergewissern Sie sich, dass sie weiß bleiben und nicht blau werden (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Wenn Sie die Kandidaten erneut streifen, übertragen Sie keine großen Mengen an Zellen. Zu viele Zellen machen es unmöglich, Kan^R- und Kan S-Klone zu unterscheiden.
3. Nehmen Sie Klone, die noch weiß sind und das in Schritt 4.2 erzeugte^{Kan R} aus den Plattenresten und züchten Sie unabhängig voneinander in 1 mL Selektionsmedium (SC-L oder SC-W, je nachdem, welcher Vektor für den Bibliotheksaufbau verwendet wird) über Nacht bei 30 °C.
4. Übertragen Sie die Kultur in ein Mikroröhrchen und sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation (~15.000 × g, für 10-30 Sekunden bei Raumtemperatur). Isolieren Sie die gesamte DNA aus dem Zellpellet wie folgt.
5. Das Zellpellet wird in 400 μl Lysepuffer (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) und 1 mM EDTA) mit je 1 μl 2-Mercaptoethanol und 20 mg/ml Zymolyase 100T (siehe Materialtabelle) suspendiert und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellwände zu verdauen. Mischen Sie zu diesem Zeitpunkt vorsichtig, indem Sie die Tube alle 5-10 Minuten umdrehen.
6. Wenn die Zellsuspension undurchsichtig oder durchscheinend geworden ist, fügen Sie ein gleiches Volumen eines Gemischs aus Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu und mischen Sie es gut, indem Sie es 10-20 s lang bei mäßiger Geschwindigkeit vortexen.
7. Zentrifugieren Sie die Mikroröhrchen in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei voller Geschwindigkeit (~15.000 × g, bei Raumtemperatur) und gewinnen Sie die wässrige Phase, die die DNA enthält, in einem neuen Mikroröhrchen zurück. Fügen Sie 0,8 Volumen Isopropanol hinzu und mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen umdrehen.
8. Lassen Sie das Röhrchen 2-3 min bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann in einer Mikrozentrifuge für 4-5 min bei voller Geschwindigkeit (~15.000 × g, bei Raumtemperatur), um die DNA auszufällen.
9. Den Überstand entfernen und den Niederschlag mit ca. 500 μl 70%igem Ethanol waschen. Entfernen Sie das Ethanol vollständig und trocknen Sie den Niederschlag kurz ab.
10. Geben Sie 20 μl TE-Puffer (10 mM Tris-Cl (8,0) und 1 mM EDTA) zum Niederschlag, mischen Sie kurz und lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur, um den Niederschlag aufzulösen.
    HINWEIS: Wenn Benutzer es eilig haben, halten Sie die Röhrchen bei 37-50 °C. Der DNA-Niederschlag löst sich in wenigen Stunden auf.
11. Sobald das Pellet vollständig aufgelöst ist, transformieren Sie E. coli mit einer kleinen Menge dieser DNA-Lösung.
    HINWEIS: Etwa 0,5 μl DNA-Lösung sind ausreichend, wenn E. coli mit einer hohen Transformationseffizienz verwendet wird.
12. Wenn E. coli-Kolonien auftreten, wählen Sie mehrere unabhängige Kolonien aus, kultivieren Sie sie und gewinnen Sie Plasmide mit Standardmethoden, wie z. B. alkalischer Lyse.
13. Führen Sie die in Schritt 4.12 erhaltene Plasmid-DNA in Y2H-Wirtszellen ein, die das Köderplasmid beherbergen. Wenn Transformanten auftreten, überprüfen Sie sie mit dem Farbtest (sie sollten weiß erscheinen) und Western Blot⁴ (sie sollten ein Protein der gewünschten Größe exprimieren).
    HINWEIS: Die postalkalische Methode¹² ist eine einfache und schnelle Möglichkeit, einen Ganzzellextrakt aus Hefe herzustellen.
14. Wenn die beiden oben genannten Kriterien erfüllt sind, bestimmen Sie die Mutationsstelle der Klone durch Nukleotidsequenzierung⁴.

Kürzlich wurde festgestellt, dass die C-terminale Hälfte des Pol2-Proteins (Pol2-C) mit Mcm10 interagiert. Beide Proteine sind essentiell für die Initiierung der DNA-Replikation und damit für das Zellwachstum in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Um die biologische Bedeutung dieser Interaktion besser zu verstehen, wurden Pol2-C-Mutanten, die keine/nur eine verminderte Wechselwirkung mit Mcm10 aufweisen, mit der hier beschriebenen Methode isoliert.

Eine Mutationsbibliothek wurde nach der in Schritt 1 beschriebenen Methode erstellt. Pol2-C-DNA-Fragmente wurden mit GoTaq-Polymerase amplifiziert und unter Verwendung des In-Fusion-Enzyms in den Gal4AD (pST2525)-Vektor kloniert. Die Anzahl der unabhängigen Klone in der Bibliothek wurde auf 5000 geschätzt.

Wie in Schritt 2 beschrieben, wurde die DNA des Bibliotheksplasmids in den Y2H-Wirtsstamm TAT-7 eingeführt, der mit dem LexA-Mcm10-Plasmid vortransformiert wurde. Die Zellen wurden auf eine SC-LW-Platte verteilt und am nächsten Tag auf SC-LW- und SC-LW+G418-Platten repliziert. Die Replikate wurden dem Farbassay unterzogen, wie in Schritt 3 beschrieben. Einige der Ergebnisse des Farbassays sind in Abbildung 1C dargestellt.

Siebenundvierzig Kolonien, die im Farbassay weiß und G418-resistent waren, wurden als erste Kandidaten aus etwa 8500 Transformanten isoliert. Sie wurden erneut mit dem Farbassay getestet, und es wurde bestätigt, dass 25 der 47 Klone weiß waren (Abbildung 2A). Diese 25 Klone wurden als Kandidaten beibehalten. Von jedem der 25 Kandidaten wurden Plasmid-DNAs gewonnen, wie in Schritt 4 beschrieben. Sie wurden wieder in Y2H-Hefe-Wirtszellen eingeführt, die LexA-Mcm10 beherbergen, und mit dem Farbassay getestet, und es wurden 16 Klone ausgewählt, denen es an Farbe mangelte. Um weiter zu bestätigen, dass es sich um Pol2-C-Missense-Mutanten handelte, wurde die Expression des Pol2-C-Proteins durch Western Blot bestätigt. Zwölf Kandidaten wiesen eine Bande an einer Position auf, die fast der der Positivkontrolle entsprach (Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX Fusionsprotein, berechnet m.w.: 158,8 kDa) (Abbildung 2B). Der Farbassay zeigte, dass diese 12 Klone nicht mit Mcm10 interagierten (Abbildung 2C). Nach der Bestimmung der Nukleotidsequenzen dieser Klone wurde bestätigt, dass alle von ihnen eine oder mehrere Missense-Mutationen aufwiesen. Die Anzahl der Missense-Mutationen variierte zwischen einer und fünf (Daten nicht gezeigt). Im Durchschnitt trat etwa eine Missense-Mutation pro 1000 Basen auf.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Y2H-basierten Ansatzes zum Screening von Interaktions-Null/beeinträchtigten Mutanten. (A) Das Y2H-System. (B) Strategie zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten. 1: Der neu konstruierte Y2H-Vektor enthält eine Kopie des KanMX-Gens stromabwärts des Y2H-Tags, der DB-Domäne und der AD. Wichtig ist, dass diesem KanMX-Gen ein Startcodon fehlt und es mit dem Y2H-Tag nicht im Rahmen ist. Daher ist nicht zu erwarten, dass das KanMX-Gen aus diesem Vektor exprimiert wird. Wenn das PCR-amplifizierte DNA-Fragment in den Vektor eingefügt wird, wird das KanMX-Gen mit dem Y2H-Tag im Rahmen des Y2H-Tags exprimiert. Folglich können nur Plasmide, die das Wildtyp-Insert oder ein Insert mit einer oder mehreren Missense-Mutationen beherbergen, das KanMX-Gen exprimieren, was eine Resistenz gegen G418 verleiht. Plasmide mit einer oder mehreren Nonsense- oder Frameshift-Mutationen können das KanMX-Gen nicht exprimieren. 2: Die in Schritt 1 konstruierte Mutantenbibliothek wird in die Y2H-Wirtshefezellen eingeführt. Wenn Transformanten auftauchen, werden Repliken hergestellt. Durch den Vergleich der Expression eines oder mehrerer Reportergene und der Resistenz gegen G418 können Kandidaten für interaktionsnull/beeinträchtigte Mutanten ausgewählt werden. (C) Ein Beispiel für Screening. Die Plasmidbibliothek, die Gal4-AD und ein PCR-mutagenisiertes Pol2-C-DNA-Fragment enthielt, wurde in den Y2H-Wirtsstamm TAT-7 eingeführt, der mit dem LexA-Mcm10-Plasmid vortransformiert wurde. Es werden Bilder von Zellen vor (links) und nach (Mitte) dem Farbassay sowie von Zellen, die auf einer SC-LW+G418-Platte (rechts) gezüchtet wurden, gezeigt. Beispiele für Kandidaten für interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten und falsche Kandidaten sind durch weiße bzw. schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet. (D) DNA-Sequenz um die Klonierungsstelle von Y2H-Vektoren, AD- (oben) und DB-Vektoren (unten). Die Sequenz von den letzten zehn Aminosäuren (aa) des Y2H-Tags (rot) bis zu dem Teil, der den ersten zehn aa von KanMX (grün) entspricht, wird angezeigt. Auch Erkennungsstellen von SmaI und BamHI sind dargestellt. Die Positionen der PCR-Primer werden unten angezeigt, wenn die BamHI-Stelle als Klonierungsstelle verwendet wird. Die gleichen Primer gelten für die Klonierung des interessierenden Gens in die anderen Plasmide (pST2303/2523). Diese Abbildung wurde von Tanaka et al.4 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ein Beispiel für den Screening-Prozess von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten. (A) Die 47 Kolonien, die als Klonkandidaten isoliert wurden, wie in Abbildung 1C gezeigt, wurden erneut auf SC-LW-Medium gezüchtet, das G418 enthielt, und dem Farbassay unterzogen. +: Positivkontrolle (Wt Pol2-C), -: Negativkontrolle (Vektor). Klonkandidaten mit den Nummern 1-25 wurden kultiviert, um Plasmide zu gewinnen. (B) Plasmide wurden von jedem Klonkandidaten in (A) gewonnen, in Y2H-Wirtszellen eingeführt und erneut dem Farbassay unterzogen. Sechzehn von ihnen waren weiß (ohne Farbe). Aus ihnen wurden Ganzzellextrakte hergestellt, und es wurde ein Western Blot mit einem monoklonalen Anti-HA-Antikörper durchgeführt. Die Zahl auf dem Bedienfeld entspricht der Zahl in (A). Es wurden mehrere unabhängige Plasmidklone analysiert, die von jedem Kandidaten mit Ausnahme von #6 gewonnen wurden. (C) Ergebnisse des Farbassays für die letzten 12 Klone. Die Zahlen entsprechen denen in Buchstabe A. #16, das die Wechselwirkung mit Mcm10 beibehielt, wurde als Positivkontrolle im Farbassay verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Liste der Y2H-Vektoren, die KanMX out-of-frame mit dem Y2H-Tag enthalten.

Ergänzende Datei 1: Ein Beispiel für die PCR-Gemische, die Primer-Details und die Reaktionsbedingungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.