Name: Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: Lernen Sie den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Isolierung von Interaktions-Null-Mutanten für Zellzyklus-Regulationsstudien in Eukaryoten. Diese Methode erleichtert das Verständnis kritischer Proteininteraktionen.

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Y. Tanaka führte die technische Verbesserung von Y2H durch. Diese Arbeit wird unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 und das Institute for Fermentation, Osaka.

1. Aufbau der Mutantenbibliothek
<ol><li>Richten Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein (ein Beispiel ist unten dargestellt). Im Allgemeinen werden 50 μl der Reaktion vorbereitet, die in zehn Aliquots von 5 μl unterteilt sind, und das Zielgenfragment in einer PCR-Maschine4 amplifiziert. HINWEIS: Benutzer sollten eine geeignete Polymerase auswählen, um Mutationen effizient einzuführen. Wenn das zu amplifizierende DNA-Fragment kurz ist, wird eine Polymerase mit einer höheren Fehlerrate benötigt, wie z. B. die Taq-Polymerase, der es an Korrekturleseaktivität mangelt. Wenn das zu amplifizierende DNA-Fragment lang ist, ist eine Polymerase mit höherer Genauigkeit erforderlich, um die Anzahl der Mutationen zu reduzieren. Mutationen treten alle paar hundert Basenpaare nach 30 Amplifikationszyklen mit regulärer Taq-Polymerase4 auf. In den repräsentativen Ergebnissen wurde eine andere Taq-Polymerase verwendet (siehe Materialtabelle), die eine höhere Genauigkeit als die reguläre Taq-Polymerase aufweist, und die Mutationsrate lag bei eins zu 600 Basenpaaren. Ein Beispiel für die PCR-Gemische, die Primer-Details und die Reaktionsbedingungen finden Sie in der Zusatzdatei 1.</li>
	<li>Wenn die PCR abgeschlossen ist, kombinieren Sie alle Aliquots der Reaktion, bestätigen Sie, dass die interessierenden DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese usw. amplifiziert wurden, und reinigen Sie die DNA5.</li>
	<li>Assemblieren Sie das in Schritt 1.2 erzeugte DNA-Fragment mit dem entsprechenden Y2H-Vektor unter Verwendung einer "nahtlosen" Klonierungsstrategie (Abbildung 1). HINWEIS: Das nahtlose Klonierungssystem, wie z. B. die Gibson-Assemblierung6, minimiert die Kontamination der konstruierten Mutantenbibliothek durch leere Vektoren, die durch Selbstligation erzeugt werden. Eine Liste der Y2H-Vektoren ist in Tabelle 1 enthalten. Sie können vor dem Zusammenbau durch BamHI-Aufschluss vorbereitet werden. Alle Plasmide sind über das National BioResource Project - Hefe erhältlich (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Das in Schritt 1.3 erzeugte Reaktionsgemisch wird in Escherichia coli-kompetente Zellen eingebracht, die nach einem hocheffizienten E. coli-Transformationsprotokoll (z. B. Inoue et al.7) hergestellt wurden. Verteilen Sie alle kompetenten Zellen auf mehrere LB-Platten (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl und 2 % Agar), die geeignete Antibiotika enthalten (siehe Materialtabelle). Verteilen Sie an dieser Stelle eine kleine Menge (~1/100 der Gesamtreaktion) auf dieselbe Auswahlplatte, um den Bibliothekstiter zu berechnen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.</li>
	<li>Sobald eine große Anzahl von E. coli-Kolonien aufgetaucht ist, kratzen Sie alle Zellen mit einer Einweg-Plastikschlaufe von der Oberfläche der Platte ab. Gewinnen Sie Plasmid-DNA aus diesen Zellen mit gängigen Methoden, wie z. B. der alkalischen Lyse8. Zählen Sie gleichzeitig die Anzahl der Kolonien, die nach dem Verteilen kleiner Aliquots der Transformationsmischung auf der Platte erscheinen. Schätzen Sie anhand dieser Zahl die Gesamtzahl der unabhängigen Klone in der Bibliothek. HINWEIS: Nehmen Sie an dieser Stelle einige unabhängige Kolonien (4-6), die auf der Platte erscheinen, auf der die kleinen Aliquoten der Transformationsreaktion verteilt wurden, kultivieren Sie sie separat und isolieren Sie Plasmide von ihnen, um zu bestätigen, dass praktisch alle Klone die gewünschten DNA-Fragmente tragen5. Es gibt viele kommerzielle Kits, um Plasmide aus E. coli zu isolieren. Die Anzahl der Kolonien, die nach dem Ausbringen kleiner Aliquots auf der Platte erscheinen, kann manuell gezählt werden.</li>
	<li>Messen Sie die Konzentration des DNA-Pools der Bibliothek. In der Regel reichen einige hundert Nanogramm Bibliotheks-DNA aus, um im nächsten Schritt mehrere tausend Transformanten zu erhalten. HINWEIS: Es wird empfohlen, die DNA-Konzentration mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu messen, der an die DNA bindet, da die Messung von A260 häufig ungenau ist.</li>
</ol>2. Transformation der Hefe mit der Mutantenbibliothek und Replikationsplattierung
<ol><li>Die mutierte Bibliothek wurde für den Y2H-Assay mit etwa 100 ng DNA in den Wirtshefestamm (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) für den Y2H-Assay eingeführt. Vortransformieren Sie die Wirtszellen mit dem "Köder"-Plasmid.<ol><li>Nach dem Transformationsverfahren werden Hefezellen in sterilem Wasser suspendiert und Aliquots in unterschiedlichen Mengen auf geeignete Platten verteilt (in der Regel SC-Medium ohne Leucin und Tryptophan: SC-LW [0,67 % Hefestickstoffbase, 2 % Glukose, 1,546 g/L SC-Doppeldrop-out-Mix -Leu-Trp und 2 % Agar, siehe Materialtabelle]). Inkubieren Sie diese Platten über Nacht bei 30 °C. HINWEIS: Das Standardprotokoll, wie z.B. die Lithiumacetat-PEG-Methode11 mit ~5 × 106 logarithmisch wachsenden Zellen, ist für die Umwandlung von Hefe ausreichend. Eine andere Methode mit einer hohen Umwandlungseffizienz, wie z. B. die Elektroporation, kann ebenfalls verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Am nächsten Tag, wenn winzige Kolonien erscheinen, wählen Sie die Platten mit einer geeigneten Anzahl von Zellen (500-2000) aus und replizieren Sie sie wie folgt.</li>
	<li>Legen Sie zwei Blatt Filterpapier auf einen Replikblock, um mehrere Repliken herzustellen (Medium ist SC-LW und SC-LW mit Kanamycin) (siehe Materialtabelle). Bei 30 °C 1-2 Tage inkubieren. HINWEIS: Die Konzentration von Kanamycin (G418) beträgt 600 μg/ml. Verwenden Sie keinen Samt für die Nachbildung, da sonst die Auflösung der Kolonien verloren geht.</li>
	<li>Sobald die Völker gewachsen sind, vergleichen Sie die Platten und wählen Sie Kandidaten aus. Führen Sie einen Y2H-Farbassay durch (siehe Schritt 3), wenn lacZ als Reporter verwendet wird. HINWEIS: Für den Y2H-Reporter ist lacZ in der Regel besser in der Lage, eine schwache Wechselwirkung zu erkennen als HIS3.</li>
</ol>3. Y2H-Farbtest
<ol><li>Legen Sie ein Blatt Filterpapier, das Sie zuvor auf das entsprechende Format zugeschnitten haben, auf die mit Schritt 2 vorbereitete Replikplatte. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Filterpapier und der Platte bilden. HINWEIS: Verwenden Sie Filterpapier Nr. 4A oder Filterpapier der Güteklasse 50 (siehe Materialtabelle). Alle SC-LW oder SC-LW mit Kanamycin-Platten, die durch Replikatbeschichtung hergestellt werden, können für den Farbassay verwendet werden.</li>
	<li>Wenn das Filterpapier auf der Platte vollständig angefeuchtet ist (wenn sich die Farbe des Filterpapiers vollständig ändert), legen Sie mehrere Blätter Papiertuch darauf und bringen Sie es in Kontakt mit dem Filterpapier, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Entfernen Sie das Papiertuch, wenn es das Wasser aufnimmt und seine Farbe ändert. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal.</li>
	<li>Nehmen Sie die Ränder des Filterpapiers mit einer Pinzette auf, ziehen Sie es schnell von der Platte ab, tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff und frieren Sie es ein. Wenn kein flüssiger Stickstoff verfügbar ist, legen Sie das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf eine Kunststoffschale und legen Sie es sofort in einen Gefrierschrank (-20 °C bis -80 °C), um es vollständig einzufrieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das gefrorene Filterpapier und legen Sie es mit der Kolonieseite nach oben zum Auftauen auf ein trockenes Papiertuch. Unmittelbar nach dem Auftauen wird das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf ein anderes Filterpapier gelegt, das auf eine Kunststoffschale oder einen verschließbaren Behälter gelegt und mit Z-Puffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl und 1 mM MgSO4, pH 7,0) getränkt wurde, das X-Gal (5-Brom-5-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 2-Mercaptoethanol9 enthält (siehe Materialtabelle). Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen zwischen dem oberen und unteren Filterpapier bilden.</li>
	<li>Decken Sie die Plastikschale mit dem Filterpapier ab und geben Sie sie in einen luftdichten Behälter oder eine Plastiktüte. Verschließen Sie den luftdichten Behälter oder die Plastiktüte und inkubieren Sie sie bei 37 °C, bis eine blaue Farbe erscheint.</li>
	<li>Wenn eine blaue Farbe erscheint, legen Sie das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf etwa 500 μl Stopplösung (1 M Na2CO3) auf eine saubere Kunststoffschale. Stopp, die Lösung zieht schnell ein; Entfernen Sie daher sofort den Filter, legen Sie ihn mit der Kolonieseite nach oben auf ein frisches Papiertuch und lassen Sie ihn trocknen.</li>
	<li>Nachdem das Papiertuch ausgetauscht wurde und der Filter trocken genug ist, verwenden Sie einen Scanner oder ein anderes Gerät, um die Daten zu erfassen.</li>
</ol>4. Wiederfindung und Bestätigung von Klonkandidaten
<ol><li>Wählen Sie weiße und KanR-Kandidatenklone aus der Originalplatte der Replik (oder der replizierten Platte, die nicht für den Farbassay verwendet wird) aus. Beispiele sind in Abbildung 1C dargestellt. Bestätigen Sie, dass die Klonkandidaten weiß und KanR sind, indem Sie sie als kleinen Fleck auf SC-LW-Medium, das Kanamycin enthält, erneut streifen und 1-2 Tage lang bei 30 °C inkubieren. Machen Sie mindestens zwei Sätze oder machen Sie Repliken am nächsten Tag. HINWEIS: Weiße Kolonien sollten ausgewählt werden, da hellblaue Kolonien die Wechselwirkung beibehalten können.</li>
	<li>Sobald die Klonkandidaten gut nachgewachsen sind, wiederholen Sie den Farbtest mit mindestens einer Platte, die in Schritt 4.1 erzeugt wurde, wie in Schritt 3 beschrieben, und vergewissern Sie sich, dass sie weiß bleiben und nicht blau werden (Abbildung 2A). HINWEIS: Wenn Sie die Kandidaten erneut streifen, übertragen Sie keine großen Mengen an Zellen. Zu viele Zellen machen es unmöglich, KanR- und Kan S-Klone zu unterscheiden.</li>
	<li>Nehmen Sie Klone, die noch weiß sind und das in Schritt 4.2 erzeugteKan R aus den Plattenresten und züchten Sie unabhängig voneinander in 1 mL Selektionsmedium (SC-L oder SC-W, je nachdem, welcher Vektor für den Bibliotheksaufbau verwendet wird) über Nacht bei 30 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kultur in ein Mikroröhrchen und sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation (~15.000 × g, für 10-30 Sekunden bei Raumtemperatur). Isolieren Sie die gesamte DNA aus dem Zellpellet wie folgt.</li>
	<li>Das Zellpellet wird in 400 μl Lysepuffer (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) und 1 mM EDTA) mit je 1 μl 2-Mercaptoethanol und 20 mg/ml Zymolyase 100T (siehe Materialtabelle) suspendiert und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellwände zu verdauen. Mischen Sie zu diesem Zeitpunkt vorsichtig, indem Sie die Tube alle 5-10 Minuten umdrehen.</li>
	<li>Wenn die Zellsuspension undurchsichtig oder durchscheinend geworden ist, fügen Sie ein gleiches Volumen eines Gemischs aus Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu und mischen Sie es gut, indem Sie es 10-20 s lang bei mäßiger Geschwindigkeit vortexen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mikroröhrchen in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei voller Geschwindigkeit (~15.000 × g, bei Raumtemperatur) und gewinnen Sie die wässrige Phase, die die DNA enthält, in einem neuen Mikroröhrchen zurück. Fügen Sie 0,8 Volumen Isopropanol hinzu und mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen umdrehen.</li>
	<li>Lassen Sie das Röhrchen 2-3 min bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann in einer Mikrozentrifuge für 4-5 min bei voller Geschwindigkeit (~15.000 × g, bei Raumtemperatur), um die DNA auszufällen.</li>
	<li>Den Überstand entfernen und den Niederschlag mit ca. 500 μl 70%igem Ethanol waschen. Entfernen Sie das Ethanol vollständig und trocknen Sie den Niederschlag kurz ab.</li>
	<li>Geben Sie 20 μl TE-Puffer (10 mM Tris-Cl (8,0) und 1 mM EDTA) zum Niederschlag, mischen Sie kurz und lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur, um den Niederschlag aufzulösen. HINWEIS: Wenn Benutzer es eilig haben, halten Sie die Röhrchen bei 37-50 °C. Der DNA-Niederschlag löst sich in wenigen Stunden auf.</li>
	<li>Sobald das Pellet vollständig aufgelöst ist, transformieren Sie E. coli mit einer kleinen Menge dieser DNA-Lösung. HINWEIS: Etwa 0,5 μl DNA-Lösung sind ausreichend, wenn E. coli mit einer hohen Transformationseffizienz verwendet wird.</li>
	<li>Wenn E. coli-Kolonien auftreten, wählen Sie mehrere unabhängige Kolonien aus, kultivieren Sie sie und gewinnen Sie Plasmide mit Standardmethoden, wie z. B. alkalischer Lyse.</li>
	<li>Führen Sie die in Schritt 4.12 erhaltene Plasmid-DNA in Y2H-Wirtszellen ein, die das Köderplasmid beherbergen. Wenn Transformanten auftreten, überprüfen Sie sie mit dem Farbtest (sie sollten weiß erscheinen) und Western Blot4 (sie sollten ein Protein der gewünschten Größe exprimieren). HINWEIS: Die postalkalische Methode12 ist eine einfache und schnelle Möglichkeit, einen Ganzzellextrakt aus Hefe herzustellen.</li>
	<li>Wenn die beiden oben genannten Kriterien erfüllt sind, bestimmen Sie die Mutationsstelle der Klone durch Nukleotidsequenzierung4.</li>
</ol>

Biomolekulare Interaktionsstudien mit der Hefe-Zwei-Hybrid-Technik 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
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<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
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<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie Interaktions-Null-/beeinträchtigte Mutanten mit dem Y2H-Assay isoliert werden. Solche Mutanten sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Funktion eines Proteins von Interesse zu analysieren. Um solche Mutanten zu isolieren, wurden zuvor rY2H-Assays entwickelt, indem der Y2H-Wirtsstamm 2,3 modifiziert wurde. Sie haben den Arbeitsaufwand jedoch nicht wesentlich reduziert. Im Gegensatz dazu können Mutanten mit dieser Methode ohne...

Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen sind der grundlegendste Teil biologischer Phänomene. Protein-Protein-Wechselwirkungen machen einen wesentlichen Teil solcher Wechselwirkungen aus. Daher ist die Identifizierung des/der Interaktionspartners/-partners eines interessierenden Proteins von entscheidender Bedeutung, um die Funktion des interessierenden Proteins/Gens weiter aufzuklären. Die Hefe-Zwei-Hybrid-Methode (Y2H) ist eine beliebte Technik zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo1. In diesem System werden zwei Proteine (X und Y), deren Interaktion getestet werden soll, mit der DNA-bindenden (DB) Domäne bzw. der transkriptionellen Aktivierungsdomäne (AD) fusioniert. Das DB-X-Fusionsprotein bindet an eine Erkennungssequenz der DB-Domäne; Wenn also die Proteine X und Y interagieren, kommt das AD-Y-Fusionsprotein in die Nähe der Erkennungssequenz. Dadurch wird die Transkription des Reportergens stromabwärts der Erkennungssequenz aktiviert. Daher kann das Vorhandensein oder Fehlen von Reportergenaktivität verwendet werden, um das Vorhandensein oder Fehlen der Protein-Protein-Interaktionzu bestimmen 1.
Sobald ein spezifischer Interaktionspartner des interessierenden Proteins identifiziert ist, sollten weitere Analysen durchgeführt werden, um die biologische Funktion der Interaktion aufzuklären. Zu diesem Zweck können Mutanten der Proteine, die die spezifische Protein-Protein-Interaktion beeinträchtigen oder entfernen, isoliert werden, als mächtige Werkzeuge dienen. Das Y2H-System kann direkt verwendet werden, um solche Mutanten zu isolieren, indem "interaktionsnegative" Klone gescreent werden, beginnend mit dem "interaktionspositiven" Wildtyp-Klon. Um diesen Prozess zu beschleunigen, wurden "umgekehrte" Y2H-Systeme (rY2H) entwickelt 2,3. In rY2H-Systemen beherbergen die Wirtshefestämme gegenselektierbare Markergene als Reportergene, was bedeutet, dass Hefezellen nur dann wachsen, wenn die Proteine AD-Y und DB-X nicht interagieren.
Obwohl sowohl das Y2H- als auch das rY2H-System die Isolierung von interaktionsnegativen Mutanten ermöglichen, ist der Prozess der Isolierung der Mutanten mühsam, da nicht alle durch das Screening erhaltenen Kandidaten die gewünschte Art von Mutationen (in der Regel Missense-Mutationen) tragen. Das schwerwiegendste Problem ist, dass ein erheblicher Teil der Kandidaten Frameshift- oder Nonsense-Mutationen aufweist und es notwendig ist, Western Blotting durchzuführen, um unerwünschte Klone auszuschließen. Um dieses Problem zu lösen, wurden neue Plasmidvektoren entwickelt4. In diesen Vektoren wird KanMX, ein Arzneimittelresistenzmarker, außerhalb des Rahmens stromabwärts der DB-Domäne oder AD positioniert. Das Markergen wird nur dann mit der DB-Domäne oder AD im Frame, wenn das interessierende Gen eingefügt wird. Wenn eine oder mehrere zufällige Mutationen in das interessierende Gen eingeführt werden, können unerwünschte Mutanten, wie z. B. solche mit Frameshift- oder Nonsense-Mutationen, durch eine Arzneimittelresistenzselektion leicht eliminiert werden, und Kandidaten, die erwünschte Missense-Mutationen tragen, können mit dem Y2H-Screening leicht identifiziert werden4. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten eines Proteins von Interesse unter Verwendung dieser Strategie vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (8,0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>10%ige SDS-Lösung</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natrium</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-Tag mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>Medizin & Medizin Biologische Laboratorien Co. Ltd.</td><td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>DNA aus Lachshoden</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier für Kolonieauftrieb (Güteklasse 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier für Kolonieauftrieb (Nr.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>01411090</tr><tr><td>Filterpapier zum Replizieren (Nr.1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>G-418 Sulfat</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Lithium-Acetat-Dihydrat</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 12H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>Papiertuch</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-DNAs</td><td>: das National BioResource Project - Hefe (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Isolationskit</td>, <td>Nippon Genetics Co., Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol #4.000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC Doppel-Drop-out-Mix -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Nahtloses Klonierungskit (In-Fusion-Montage)</td> <td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Taq-Polymerase (GoTaq Green Master Mixes)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Hydroxymethyl) aminomethan</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Base (YNB)</td><td>Formedium</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>Tel.: 07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von interaktions-null-/beeinträchtigten mutanten mit dem hefe-zwei-hybrid-assay

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind einer der grundlegendsten Prozesse, die biologischen Phänomenen zugrunde liegen. Eine der einfachsten und besten Möglichkeiten, die Rolle(n) und Funktion(en) einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion zu verstehen, besteht darin, den Phänotyp des Wildtyps (mit der relevanten Protein-Protein-Interaktion) mit denen von Mutanten zu vergleichen, denen die relevante Interaktion fehlt. Wenn solche Mutanten isoliert werden können, helfen sie daher, die damit verbundenen biologischen Prozesse aufzuklären. Das Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren (Y2H) ist ein leistungsstarker Ansatz, um nicht nur Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen, sondern auch um Interaktions-Null-/beeinträchtigte Mutanten zu isolieren. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit Hilfe der Y2H-Technologie vorgestellt. Zunächst wird eine Mutationsbibliothek erstellt, indem die Polymerase-Kettenreaktion und die effiziente nahtlose Klonierungstechnologie kombiniert werden, die den leeren Vektor effizient aus der Bibliothek ausschließt. Zweitens werden Interaktions-Null-/beeinträchtigte Mutanten mit dem Y2H-Assay gescreent. Aufgrund eines Tricks im Y2H-Vektor werden unerwünschte Mutanten, wie z. B. solche mit Frameshift- und Nonsense-Mutationen, effizient aus dem Screening-Prozess eliminiert. Diese Strategie ist einfach und kann daher auf jede Kombination von Proteinen angewendet werden, deren Interaktion durch das Zwei-Hybrid-System nachgewiesen werden kann.

Kürzlich wurde festgestellt, dass die C-terminale Hälfte des Pol2-Proteins (Pol2-C) mit Mcm10 interagiert. Beide Proteine sind essentiell für die Initiierung der DNA-Replikation und damit für das Zellwachstum in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Um die biologische Bedeutung dieser Interaktion besser zu verstehen, wurden Pol2-C-Mutanten, die keine/nur eine verminderte Wechselwirkung mit Mcm10 aufweis...

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Wir sind daran interessiert, die regulatorischen Mechanismen des Zellzyklus in Eukaryoten zu verstehen, insbesondere die Beziehung zwischen DNA-Replikation, stabiler Keimhaltung und Zellproliferation. Das Fortschreiten des Zellzyklus wird in Eukaryoten durch Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) reguliert. Dies ist der Fall bei der Initiierung der DNA-Replikation.Wir haben einen Weg gefunden, auf Substraten von CDKs die DNA-Replikation zu initiieren. Um die Funktion des Proteins zu verstehen, das Sie interessiert, ist ein Vergleich von Wildtyp und Mutante ein direkter und effektiver Weg. Der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay ist einfach zu detektieren und wird den Prozess der Isolierung von Interaktions-Null-Mutanten verbessern.Dies wird dazu beitragen, die Forschung auf diesem Gebiet voranzutreiben.

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MYTHOS ermöglicht den empfindlichen Nachweis von transienten und stabilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Es wurde erfolgreich angewendet, um exogene und Hefe integrale Membranproteine ​​zu studieren, um ihre Interaktionspartner in einem hohen Durchsatz Weise zu identifizieren.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Dieses Video zeigt den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zum Nachweis spezifischer Protein-Selbstinteraktionen. In diesem Assay wird das Protein von Interesse an zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors gebunden, der für das β-Galactosidase-Enzym kodiert. Wenn die beiden Proteine interagieren, bewirkt dies, dass Transkription und Translation das Enzym bilden, das dann mit einem biochemischen Assay nachgewiesen wird.

Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Bestimmung der Protein-Selbstassoziation in Hefezellen

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

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Ketoconazol bindet und antagonisiert Pregnane X-Rezeptor (PXR) Aktivierung. Hefe-Hochdurchsatz-Screening von Mutanten PXR definieren eine einzigartige Region für Ketoconazol verbindlich. Diese Hefe-basierten genetischen Methode entdeckt neue Kernrezeptor-Interaktionen mit Liganden, die mit Oberflächenbindungsstellen zuordnen.

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Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

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Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

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Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Lernen Sie den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Isolierung von Interaktions-Null-Mutanten für Zellzyklus-Regulationsstudien in Eukaryoten. Diese Methode erleichtert das Verständnis kritischer Proteininteraktionen.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

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