Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

2.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/66451

⸱

22. März 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll veranschaulicht die Wirksamkeit des cAMP Difference Detector In Situ bei der Messung von cAMP durch zwei Methoden. Bei einer Methode wird ein 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer mit HEK-293-Zellen verwendet. Die andere Methode zeigt einzelne HASM-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Zusammenfassung

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) ist ein neuartiger Biosensor, der die kontinuierliche Messung des cAMP-Spiegels in lebenden Zellen ermöglicht. Der Biosensor besteht aus einem zirkular permutierten fluoreszierenden Protein, das an die Scharnierregion von Epac2 gebunden ist. Dadurch entsteht ein einzelner Fluorophor-Biosensor, der bei Bindung von cAMP entweder eine erhöhte oder eine verringerte Fluoreszenz anzeigt. Der Biosensor gibt es in der roten und grünen Version nach oben sowie in der grünen Version nach unten und in mehreren roten und grünen Versionen, die auf subzelluläre Stellen ausgerichtet sind. Um die Wirksamkeit des Biosensors zu veranschaulichen, wurde die grüne, nach unten gerichtete Version verwendet, die bei cAMP-Bindung in der Fluoreszenz abnimmt. Es werden zwei Protokolle demonstriert, die diesen Sensor verwenden: eines mit einem 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer, das mit Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist, und ein anderes, das Einzelzell-Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop verwendet. Auf dem Platten-Reader wurden HEK-293-Zellen, die in 96-Well-Platten kultiviert wurden, mit 10 μM Forskolin oder 10 nM Isoproterenol stimuliert, was zu einer schnellen und starken Abnahme der Fluoreszenz in der grünen Abwärtsversion führte. Der Biosensor wurde verwendet, um den cAMP-Spiegel in einzelnen menschlichen Zellen der glatten Atemwegsmuskulatur (HASM) zu messen, die unter einem Fluoreszenzmikroskop überwacht wurden. Der grüne, nach unten gerichtete Biosensor zeigte ähnliche Reaktionen auf Zellpopulationen, wenn er mit Forskolin oder Isoproterenol stimuliert wurde. Dieser Einzelzell-Assay ermöglicht die Visualisierung der Position des Biosensors bei 20- und 40-facher Vergrößerung. Somit ist dieser cAMP-Biosensor empfindlich und flexibel und ermöglicht die Echtzeitmessung von cAMP sowohl in immortalisierten als auch in Primärzellen sowie mit einzelnen Zellen oder Zellpopulationen. Diese Eigenschaften machen cADDis zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der cAMP-Signaldynamik in lebenden Zellen.

Einleitung

Adenosin-3′,5′-cyclisches Monophosphat, cAMP, spielt eine zentrale Rolle bei der zellulären Kommunikation und der Koordination verschiedener physiologischer Prozesse. cAMP fungiert als zweiter Botenstoff, der externe Signale von Hormonen, Neurotransmittern oder anderen extrazellulären Molekülen weiterleitet, um eine Kaskade intrazellulärer Ereignisse zu initiieren1. Darüber hinaus ist cAMP an verschiedenen Signalwegen beteiligt, einschließlich solcher, die mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und Adenylylcyclasen assoziiert sind. Das Verständnis der Rolle von cAMP bei der zellulären Signalübertragung ist von grundlegender Bedeutung, um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, die normalen zellulären Funktionen zugrunde liegen, und um potenzielle Therapien für eine Vielzahl von Erkrankungenzu entwickeln 2.

In der Vergangenheit wurden verschiedene Methoden eingesetzt, um cAMP direkt oder indirekt zu messen. Dazu gehörten die Radiomarkierung von zellulären ATP-Pools, gefolgt von der Säulenreinigung, HPLC, Radioimmunoassays und enzymgebundenen Immunoassays 1,2. Diese Legacy-Assays sind durch die Tatsache eingeschränkt, dass es sich um Endpunktmessungen handelt, die eine große Anzahl von Proben erfordern, um zeitabhängige Reaktionen zu erstellen. In jüngerer Zeit wurden FRET-Sensoren (Fluorescence Resonance Energy Transfer) entwickelt, um Assays in lebenden Zellen zu erstellen, dynamische Echtzeitdaten zu erzeugen und Sensoren an verschiedenen subzellulären Orten anzuvisieren3. FRET nutzt zwei Fluorophore, einen Fluoreszenzdonor und einen Fluoreszenzakzeptor, so dass das Akzeptorfluorophor in unmittelbarer Nähe durch den Donorfluoreszenzausgang angeregt wird, wenn er sich in unmittelbarer Nähe befindet. Die beiden am häufigsten verwendeten Fluorophore sind das cyanfluoreszierende Protein (CFP) und das gelb fluoreszierende Protein (YFP), da diese kompatible Anregungs- und Emissionseigenschaften aufweisen. Neben CFP und YFP wird die Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und des rot fluoreszierenden Proteins (RFP) häufig für FRET-Biosensoren verwendet. cAMP FRET-Biosensoren funktionieren, indem sie einen Donor und einen Akzeptor an gegenüberliegenden Enden des Epac2 cAMP-Bindungsproteins haben. Die cAMP-Bindung verändert die Bestätigung von EPAC und vergrößert den Abstand zwischen Donor- und Akzeptorfluorophoren 3,4. Diese Konformationsänderung wird durch einen Verlust von FRET nachgewiesen, d. h. durch die Anregung des Akzeptorfluorophors durch Energie, die von den Donorfluorophortropfen3 übertragen wird. Obwohl es sich um einen scheinbar einfachen Prozess handelt, gibt es eine Fülle von Einschränkungen und Problemen mit dem FRET-Biosensor für die cAMP-Forschung5. Eine davon ist die Auswahl von fluoreszierenden Proteinen, z. B. GFP, die auf natürliche Weise dimerisieren können, wodurch die Empfindlichkeit verringertwird 6. FRET-basierte cAMP-Biosensoren wurden auf bestimmte Mikrodomänenausgerichtet 7, aber es kann aufgrund der Größe eines Konstrukts mit zwei Fluorophoren6 Einschränkungen geben. Ein weiteres wichtiges Problem ist das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis von FRET-Signalen, das sich aus der Überlappung zwischen Anregung und Emission des Fluorophors ergibt, was zu einer hohen Abtastfrequenz führt und die Analyse der Ergebnisse erschwert 4,5.

Zuletzt hat der neuartige Biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, diese und andere Einschränkungen bei der Untersuchung der Regulation der cAMP-Signalübertragung gelöst8. Eine wichtige Verbesserung ist die Abhängigkeit von einem einzigen Fluorophor. Dies ermöglicht ein schnelles und effizientes Signal mit einem größeren Dynamikbereich und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Infolgedessen kann die Genauigkeit höher sein, da es einen weniger breiten Bereich von Wellenlängen gibt, die durchkämmtwerden müssen 8. Wie FRET-Sonden wurde der Biosensor auf subzelluläre Stellen ausgerichtet, was die Erforschung der Kompartimentierungstheorie und die Erforschung von Lipid-Rafts und Nicht-Rafts sowie anderen subzellulären Domänen ermöglicht9. Am wichtigsten ist vielleicht die Eignung eines einzelnen Fluorophor-Biosensors für das Hochdurchsatz-Screening, der die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu FRET-basierten Biosensoren verbessert hat. Der Biosensor ist in einen BacMam-Vektor verpackt, der eine einfache Transduktion einer Vielzahl von Zelltypen und eine präzise Kontrolle der Proteinexpression ermöglicht.

Die Expressionskontrolle über den BacMam-Vektor kann besonders bei Assays mit GPCR-Orthologen verschiedener Spezies nützlich sein, um die Interpretation von Daten aus Tierversuchen zu erleichtern. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Rezeptorexpression entscheidend für die Messung der verschiedenen Grade der Arzneimittelwirksamkeit (z. B. inverse Agonisten und partielle Agonisten), und niedrige Rezeptorexpressionsniveaus sind nützlich, um die niedrigen Niveaus in tierischem Gewebe nachzuahmen. BacMam ist ein Baculovirus-Vektor, der modifiziert wurde, um Säugetierzellen wie primäre Zellkulturen und HEK-293-Linien zu transduzieren10. Dominante selektierbare Marker ermöglichen es BacMam, eine höhere Stabilität als herkömmliche Plasmidinfektionen zu bieten11. Solche selektiven Promotoren ermöglichen eine effizientere Genübertragung und -expression. Darüber hinaus erhöht die Zugabe von Trichostatin A (einem Histon-Deacetylase-Hemmer) den Reporterproteinspiegel11. Die Expressionsniveaus können über den Titer des verwendeten BacMam-Virus gesteuert werden und sollten für jeden Zelltyp optimiert werden. Im Falle dieses Biosensors ist ein rot oder grün fluoreszierendes Protein an den N- und C-Termini mit dem Epac verknüpft. Wenn cAMP bindet, bewegt eine Konformationsänderung im Biosensor Aminosäuren in die Nähe des fluoreszierenden Proteins. Eine solche Verschiebung verschiebt die Absorption vom anionischen Zustand in den neutralen Zustand bei 400 nm, wodurch die Fluoreszenz verringert wird.

Es gibt 90-120 GPCRs, die in einer einzigen Zelle exprimiert werden und auf eine Vielzahl von neurohumoralen Signalen reagieren12. Daher kann die Hypothese aufgestellt werden, dass mindestens mehrere Dutzend GPCRs pro Zelle cAMP durch Gs- bzw. Gi-Kopplung stimulieren oder hemmen können. Während es Fortschritte bei der Überwachung dieses zweiten Botenstoffs in Echtzeit gibt, wie z. B. FRET, sind effizientere Methoden erforderlich. Die Methodik zur Überwachung der Synthese und Degradation von cAMP-Signalen mit cADDis in Echtzeit wird hier vorgestellt. Die Änderung der Fluoreszenz kann in Echtzeit mit einem Fluoreszenzplatten-Reader für Hochdurchsatz-Assays oder mit einem Fluoreszenzmikroskop für Einzelzell-Assays überwacht werden. Diese Methoden sind nützlich für eine Vielzahl biologischer Fragestellungen zur GPCR-Signalübertragung über cAMP.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Einzelheiten zu allen Reagenzien und Geräten, die für die Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Plattenablesungs-Spektralphotometer, Hochdurchsatz-Assay

  1. Aussaat von HEK-293-Zellen mit dem cADDis-BacMam-Vektor in einer 96-Well-Platte (Tag 1)
    1. Zellen in einer Virushaube spalten und infizieren.
      1. Erwärmen Sie HEK-Medien (Tabelle 1) und 0,25 % Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
      2. Desinfizieren Sie die Haube und die Materialien, indem Sie sie mit EtOH-getränkten Tüchern abwischen.
      3. Das HEK-Medium mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben entnehmen und entsorgen.
      4. Geben Sie 5 ml Mg2+ und Ca2+ freies DPBS (37 °C) mit einer serologischen Pipette hinzu. Kippen Sie den Kolben hin und her, um den Boden mit DPBS zu waschen. Entfernen und verwerfen Sie DPBS mit einer serologischen Pipette.
      5. Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie 3 ml erwärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette hinzufügen. Kippen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass das Reagenz den Boden des Kolbens vollständig bedeckt. Setzen Sie den Deckel auf den Kolben und lassen Sie das Reagenz 3-5 Minuten einwirken, damit sich die Zellen vom Kolben lösen können.
        HINWEIS: Dieses Experiment ist für einen 75 cm2-Kolben optimiert; Volumenanpassungen für Reagenzien müssen möglicherweise vorgenommen werden, wenn ein Kulturgerät anderer Größe verwendet wird.
      6. Ziehen Sie 5 ml frisches Medium mit Antibiotika. Das Volumen des Kolbens wird ausgestoßen und gezogen, um die Wände des Kolbens zu waschen und die Zellen physisch zu lösen.
      7. Das Gesamtvolumen des Kolbens (8 mL) und die Zentrifuge (25 °C) in einem 15-ml-Röhrchen bei 200 x g für 5 min auffangen.
      8. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand mit einer serologischen Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
      9. Um die Zellen zu waschen, ohne das Pellet zu stören, geben Sie 500 μl DPBS ohne Mg2+ und Ca2+ DPBS an die Seite des 15-ml-Röhrchens. Entfernen und entsorgen Sie nach vorsichtiger Zugabe des DPBS so viel Puffer wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen Sie dies noch einmal.
      10. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf eine Zelldichte von 250.000 Zellen/ml-Zellen ein.
      11. Erstellen Sie einen Mastermix, der darauf basiert, welche Reagenzvolumina pro Vertiefung einer schwarzen, transparenten 96-Well-Platte mit Bodenfläche benötigt werden. Dies wird als "Gewebeplatte" bezeichnet. Siehe Bände unten:
        HINWEIS: Beispiel für 1 Vertiefung (Gesamtvolumen 200 μl): 40 μl des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand von 2 x10 10 viralen Genen/ml), 2 μl Trichostatin A (Bestand von 100 μM; Endkonzentration 1 μM), 158 μl von 250.000 Zellen/ml Zelldichte. Beispiel für 10 Wells (Gesamtvolumen 2 mL): 400 μL des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand von 2 x10 10 viralen Genen /ml), 20 μl Trichostatin A (Bestand von 100 μM), 1.580 μL Medium mit 250.000 Zellen/ml Zelldichte.
      12. Fügen Sie 200 μl Mastermix pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einem Inkubator, bevor Sie sie auf dem Plattenablesungs-Spektrophotometer laufen lassen.
  2. Läuft auf einem Tellerlesegerät
    1. Entfernen Sie auf einer Tischplatte vorsichtig alle Medien in jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch 180 μl DPBS mit Mg2+ und Ca2+ bei 37 °C.
    2. Untersuchen Sie Zellen mit einem Mikroskop, um die Zellgesundheit zu bestätigen.
    3. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min-1 h.
    4. Bereiten Sie die Arzneimittel während der Inkubation für die Ablesung bei einer Verdünnung von 1:10 (auch 10-fach genannt) für die gewünschte Enddosis vor. Bereiten Sie also 100 μM Forskolin und 100 nM Isoproterenol vor.
    5. Geben Sie 60 μl jedes Arzneimittels säulenförmig auf eine durchsichtige 96-Well-Platte (als "Wirkstoffplatte" bezeichnet).
      HINWEIS: Bei richtiger Wirkstoffverdünnung und zur Optimierung der Ablesung werden die Arzneimittel auf eine durchsichtige 96-Well-Platte gegeben, die als "Wirkstoffplatte" bezeichnet wird, um zum Zeitpunkt der Ablesung mit einer 96-Multi-Pipettore auf die "Gewebeplatte" übertragen zu werden, so dass das Arzneimittel gleichzeitig in alle Vertiefungen gegeben und vom Fluoreszenzspektrophotometer schnell abgelesen werden kann.
  3. Einrichtung des Fluoreszenzplatten-Readers
    1. Passen Sie die Einstellungen des Fluoreszenzplatten-Readers an.
      1. Lesemodus: Fluoreszenz. Lesetyp: kinetisch. Messwerte Wellenlängen: 494 nm und 522 nm.
      2. Lesezeit: Geben Sie 3 Minuten für den Fluoreszenz-Ausgangswert und 7 Minuten für die Zugabe nach dem Medikament ein. "Intervall" wird als 00:00:30 für 30 s zwischen den einzelnen Lesevorgängen eingegeben.
        HINWEIS: Die Lesezeit kann je nach benötigter Zeit optimiert und erhöht werden.
  4. Datenerfassung
    1. Nehmen Sie die Taschentuchplatte aus dem Inkubator, entfernen Sie die Aluminiumfolie und den Plattendeckel und legen Sie die Taschentuchplatte in den Plattenleser. Schließen Sie die Lesekassette, damit die Gewebeplatte ruhen und sich an die Temperatur des Lesegeräts (37 °C) anpassen kann.
    2. Legen Sie die durchsichtige 96-Well-Platte (Wirkstoffplatte) mit den Wirkstoffverdünnungen unter die 96-Multi-Pipette und üben Sie, 20 μl aus den Wells zu entnehmen. Stellen Sie sicher, dass ein gleichmäßiges Volumen des Medikaments in die Pipettenspitzen gezogen wird.
    3. Initiieren Sie einen "Baseline"-Messlauf.
      HINWEIS: 40 RFU oder höher gelten als brauchbare Daten. Wenn die Daten unter diesem Wert liegen, sollte der Test gestoppt und verworfen werden.
    4. Die Gewebeplatte wird am Ende des Baseline-Laufs aus dem Lesegerät ausgeworfen. Geben Sie schnell und vorsichtig 20 μl von der durchsichtigen Wirkstoffplatte in die schwarze Gewebeplatte. Beginnen Sie dann schnell mit dem "Behandlungslauf". Die Gewebeplatte sollte nach der Zugabe von Arzneimitteln nicht länger als 30 s aus dem Lesegerät entfernt sein.
      HINWEIS: Wenn das Medikament zu schnell hinzugefügt wird, lösen sich die Zellen von der Gewebeplatte, wodurch ein unbrauchbares Experiment entsteht. Zusätzlich werden die Zellen mit einem lichtempfindlichen, grün fluoreszierenden Protein infiziert; Daher ist es unerlässlich, die Medikamente schnell und unverzüglich hinzuzufügen und mit dem zweiten Test zu beginnen, um zu vermeiden, dass der frühe Teil der Reaktion übersehen wird.
    5. Sobald die zweite Messung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Gewebeplatte aus dem Lesegerät ausgeworfen wird und die Datenerfassung abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Bevor Sie die Gewebeplatte entsorgen, sollten Sie überprüfen, ob die Zellen noch an der Platte befestigt sind. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn sich die Zellen lösen, sind die Ergebnisse ungültig und sollten verworfen werden. Das Experiment muss wiederholt werden.
    6. Exportieren Sie die resultierenden Daten als Excel-Datei.
    7. Öffnen Sie die exportierten lesbaren Excel-Daten aus dem Plattenleser, kopieren Sie die relevanten Informationen und fügen Sie sie in die Excel-Konvertierungsvorlage ein. Die Daten werden vom eingerichteten Plattenleser in eine einzelne Vertiefung umgewandelt, wobei die Spaltenanzeigen rechts von den kopierten Daten angezeigt werden.
      HINWEIS: Fluoreszenzsäulen für eine Vertiefung über die Zeit werden unter RFUs (mit dem Titel Spaltentransformation) und als Dezimaländerung relativ zum RFU-Messwert beim ersten Messwert (t0 mit dem Titel Delta F) aufgeführt. In der Excel-Vorlage wird die Delta-F-Tabelle auf den letzten Ausgangswert vor der Zugabe des Arzneimittels festgelegt. Dies ist der 6. Datenerfassungspunkt.
    8. Kopieren Sie nach der Datentransformation die Daten von Delta F und fügen Sie sie in die Datenanalysesoftware als Zerfall oder relativer Zerfall in der Fluoreszenz über die Zeit ein.
    9. Ändern Sie den X-Titel in "Zeit(en)" und den Y-Titel in "ΔF/F0" für relative Dezimalwerte.

2. Einzelzell-Assay mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop

  1. Aussaat (HASM) von Zellen mit dem cADDis BacMam-Vektor in einer 35-mm-Schale (Tag 1)
    1. Zellen in einer Virushaube spalten und infizieren.
      1. Warmes HASM-Medium (Tabelle 1), 0,25 % Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
      2. Desinfizieren Sie die Haube und die Materialien und wischen Sie die Haube mit EtOH-getränkten Tüchern ab.
      3. HASM-Medien mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben entnehmen und entsorgen.
      4. 5 ml Mg2+ und Ca2+ freies DPBS (37 °C) mit einer neuen serologischen Pipette zugeben und den Kolben kippen, um den Boden mit dem DPBS zu waschen.
      5. Trypsinisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml erwärmtem 0,25%igem Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette. Kippen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass das Reagenz den Boden des Kolbens vollständig bedeckt. Lassen Sie das Reagenz 3-5 Minuten einwirken, damit sich die Zellen vom Kolben lösen können.
      6. Es werden 5 ml frisches Medium mit Antibiotika entnommen und die Pipette ausgestoßen, um die Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen.
      7. Das Gesamtvolumen der Zentrifuge des Kolbens (8 mL) in einem Zentrifugenröhrchen bei 200 x g für 5 min auffangen.
      8. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand mit einer serologischen Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
      9. Ohne das Pellet zu stören, geben Sie 500 μl DPBS ohne Mg2+ und Ca2+ DPBS an die Seite des Zentrifugenröhrchens. Entfernen und entsorgen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
        HINWEIS: Dieses Experiment ist für einen 75 cm2-Kolben optimiert; Volumenanpassungen für Reagenzien müssen möglicherweise vorgenommen werden, wenn ein Kulturgerät anderer Größe verwendet wird.
      10. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf eine Zelldichte von 40.000 Zellen/ml ein.
      11. Erstellen Sie einen Mastermix basierend auf dem Reagenzvolumen, das pro Vertiefung einer 35-mm-Schale benötigt wird. Siehe Bände unten:
        HINWEIS: Beispiel für 1 Vertiefung (Gesamtvolumen 500 μL): 20 μl des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand von 2 x10 10 viralen Genen /ml), 5 μl Trichostatin A (Bestand von 100 μM, Endkonzentration 1 μM), 500 μl von 40.000 Zellen/ml Zelldichte. Beispiel für 4 Wells (Gesamtvolumen 2 mL): 80 μL des Biosensor-BacMam-Vektors (Bestand an viralen Genen /mL), 20 μL Trichostatin A (Bestand von 100 μM, Endkonzentration 1 μM), 2000 μL Medium 40.000 Zellen/ml Zelldichte.
      12. Fügen Sie 500 μl Mastermix pro Vertiefung hinzu. Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor das Experiment fortgesetzt wird.
        HINWEIS: Die Handynummer kann je nach Zelllinie variieren. Um überlappende Zellen für die Analyse zu vermeiden, verwenden Sie niedrige Zellenzahlen.
  2. Vorbereitung pharmakologischer Wirkstoffe (Tag 2)
    1. Entfernen Sie vorsichtig das Medium in jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 450 μl DPBS mit Mg2+ und Ca2+ bei 37 °C.
    2. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und inkubieren Sie die 35 mm Scheibe bei 37 °C für 30 min-1 h.
    3. Untersuchen Sie Zellen mit einem Mikroskop, um die Zellgesundheit zu bestätigen.
    4. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Arzneimittel für das Ablesen von 1 log-Einheit über der gewünschten Endkonzentration (10-fach höher) vor. Bereiten Sie also 100 μM Forskolin und 100 nM Isoproterenol vor.
    5. Bereiten Sie das Arzneimittel für logarithmische Dosiertiter bei 10 mM vor und verwenden Sie serielle Verdünnungen, um 100 μM Forskolin und 100 nM Isoproterenol zu erreichen.
  3. Datenerfassung
    HINWEIS: Die folgenden Einstellungen gelten für ein inverses Fluoreszenzmikroskop. Die Software, die jedem Mikroskop beiliegt, kann unterschiedlich sein. Die allgemeinen Einstellungen, die im aktuellen Protokoll verwendet werden, werden hier beschrieben.
    1. Schalten Sie die zentrale Nabe und dann das inverse Fluoreszenzmikroskop ein.
    2. Öffnen Sie die Software, die für die Aufnahme verwendet werden soll, und wählen Sie die Option für die Zeitrafferaufnahme .
    3. Platzieren Sie einen 35-mm-Probenhalter in der Schüssel.
    4. Stellen Sie das Objektiv auf x20 ein.
    5. Verwenden Sie den Autofokus und erhalten Sie ein möglichst klares Bild. Wenn es schwierig ist, einzelne Zellen zu finden, beginnen Sie mit einem 4x-Ziel und gehen Sie dann zu 20x über. Fokussieren Sie die Probe manuell, wenn das Mikroskop nicht über eine Autofokusfunktion verfügt.
      HINWEIS: Die Vergrößerung von 40x kann verwendet werden, wenn signifikantere zellmorphologische Details benötigt werden.
    6. Passen Sie die folgenden Einstellungen an, um eine optimale Datenerfassung zu erzielen: Automatische Helligkeit (Belichtung), Anregungswellenlänge, Schwarzabgleich (zur Reduzierung von Hintergrundrauschen), Autofokus.
    7. Nachdem Sie einen Sichtbereich mit mehreren zytoplasmatischen fluoreszierenden Zellen gefunden haben, erfassen Sie die Daten alle 30 s 20 Minuten lang mit Zeitrafferaufnahme.
    8. Klicken Sie auf Go , um mit dem Lesen zu beginnen.
    9. Laufen Sie 3 Minuten lang, um die Baseline zu sammeln. Sobald die 3-minütige Erfassung erfolgt ist, geben Sie vorsichtig 50 μl des Arzneimittels in die entsprechende Vertiefung. Wenn die Arzneimittel hinzugefügt werden, beträgt die Endkonzentration auf der Schale 10 μM Forskolin und 10 nM Isoproterenol.
      HINWEIS: Das Medikament muss vorsichtig hinzugefügt werden; Berühren Sie die Platte nicht mit der Pipettenspitze, da dies das Sichtfeld verschieben und die Probe nicht analysiert werden kann.
    10. Lassen Sie das Experiment weitere 17 Minuten lang laufen, wobei die Daten alle 30 s erfasst werden.
    11. Stellen Sie nach Abschluss des Tests sicher, dass die Daten für die Analyse bereit sind.
      HINWEIS: Obwohl das derzeitige Protokoll keine Kontrolle für die Fokusdrift enthält, könnte es von Vorteil sein, eine solche in das Experiment einzubeziehen. Zum Beispiel kann die Verwendung von Kernfarbstoffen bei der Bewältigung der Fokusdrift während der Mikroskopanalyse helfen, insbesondere bei der Aufnahme von Bildern lebender Zellen über einen längeren Zeitraum. cADDis-Biosensoren sind in der Regel weit in der Zelle verteilt, was eine breite Fokusebene zur effektivsten Erfassung macht und die Notwendigkeit einer Kontrolle der Fokusdrift reduziert9.
  4. Analyse der Daten
    HINWEIS: Die Software, die mit jedem Mikroskop geliefert wird, kann unterschiedlich sein, daher werden hier die allgemeinen Einstellungen beschrieben, die zur Analyse der aufgenommenen Bilder verwendet werden sollten.
    1. Öffnen Sie die Bilddateien, die während des Experiments erfasst wurden.
    2. Verwenden Sie das Polygon- oder Kreiswerkzeug, um den Interessenbereich jeder Zelle auszuwählen, um die Analyse durchzuführen. Die Analyse sollte die Helligkeit jeder Zelle zu jedem Zeitpunkt angeben.
      HINWEIS: Es empfiehlt sich, einzelne Zellen auszuwählen und keine Zellen, die die Wand der Schale oder andere Zellen berühren. Dies gewährleistet die bestmögliche Datenerfassung. Wählen Sie innerhalb jeder Bedingung mindestens 5 Zellen für die Analyse aus, und wiederholen Sie das Experiment mindestens dreimal.
    3. Öffnen Sie nach der Analyse der Daten die Daten in einer Excel-Tabelle und berechnen Sie die durchschnittliche Helligkeit für jeden Zustand auf jedem Foto, beginnend mit dem Bild, kurz bevor Sie die pharmakologischen Wirkstoffe oder das Vehikel hinzufügen. In diesem Beispiel bei der 3-Minuten-Marke oder dem 6. Foto, das mit dem Mikroskop aufgenommen wurde, da jedes Bild alle 30 s aufgenommen wird.
    4. Berechnen Sie ΔF/F0 für jeden Mittelwert in jeder Bedingung.
    5. Laden Sie es in eine statistische Analysesoftware und zeichnen Sie ΔF/F0 gegen die Zeit in s.
      HINWEIS: Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte der Protokolle.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wurde der zytosolische Biosensor sowohl in Platten-Readern als auch in Mikroskop-Assays validiert. Sobald die Zellen den Biosensor exprimiert hatten, wurden sie entweder mit 10 μM Forskolin (einem direkten Aktivator der Adenylylcyclase), 10 nM Isoproterenol (einem Agonisten an ß1AR und ß2AR) oder Vehikel stimuliert (Abbildung 1). Die nachfolgenden Änderungen der Fluoreszenz, die auf die cAMP-Produktion hinweisen, wurden alle 30 s erfasst.

...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Eine genaue und empfindliche Messung von cAMP ist entscheidend für das Verständnis seiner Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen und für die Untersuchung der Aktivität von cAMP-abhängigen Signalwegen. Es gibt mehrere Methoden, die häufig zur Messung des cAMP-Spiegels verwendet werden, darunter ELISA, Radioimmunoassay, FRET-Biosensoren und der GloSensor cAMP-Assay 14,15,16,17,18....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-Platte (klar)Fisherbrand21-377-203
35-mm-SchaleGreiner Bio-One627870Zellkulturschalen mit Glasboden
96-Well-Platte Corning3904Schwarz mit klarem flachem Boden
Antibiotisch-Antimykotisch (100x)Gibco15240062Für HEK- und HASM-Medien
BZ-X FluoreszenzmikroskopKeyence
Calciumchlorid (IM)Quality Biological IncE506Für HASM-Medien
Zentrifugenröhrchen (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092HEK Medien
DPBS mit Mg2+ und Ca2+ Gibco14040-133
DPBS ohne Mg2+ und Ca2+Corning14040-133
Fetales Rinderserum (FBS)R& D systemsS11195Für HEK- und HASM-Medien
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagenz
Ham's F-12K Gibco21127022Für HASM Medien
HEPES (1M)Gibco15630080Für HASM Medien
IsoproterenolSigmaI6504Wirkstoff
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081Für HASM Medien
Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotikum für HASM-Medien
RNAseweg Thermo Scientific700511 Reagenz
NatriumhydroxidlösungSigmaS2770Für HASM-Medien
Spectrmax M5 PlattenleserMolekulare Bauelemente
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagenz
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagenz

Referenzen

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769(2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332(2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646(2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297(2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

cAMP-BiosensorLive-Cell-Imagingfluoreszierender BiosensorcADDis-Sensormenschliche Atemwegsglatte MuskulaturEinzelzell-ImagingFluoreszenzmikroskopieHochdurchsatz-Screening
Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.