Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Summary

Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.

Abstract

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner weit verbreiteten Resistenz gegen Antibiotika als anspruchsvoller gramnegativer Erreger anerkannt. Es ist entscheidend, die Mechanismen hinter dieser Resistenz zu verstehen, um neue und wirksame Therapieoptionen zu entwickeln. Leider wird unsere Fähigkeit, diese Mechanismen bei A. baumannii zu untersuchen, durch den Mangel an geeigneten Genmanipulationswerkzeugen behindert. Hier beschreiben wir Methoden zur Verwendung eines chromosomalen mini-Tn7-basierten Systems, um eine Einzelkopie-Genexpression in einem A. baumannii-Stamm zu erreichen, dem funktionelle RND-Typ-Efflux-Mechanismen fehlen. Einzelkopieninsertion und induzierbare Effluxpumpenexpression sind sehr vorteilhaft, da das Vorhandensein von RND-Efflux-Operonen auf Plasmiden mit hoher Kopienzahl von Bakterienzellen oft schlecht vertragen wird. Darüber hinaus hilft der Einbau rekombinanter mini-Tn7-Expressionsvektoren in das Chromosom eines Surrogat-A . baumannii-Wirts mit erhöhter Effluxempfindlichkeit, Interferenzen durch andere Effluxpumpen zu umgehen. Dieses System ist nicht nur für die Untersuchung uncharakterisierter bakterieller Effluxpumpen wertvoll, sondern auch für die Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren, die auf diese Pumpen abzielen.

Introduction

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner umfassenden Resistenz gegen alle Klassen von Antibiotika ein Krankheitserreger der Weltgesundheitsorganisation mit höchster Priorität¹. Es ist ein opportunistischer Erreger, der hauptsächlich hospitalisierte, verletzte oder immungeschwächte Menschen betrifft. A. baumannii entzieht sich Antibiotika weitgehend über Effluxpumpen, wobei die relevanteste die Exporteursfamilie der Resistance-Nodulation-Division (RND)^{ist 2}. Wenn man versteht, wie diese Effluxpumpen mechanistisch funktionieren, kann man gezielte therapeutische Optionen entwickeln.

Eine gängige Methode, um zelluläre Prozesse spezifisch zu unterscheiden, ist die genetische Manipulation. Die für genetische Studien von A. baumannii verfügbaren Werkzeuge sind jedoch begrenzt, und um das experimentelle Design weiter zu verwirren, sind klinische Isolate oft resistent gegen die Antibiotika, die routinemäßig für die Selektion bei genetischen Manipulationen verwendet werden³. Eine zweite Hürde bei der Untersuchung von Ausflusspumpen besteht darin, dass sie streng reguliert werden - oft durch unbekannte Faktoren -, was es schwierig macht, eine einzelne Pumpe genau zu isolieren und ihrer Funktion zuzuordnen⁴. Angesichts dieser Notwendigkeit, den Forschungswerkzeugkasten zu erweitern, haben wir ein induzierbares Mini-Tn7-basiertes, induzierbares Expressionssystem mit Einzelkopie-Insertion entwickelt, das eine Flp-Rekombinase-Zielkassette (FRT) enthält, die die Entfernung des Selektionsmarkers ^5,6,7 ermöglicht (Abbildung 1). Dieses elegante Klonierungs- und Expressionssystem wurde erstmals für Pseudomonas ^8,9,10 entwickelt und verwendet, um Einzelkopie-Effluxpumpenkomplemente in einen RND-Effluxpumpen-defizienten Stamm von A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: im Folgenden als A. baumannii AB258 bezeichnet) zu erzeugen, den wir¹¹. Wenn man in der Lage ist, eine Effluxpumpe nach der anderen zu untersuchen und die Bakterienzellen nicht mit einer hohen Kopienexpression zu überfordern (wie es im Allgemeinen bei plasmidbasierten Expressionssystemen der Fall ist), kann man die kritischen, physiologischen Aspekte jeder Effluxpumpe mit minimaler Interferenz und reduzierten Komplikationen besser kennenlernen.

Dieser Artikel beschreibt, wie das Mini-Tn7-System verwendet wird, um ein deletiertes Gen von Interesse, die RND-Effluxpumpe adeIJK, durch eine Reihe von unkomplizierten Schritten, die im Laufe von 9 Tagen durchgeführt werden, in das Chromosom von A. baumannii AB258 zu ergänzen⁷. Die erste Gruppe von Schritten führt die deletierten Effluxpumpengene, die in das mini-Tn7-basierte Insertionsplasmid kloniert wurden (Abbildung 2A), an der einzelnen att-Tn7-Insertionsstelle stromabwärts des gut konservierten glmS-Gens wieder ein (Abbildung 3A). Dieser Prozess wird durch ein nicht-replikatives Helferplasmid (Abbildung 2B) erleichtert, das für die Transposase-Gene kodiert, die für die Tn7-gesteuerte Insertion benötigt werden. Die zweite Gruppe von Schritten verwendet ein Exzisionsplasmid (Abbildung 2C) zur Flp-Rekombinase-vermittelten Entfernung des Gentamicin-Gens, flankiert von FRT-Stellen (Abbildung 3B), um einen unmarkierten Stamm zu erzeugen. Obwohl dieses System verwendet wird, um die wesentlichen Rollen und möglichen Inhibitoren von RND-Effluxpumpen in Bezug auf Antibiotikaresistenz aufzuklären, kann es zur Untersuchung jedes Gens von Interesse verwendet werden.

Protocol

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Reinigen Sie das Plasmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (Insertionsplasmid, Abbildung 2A) mit dem interessierenden Gen.
   HINWEIS: Hier ist das interessierende Gen adeIJK. Die endgültige Plasmidkonzentration sollte ≥100 ng/μl betragen.
2. Reinigen Sie das Helferplasmid (pTNS2)⁹ und das Exzisionsplasmid (pFLP2^ab)⁶ (Abbildung 2B, C), idealerweise auf eine endgültige Plasmid-DNA-Konzentration von ≥100 ng/μl.
3. Bereiten Sie 50 ml steriles Reinstwasser und 25 ml sterile LB-Bouillon (Lennox) vor (siehe Materialtabelle).
4. Bereiten Sie mindestens 10 LB-Agarplatten vor, die jeweils die folgenden Zusätze enthalten: einfach (ohne Zusatzstoffe), Gentamicin (Gm) mit 50 μg/ml, Carbenicillin (Cb) mit 200 μg/ml (zur Auswahl über das Ampicillin-Resistenzgen) und 5% Saccharose (siehe Materialtabelle).
5. Streichen Sie den Stamm aus, der zum Einsetzen auf LB-Agar verwendet werden soll, und inkubieren Sie ihn bei 37 °C für 16-18 h. Hier wird A. baumannii AB258 verwendet.
   HINWEIS: Dieses Protokoll muss so weit wie möglich in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden, indem ein Bunsenbrenner auf dem Labortisch oder eine biologische Sicherheitswerkbank verwendet wird. Alle Verbrauchsmaterialien (Pipettenspitzen, Impfösen, Mikrofugenröhrchen usw.) müssen steril sein.

2. Vorbereitung der Kultur

1. Eine einzelne Kolonie von A. baumannii AB258 in 4 ml LB-Bouillon in einem sterilen 13-ml-Kulturröhrchen mit einer sterilen Impföse oder einem sterilen hölzernen Impfstäbchen impfen.
   HINWEIS: Eine einzelne 4-ml-Kultur wird für eine Probe und eine Kontrolle verwendet. Erhöhen Sie die Anzahl der Kulturen in Abhängigkeit von der Anzahl der benötigten Proben.
2. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) inkubieren.
3. Stellen Sie eine Flasche steriles destilliertes Wasser (25-50 ml) über Nacht auf 4 °C, um sie in Schritt 3 zu verwenden.

3. Vorbereitung elektrokompetenter Zellen

1. Legen Sie alle sterilen 1,5-ml-Mikrofugeröhrchen (zwei pro Kultur) und sterilen Elektroporationsküvetten (zwei pro Kultur) auf Eis (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Proben während des gesamten Verfahrens so weit wie möglich auf Eis.
2. Stellen Sie die Flasche mit sterilem Wasser, die bei 4 °C gelagert wurde, auf Eis.
3. Übertragen Sie 1,5 ml der Bakterienkultur über Nacht in eines der 1,5 ml-Mikrofugenröhrchen.
4. Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 13.000 x g , um die Zellen zu pelletieren.
   HINWEIS: Die Zentrifugation würde idealerweise bei 4 °C durchgeführt, aber die Zentrifugation bei Umgebungstemperatur ist akzeptabel und nicht schädlich.
5. Entfernen Sie mit einer 1-ml-Pipette den gesamten Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
6. Geben Sie weitere 1,5 ml Bakterienkultur in dasselbe Mikrofugenröhrchen. 2 Minuten bei 13.000 x g zentrifugieren und dann den gesamten Überstand entfernen.
7. Wiederholen Sie Schritt 3.6 ein letztes Mal mit den verbleibenden 1 ml Kultur.
8. Geben Sie 1 ml eiskaltes, steriles Wasser in das Zellpellet und resuspendieren Sie es durch vorsichtiges Pipettieren, bis das Pellet nicht mehr am Boden des Mikrofuge-Röhrchens sitzt.
9. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Zellen bei 13.000 x g für 2 min.
10. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette. Gießen Sie den Überstand nicht ab, insbesondere in den nachfolgenden Waschschritten, wenn die Zellen dazu neigen, weniger kompakte Pellets zu bilden.
11. Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit eiskaltem sterilem Wasser, Schritte 3.8 bis Schritt 3.10, noch zweimal.
12. Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet vorsichtig in 200 μl eiskaltem, sterilem Wasser.
13. 100 μl der endgültigen Zellsuspension in das zweite eiskalte 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen überführen. Dieses zweite Aliquot wird zur Negativkontrolle für die Elektroporation. Bewahren Sie die Zellproben auf Eis auf.

4. Elektroporation

1. 1 ml LB-Bouillon und eine LB + Gm^{50-Agarplatte} (hergestellt in Schritt 1.4) für jede Probe vorwärmen und in einem statischen Inkubator auf 37 °C kontrollieren.
2. In einem kombinierten Volumen von 5 μl oder weniger werden jeweils 100-200 ng des pTNS2-Helferplasmids und des pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK-Insertionsplasmids zu einem Aliquot elektrokompetenter Zellen hinzugefügt.
3. Mischen Sie mit sanftem Fingertippen, um eine vollständige Vermischung der Plasmide mit den elektrokompetenten Zellen ohne Blasenbildung zu gewährleisten.
4. Ein äquivalentes Volumen sterilen destillierten Wassers in das Aliquot der Negativkontrollzelle geben und vorsichtig wie oben beschrieben mischen.
5. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis.
6. Übertragen Sie die gesamte Zellprobe in eine eiskalte Elektroporationsküvette und legen Sie die Küvette dann wieder auf Eis. Wiederholen Sie dies für die Probe der Negativkontrollzelle.
7. Elektroporate die Zellprobe.
   1. Schalten Sie den Elektroporator ein und stellen Sie ihn auf 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) ein (siehe Materialtabelle).
   2. Wischen Sie die Oberfläche der Küvette mit einem weichen Tuch ab, um anhaftendes Eis oder Feuchtigkeit zu entfernen.
   3. Führen Sie die Küvette in den Elektroporator ein und geben Sie den Stromschlag ab.
   4. Geben Sie sofort 0,9 ml vorgewärmte LB-Bouillon zu den Zellen in der Küvette und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen mit dem Medium zu mischen.
   5. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein neues 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen (Raumtemperatur).
   6. Überprüfen Sie den Zeitkonstantenwert am Elektroporator. Für beste Ergebnisse sollte dieser Wert zwischen 4 und 6 liegen.
8. Wiederholen Sie das Elektroporationsverfahren (Schritte 4.7.1 bis Schritt 4.7.6) für die Probe der Negativkontrollzelle.
9. Inkubieren Sie die elektroporierten Proben bei 37 °C für 1 h bei 250 U/min, um eine Zellrückgewinnung zu ermöglichen.
10. Verteilen Sie mit einem Impfstreuer 100 μl jeder elektroporierten Zellprobe auf einer vorgewärmten LB + Gm⁵⁰ Agarplatte.
    1. Zentrifugieren Sie die verbleibenden Proben 2 Minuten lang bei 13.000 x g , um die Zellen zu pelletieren.
    2. Nachdem Sie den gesamten Überstand mit einer Pipette entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl LB-Brühe.
    3. Jede gesamte Probe wird auf einzelne vorgewärmte LB + Gm⁵⁰ Agarplatten verteilt.
       HINWEIS: Die Effizienz der Elektroporation kann dehnungsabhängig sein. Bei der erstmaligen Elektroporation eines Stammes kann es informativ sein, verschiedene Volumina oder sogar Verdünnungen der Elektroporationsprobe auszuplattieren, um sicherzustellen, dass die resultierenden Platten isolierte Kolonien aufweisen.
11. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 16-18 h.

5. Auswahl transformierter Kolonien für das PCR-basierte Screening

1. Überprüfen Sie die Elektroporationsplatten. Die Negativkontrolle sollte keine Kolonien haben; Die Probe sollte unterschiedliche Kolonien haben.
   HINWEIS: Platten mit Kolonien können in diesem Schritt und in allen nachfolgenden Schritten, in denen Agarplatten mit Kolonien oder Pflastern hergestellt werden, bis zu 3 Tage bei 4 °C gelagert werden, bevor sie fortfahren.
2. Entnehmen Sie mit sterilen Zahnstochern bis zu 10 Einzelkolonien von den LB + Gm⁵⁰ Agarplatten und flicken Sie sie auf eine frische LB + Gm⁵⁰ Agarplatte.
3. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 16-18 h.

6. Überprüfung der chromosomalen Insertion durch Kolonie-PCR

1. Entfernen Sie die LB + Gm⁵⁰ Agarplatten mit den geflickten Kolonien aus dem Inkubator.
2. Entfernen Sie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer sterilen Pipettenspitze eine kleine Portion (etwa die Größe einer großen Kolonie) aus einem Pflaster in 20 μl steriles destilliertes Wasser in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen. Gut mischen. Die Wasserprobe sollte sichtbar trüb werden, wenn die Zellen aus dem Zahnstocher gelöst werden. Bereiten Sie eine beliebige Anzahl von Proben vor, die gescreent werden müssen, aber 6 sollten ausreichen.
3. Inkubieren Sie das PCR-Röhrchen mit der Bakteriensuspension bei 100 °C für 5-10 Minuten.
4. Schleudern Sie die Probe mit einer Mini-Zentrifuge (siehe Materialtabelle) 2 Minuten lang mit der festgelegten maximalen Geschwindigkeit, um Zellreste zu pelletieren.
5. Übertragen Sie den Überstand in ein neues 0,2-ml-PCR-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Diese Probe enthält die Template-DNA für die PCR-Reaktion.
   HINWEIS: Diese Template-DNA kann bei -20 °C gelagert werden, bevor mit der PCR fortgefahren wird.
6. Bereiten Sie ein PCR-Reaktionsgemisch vor, das 1x Polymerasepuffer, 200 μM dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New Forward-Primer, 0,18 μM Tn7R-Reverse-Primer (Tabelle 1), 1 U Taq-DNA-Polymerase und 1 μl der vorbereiteten Template-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 μl enthält. Bereiten Sie eine No-Template-Kontrolle (NTC) vor, die alle bis auf die Template-DNA enthält (siehe Materialtabelle).
7. Geben Sie die Reaktionsbedingungen in einen Thermocycler ein: 95 °C für 2 min; 95 °C für 30 s, 49 °C für 30 s und 72 °C für 30 s für insgesamt 35 Zyklen; 72 °C für 10 min; 12 °C halten. Führen Sie die Beispiele aus.
8. Nach der Zugabe von DNA-Ladefarbstoff zu einer Endkonzentration von 1x werden 10 μl jeder PCR-Reaktion auf ein 2%iges Agarosegel geladen und 40 Minuten lang bei 80 V ausgeführt. Die erwartete Amplikongröße für dieses Primerpaar beträgt 382 bp. Der NTC sollte keine Bänder haben.
9. Identifizieren Sie die Proben, die das erwartete PCR-Produkt hergestellt haben. Bereiten Sie eine Streifenplatte auf LB + Gm^{50-Agarplatten} aus einem der PCR-positiven Pflaster vor; Bei 37 °C 16-18 h inkubieren. Ziel ist es, eine Platte mit einzelnen Kolonien für die Herstellung eines Glycerinbestands zu erzeugen, um diesen markierten Stamm zu konservieren und als Ausgangspunkt für die Erzeugung eines unmarkierten Stammes (siehe unten).

7. Entfernung des GM^R-Markers mit pFLP2^ab

1. Befolgen Sie das in Schritt 2: Kulturvorbereitung beschriebene Verfahren. Die zur Vorbereitung der Übernachtkultur verwendete Probe ist eine einzelne Kolonie aus den LB + Gm^{50-Agarplatten} , die in Schritt 6.9 zur Erzeugung diskreter Kolonien vorbereitet wurden.
2. Befolgen Sie das in Schritt 3: Vorbereitung elektrokompetenter Zellen beschriebene Verfahren. Bereiten Sie die Zellen aus der Übernachtkultur für die Elektroporation vor.
3. Befolgen Sie das in Schritt 4 beschriebene Verfahren: Elektroporation. Hier ist das Plasmid, das in die Zellen eingeführt werden soll, pFLP2^ab (100-200 ng), das das Gentamicin-Resistenzgen entfernt und das chromosomal eingefügte Gen von Interesse flankiert.
4. Nachdem sich die Zellen 1 h lang erholt haben (Schritt 4.9), verteilen Sie 100 μl der elektroporierten Zellprobe auf einer vorgewärmten LB + Cb^{200-Agarplatte} (hergestellt in Schritt 1.4). Dieser Selektionsdruck stellt sicher, dass nur Zellen wachsen, die das pFLP2-Ab-Exzisionsplasmid beherbergen.
5. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 16-18 h.
6. Überprüfen Sie die Platte auf Kolonien. Die Negativkontrollplatte sollte keine Kolonien haben; die LB + Cb²⁰⁰ Agar-Probenplatte sollte unterschiedliche Kolonien aufweisen.
7. Mit sterilen Zahnstochern bis zu 20 isolierte Kolonien auf eine LB + Cb²⁰⁰ Agarplatte und eine LB + Gm⁵⁰ Agarplatte kreuzen.
8. Inkubieren Sie die Platten 16-18 h bei 37 °C.
9. Überprüfen Sie die Platten auf Flicken. Bei Klonen, die auf der LB + Cb^{200-Agarplatte} , aber nicht auf der LB + Gm^{50-Agarplatte} wachsen, wurde das Gentamicin-Resistenzgen aus dem ursprünglichen Insert entfernt.
10. Wählen Sie die Pflaster aus, die Carbenicillin-resistent und Gentamicin sind, die anfällig für Streifen auf einzelnen LB-Agarplatten sind, die mit 5% (w/v) Saccharose ergänzt sind, wodurch die Ausstoßung des pFLP2-ab-Plasmids aus den Bakterien erzwungen wird. Wähle bis zu 10 Kolonien.
11. Inkubieren Sie die Platten 16-18 h bei 37 °C.
12. Überprüfen Sie die Platten auf Kolonien.
13. Als endgültige Bestätigung des pFLP2-ab-Plasmidverlusts werden 4-6 isolierte Kolonien von den 5%igen Saccharoseplatten auf eine LB + Cb^{200-Agarplatte} und eine LB-Agarplatte gepatcht.
14. Inkubieren Sie die Platten 16-18 h bei 37 °C.
15. Wählen Sie einen Klon, der auf der LB-Agarplatte wächst und Carbenicillin-empfindlich ist, für die Herstellung eines Glycerinstocks, um diesen unmarkierten Stamm zu erhalten.
    1. Die genetische Überprüfung des unmarkierten Stammes kann mit der Kolonie-PCR (Schritt 6: Überprüfung der chromosomalen Insertion durch Kolonie-PCR) unter Verwendung der Primer durchgeführt werden, die auf das Gentamicin-Resistenzgen abzielen.
    2. Bereiten Sie ein PCR-Reaktionsgemisch vor, das 1x Polymerasepuffer, 200 μM dNTPs, 0,18 μM Gm_F Vorwärtsprimer, 0,18 μM Gm_R Reverse-Primer (Tabelle 1), 1 U Taq-DNA-Polymerase und 1 μl der vorbereiteten Matrizen-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 μl enthält. Bereiten Sie eine No-Template-Kontrolle (NTC) vor, die alle außer der Matrizen-DNA enthält. und eine Positivkontrolle unter Verwendung von DNA aus dem markierten Stamm.
    3. Geben Sie die Reaktionsbedingungen in einen Thermocycler ein: 95 °C für 2 min; 95 °C für 30 s, 50 °C für 30 s und 72 °C für 40 s für insgesamt 35 Zyklen; 72 °C für 10 min; 12 °C halten. Führen Sie die Beispiele aus.
    4. Nach der Zugabe von DNA-Ladefarbstoff zu einer Endkonzentration von 1x werden 10 μl jeder PCR-Reaktion auf ein 1%iges Agarosegel geladen und 40 Minuten lang bei 80 V ausgeführt. Die erwartete Amplikongröße für dieses Primerpaar beträgt 525 bp. Die Positivkontrolle sollte ein einzelnes Band haben; die Samples und der NTC sollten keine Bänder haben.

Results

Das Chromosomeninsertionsverfahren dauert insgesamt nur 2 Stunden über 3 Tage, um ein Ergebnis zu sehen - Kolonien wachsen auf einer selektiven Agarplatte (Abbildung 1A-C). Die erwartete Anzahl von Kolonien auf der Transformationsplatte ist stammabhängig: Man kann 20-30 oder sogar Hunderte von Kolonien sehen, da die Insertion von Tn7 an attTn7-Stellen spezifisch und effizient ist⁹. Das Patchen von Transformationsplattenkolonien auf selektive Medien (Abbildung 4A) konserviert den transformierten Stamm und liefert Ausgangsmaterial für das Kolonie-PCR-Screening (Abbildung 1E und Abbildung 4B). Das Screening von Kolonien durch PCR kann auf ein Minimum beschränkt werden - es sollten nicht mehr als 10 Kolonien verarbeitet werden, und die meisten sollten ein positives Ergebnis für die Insertion liefern. Das PCR-Produkt für die Screening-Primer ABglmS2_F_New und Tn7R (Tabelle 1) beträgt 382 bp (Abbildung 4B, Spur 4); Negativkontrollen für die Reaktion umfassen Wildtyp-A. baumannii ATCC 17978 (Abbildung 4B Spur 2), AB258 (Abbildung 4B Spur 3) und kein Template (Abbildung 4B Spur 5). Kolonien, die PCR-positiv sind, stellen komplementäre, markierte Stämme dar.

Die Entfernung des Gentamicin-Resistenzgens (Unmarking aufheben) dauert weniger als 3 Stunden und erstreckt sich über 6 Tage, da die mit dem Exzisionsplasmid transformierten Zellen durch selektive Plattierung ausgewählt und dann das Exzisionsplasmid von den Bakterien geheilt werden müssen (Abbildung 1F). Die auf Flp-FRT-Rekombination basierende Exzision ist präzise und effektiv und sollte zu ≥20 Kolonien auf der Transformationsplatte führen. Kolonien, die auf Carbenicillin (Selektion nach β-Lactam-Resistenz, die durch das Exzisionsplasmid übertragen wird) und Gentamicin (auf der Suche nach Verlust der Gentamicin-Resistenz) gepatcht werden, sollten alle Carbenicillin-resistent bzw. Gentamicin-empfindlich sein. Das Exzisionsplasmid wird durch Wachstum auf 5%igen Saccharose-Agarplatten aus den Bakterien verdrängt. Das Wachstum auf Saccharose zwingt die Zellen, pFLP2^ab zu eliminieren, da das sacB-Gen auf dem Plasmid die Umwandlung von Saccharose in Levans, ein für die Bakterien toxisches Polysaccharid, fördert^12,13. Alle Kolonien, die auf 5%igem Saccharosemedium wachsen, sollten dann nur auf einfachen LB-Agarplatten wachsen; Es sollte kein Wachstum auf Carbenicillin-Agar-Platten geben. Kolonien, die auf den einfachen LB-Agarplatten wachsen, stellen unmarkierte Stämme dar. Die Bestätigung des Verlusts des Gentamicin-Markers kann durch Kolonie-PCR unter Verwendung der Gm_F und Gm_R Primer erreicht werden (Tabelle 1 und Abbildung 5). Dieses Primerpaar ergibt nur in der Positivkontrolle ein Amplikon von 525 bp (der ursprünglich erzeugte markierte Stamm, Abbildung 5 Spur 4); Wildtyp-ATCC 17978 (Abbildung 5 Spur 2), AB258 (Abbildung 5 Spur 3), jede getestete Kolonie (Abbildung 5 Spur 5) und die No-Template-Kontrolle (Abbildung 5 Spur 6) sollten keine Amplifikation zeigen.

Sobald der unmarkierte Stamm bestätigt ist, können die Funktionstests mit phänotypischen Assays beginnen. Hier ist die offensichtliche erste Wahl die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) einer Reihe von Antibiotika: Ciprofloxacin ist ein bekanntes Substrat von AdeIJK, Tetracyclin kann durch AdeIJK entfernt werden (die Haupteffluxpumpe ist AdeAB), und Kanamycin hat eine relativ geringe Wirkung auf A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Unter Verwendung der Bouillon-Mikroverdünnungsmethode gemäß den CLSI-Richtlinien¹⁵ wurde der komplementäre unmarkierte Stamm AB258::adeIJK mit jedem Antibiotikum in Abwesenheit und Gegenwart von 50 μM IPTG provoziert; Wildtyp-Stamm ATCC 17978 und RND-Efflux-defizienter Stamm AB258 wurden als Kontrollen eingeschlossen (Tabelle 2). Insgesamt zeigt der in den MHK-Werten beobachtete Trend die erwartete verminderte Anfälligkeit von AB258::adeIJK gegenüber Ciprofloxacin und Tetracyclin mit induzierter Expression der Effluxpumpe, was bestätigt, dass die Insertion von adeIJK erfolgreich war.

Abbildung 1: Überblick über das Verfahren. (A) Es wird eine Übernachtkultur des zu ergänzenden Stammes A. baumannii hergestellt. (B) Die Zellen aus der Nachtkultur werden 3 Mal durch Zentrifugation mit Wasser gewaschen und auf Eis gehalten. (C) Die Verabreichungs- und Helferplasmide werden den Zellen zugesetzt und 20 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Probe wird elektroporiert, LB-Medien werden hinzugefügt und die Zellen werden 1 h bei 37 °C zurückgelassen. Ein 100-μl-Aliquot von Zellen wird auf LB + Gm^{50-Agarplatten} verteilt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. (D) Kolonien von der Transformationsplatte werden auf eine LB + Gm⁵⁰ Agarplatte gepatcht und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. (E) Gepatchte Kolonien werden für die PCR vorbereitet, um nach dem Vorhandensein eines Amplifikationsprodukts zu suchen, das die chromosomale Insertionsstelle umfasst. Die PCR-Amplifikation wird durch Agarose-Gelelektrophorese visualisiert. PCR-positive Proben stehen für die erfolgreiche Insertion des interessierenden Gens in das Chromosom und die Bildung eines markierten Stammes. (F) Eine für Gentamicin positive Kolonie wird wie in den Schritten (A-C) mit Elektroporation des pLFP2-ab-Plasmids hergestellt, um die Gentamicinkassette von der chromosomalen Insertion zu entfernen. Die selektive Beschichtung auf LB + Cb^200-Agar bestätigt die Aufnahme des Plasmids. Doppelte Patchings auf LB + Cb²⁰⁰ und LB + Gm⁵⁰ Agarplatten zeigen Kolonien, die Cb^R und Gm^S sind, was den Verlust der Gentamicinkassette durch das Einsetzen bestätigt. Das Wachstum ausgewählter Cb R-Kolonien auf 5% Saccharose heilt das pLFP2^ab-Plasmid aus den Zellen. Kolonien aus der 5%igen Saccharoseplatte werden auf LB + Cb^200-Agar und LB-Agar gepatcht, um die gewünschten Cb^S- und^{GM S-Kolonien} aufzudecken und die Entstehung des unmarkierten Stammes zu bestätigen. Gm⁵⁰, Gentamicin bei 50 μg/ml; Cb²⁰⁰, Carbenicillin bei 200 μg/ml; ^R, widerstandsfähig; ^S, sensibel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: In diesem Protokoll verwendete Plasmide. Allgemeine Plasmidkarten von (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (Insertionsplasmid), (B) pTNS2 (Helferplasmid) und (C) pFLP2^ab (Exzisionsplasmid). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schema des Einfügens und Aufhebens der Markierung. (A) Einfügung. Die einzelne Tn7-Insertionsstelle im A. baumannii-Chromosom befindet sich 24 bp vom Ende des glmS2-Gens entfernt. Die Co-Elektroporation des Insertionsplasmids und des Helferplasmids ermöglicht die Komplementierung des interessierenden Gens (eingefügtes Gen, violett) zusammen mit dem Rest der Insertionskassette (FRT-Stellen für die Markerexzision, gelb; accC1-Gen für Gentamicinresistenz, grün; lacIq-Gen für induzierbare Expression, blau) in das Chromosom ein. (b) Aufheben der Markierung. Die Elektroporation des komplementären, markierten Insertionsstamms mit dem pFLP2-ab-Exzisionsplasmid erleichtert die Entfernung des Gentamicin-Resistenzgens (accC1, grün) über die Flp-FRT-Rekombination (FRT-Stellen, gelb), wodurch ein unmarkierter Stamm entsteht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Transformation, Patching und Insertionsbestätigung durch Kolonie-PCR. Repräsentatives Ergebnis von (A) dem Wachstum von Transformationskolonien nach dem Patchen und (B) der Kolonie-PCR-Amplifikation mit ABglmS_F_New (grau) und Tn7R (orange) Primern zur Bestätigung der chromosomalen Insertion. Spur 1: Niedermolekulare DNA-Leiter; Spur 2: ATCC 179798; Spur 3: AB258; Spur 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Spur 5: keine Vorlagenkontrolle. Die erwartete Bandbreite von 382 Basispunkten ist gekennzeichnet. Beachten Sie, dass die Gentamicin-spezifischen Primer (Gm_F und Gm_R, grün) auch verwendet werden können, um die chromosomale Insertion zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Bestätigung des Markerverlusts durch Kolonie-PCR. Repräsentatives Ergebnis der Kolonie-PCR-Amplifikation mit Gentamicin-spezifischen Primern (Gm_F und Gm_R) zur Bestätigung des Verlusts des Antibiotikamarkers durch pFLP^ab-basierte Exzision. Spur 1: niedermolekulare DNA-Leiter; Spur 2: ATCC 179798; Spur 3: AB258; Spur 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Spur 5: AB258::adeIJK; Spur 6: keine Vorlagenkontrolle. Die erwartete Bandbreite von 525 Basispunkten ist gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Stämme, Plasmide und Primer	Relevante Merkmale	Referenz
Fleck
A. baumannii ATCC 17978	Typ Stamm	ATCC
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmide
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Diese Studie
pTNS2	VerstärkerR	9
pFLP2ab	pWH1266 Ursprung oder Replikation, sacB, AmpR	7
Zündkapseln	Sequenz (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Diese Studie
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Diese Studie

Tabelle 1: Bakterienstämme, Plasmide und Primer, die in diesem Protokoll verwendet werden. Gm, Gentamicin; Amp, Ampicillin; ^R, resistent.

	Ciprofloxacin		Tetracyclin		Kanamycin
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Faltenwechsel		4.01		4.03		0.25

Tabelle 2: Testen der Funktionalität der eingefügten Gene über die Antibiotikaempfindlichkeit. Vergleich der minimalen Hemmkonzentrationswerte (MIC) für A. baumannii ATCC 17978, AB258, uninduziertes AB258::adeIJK und IPTG-induziertes AB258::adeIJK gegen Ciprofloxacin, Tetracyclin und Kanamycin. Faltungsänderung = induziert (+ IPTG)/nicht induziert (− IPTG); nd = nicht bestimmt.

Discussion

Auch wenn dieses Verfahren zur chromosomalen Insertion eines induzierbaren Einzelkopie-Genexpressionssystems in A. baumannii technisch einfach und nicht arbeitsintensiv ist, gibt es einige wichtige Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Zunächst muss die Präparation der kompetenten Zellen so weit wie möglich auf Eis erfolgen, da die Zellen beim Austausch des Mediums durch eiskaltes Wasser zerbrechlich werden. Idealerweise werden die Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchgeführt, aber eine Zentrifugation bei Raumtemperatur ist akzeptabel. Angesichts der zunehmenden Zerbrechlichkeit der Zellen während der Wasserspülungen ist auch ein schonendes Pipettieren von entscheidender Bedeutung. Zweitens reagiert die Elektroporation empfindlich auf das Vorhandensein von Ionen. Durch das Waschen der Zellen mit mehreren Runden der Pelletierung und Resuspendierung in Wasser wird sichergestellt, dass das Medium vollständig entfernt wird. Außerdem sollten Plasmide frisch gereinigt werden und können in Standard-Kit-Elutionspuffern (normalerweise TE-Puffer) eluiert werden, solange die Plasmid-DNA-Konzentration hoch genug ist. Unser Ziel ist es, <5 μl Plasmid zu 100 μl Zellsuspension hinzuzufügen, um die Ionenstärke der Probe sehr niedrig zu halten, obwohl bis zu 10 μl toleriert werden sollten. Drittens sollten bei Bedarf selektive Agarplatten hergestellt werden, um die Wirksamkeit des zugesetzten Antibiotikums sicherzustellen. Beachten Sie, dass Carbenicillin anstelle des üblichen Ampicillins zur Selektion während der Transformation des Exzisionsplasmids pFLP2^ab verwendet wurde. A. baumannii ist intrinsisch resistent gegen Aminopenicilline (Ampicillin)¹⁶; Die Substitution eines Carboxypenicillins (Carbenicillin) ermöglicht eine fortgesetzte Selektion mit der Plasmid-kodierten β-Lactamase.

Die Optimierung des Versuchsprotokolls ist nuancierter und variiert zwischen verschiedenen Arten von Acinetobacter (oder sogar genetisch manipulierten Stämmen innerhalb derselben Spezies) und möglicherweise den im Labor verwendeten Reagenzien. Beispielsweise kann die für die Elektroporation verwendete Spannung zwischen 1,8 und 2,5 kV variieren, und die Thermocycling-Bedingungen müssen je nach der für die PCR verwendeten DNA-Polymerase möglicherweise leicht geändert werden. Hilfreiche Hinweise, die bei schlechtem Zellwachstum nach der Elektroporation zu berücksichtigen sind, sind die Reduzierung der Gentamicinkonzentration in den Agarplatten von 50 μg/ml auf 30 μg/ml und/oder die Verlängerung der Inkubationszeit der Agarplatten auf ≥24 h. Was die Schritte zum Entfernen der Gentamicinkassette betrifft, so kann der Erfolg mit LB-Agarplatten mit 10 % Saccharose und/oder deren Inkubation bei 30 °C für ≥24 h erzielt werden, wenn die Carbenicillinresistenz anhält.

In der Literatur finden sich zahlreiche A. baumannii-Zellpräparationsmethoden für die Verwendung mit Elektroporation, die jedoch häufig einen Subkulturierungsschritt nach der anfänglichen Übernachtkultur und dann eine lange Wachstumsphase bis zu einer vorgeschriebenen optischen Dichte beinhalten. Wir haben festgestellt, dass eine einfache Nachtkultur genauso effektiv eingesetzt werden kann. Die Elektroporation von A. baumannii wurde gut beschrieben, und die Leser können hier weitere Einblicke in diesen spezifischen Aspekt des Protokolls erhalten^17,18. Die Hauptvorteile dieses mini-Tn7-chromosomalen Genkomplementationssystems im Vergleich zu einem plasmidbasierten Komplementationssystem sind die Fähigkeit, das Expressionsniveau des komplementären Gens durch das IPTG-kontrollierbare lacI-q-Repressorsystem zu regulieren, und die Möglichkeit, den Gentamicin-Marker (aacC1-Gen) über die flankierenden FRT-Standorte. Es wurde beobachtet, dass die Toleranz der Zellen gegenüber der Expression von Effluxpumpen je nach eingesetzter Pumpe variieren kann. Zum Beispiel reagieren Zellen empfindlicher auf die Expression von AdeIJK im Vergleich zu AdeABC oder AdeFGH; dies kann durch eine Änderung der IPTG-Konzentration unter Kulturbedingungen behoben werden. Die Entfernung des Antibiotikamarkers reduziert das Mutationsrisiko für den Stamm aufgrund des ständigen Selektionsdrucks und ermöglicht auch uneingeschränkte Untersuchungen der Antibiotikaempfindlichkeit³.

Dieses Mini-Tn7-System wurde erfolgreich bei Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ und Acinetobacter ^5,6,21,22 Arten eingesetzt, es gibt jedoch einige Einschränkungen. Zum Beispiel gibt es in A. baumannii nur eine funktionelle attTn7-Insertionsstelle im Genom⁵, so dass ein Stamm mit mehreren Deletionen erzeugt werden kann, aber immer nur ein Gen gleichzeitig ergänzt werden kann. Außerdem hat sich dieses System noch nicht als wirksam für grampositive Bakterien^{erwiesen 10}.

RND-Effluxpumpen sind wichtige Vermittler von Antibiotikaresistenzen bei A. baumannii. Was sie so leistungsfähig macht, ist ihre dreiteilige Struktur, die sich über die innere und äußere Membran erstreckt und die Entfernung von Antibiotika aus dem Periplasma nach außen ermöglicht. Es wurde gezeigt, dass die am besten untersuchten und allgegenwärtigen RND-Pumpen mit den Bezeichnungen AdeABC, AdeFGH und AdeIJK Antibiotika aus allen Klassen eliminieren. Die detaillierte Aufklärung der Effluxpumpenfunktion bietet einen guten Ausgangspunkt für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Optionen gegen multiresistente Stämme. Die Verwendung des AB258-Dreifach-RND-Pumpendeletionsstamms und die Ergänzung einer Pumpe nach der anderen ermöglicht die Untersuchung jeder Pumpe unabhängig von den anderen, wobei für jede Pumpe ihre einzigartigen Substratprofile und wirksamsten Inhibitoren ermittelt werden. Natürlich spielen Effluxpumpen auch eine "tägliche" Rolle für die normale Funktion des Bakteriums. Das Verständnis dieser Rollen könnte zu einer indirekten Lähmung der Pumpen führen, was wiederum den Antibiotika-Efflux unterbrechen und multiresistente Bakterien möglicherweise wieder anfällig für häufig verwendete Antibiotika machen würde. Im Allgemeinen kann das Mini-Tn7-System verwendet werden, um jedes Gen von Interesse für detaillierte Studien oder hilfreiche Marker einzuführen, z. B. fluoreszierende Proteine für die mikroskopische Bildgebung⁶.

Die zunehmende Prävalenz multiresistenter Bakterien ist ein Problem für uns alle. Das Verständnis der Schutzmechanismen, die Effluxpumpen bei Krankheitserregern wie A. baumannii bieten, ist entscheidend für die Bekämpfung schwerer Infektionen. Dieses chromosomale Einzelkopie-Genexpressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für mechanistische Studien sowie für die Identifizierung von Inhibitoren, die die Funktion der Effluxpumpe vereiteln.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 mL PCR-Röhrchen	VWR	20170-012	Für Kolonie-Kochpräparate und PCR-Reaktionen
1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen	Sarstedt	72-690-301
13-ml-Kulturröhrchen	Fisher	14-957K	Flüssigkulturgefäße
6x DNA-Ladepuffer	Froggabio	LD010	Agarose-Gelelektrophorese Probenbeladungsfarbstoff
Essigsäure Säure, Gletscher	Fisher	351271-212	Agarose-Gel-Laufpufferkomponente
Agar	Bioshop	AGR003	Feste Wachstumsmedien
Agarose	BioBasic	D0012	Elektrophoretische Trennung von PCR-Reaktionsprodukten; verwendet in einer Konzentration von 0,8– 2%
Agarose-Gelelektrophoreseeinheit	Fisher	29-237-54	Agarose-Gelelektrophorese; Trennung von PCR-Reaktionsprodukten
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selektive Medien
Verschlüsse von Kulturröhrchen	Fisher	13-684-138	Edelstahlverschluss für 13-ml-Kulturröhrchen
Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) Set	Biobasic	DD0058	PCR-Reaktionskomponente; Lieferung als je 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; gemischt und verdünnt für je 10 mM dNTP
Trockenbad/Blockheizer	Fisher	88860023	Isotemp digitales Trockenbad für Kochzubereitungen
Elektroporationsküvetten	VWR	89047-208	mm Elektroporationsküvetten mit runder
Kappe Elektroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz Elektroporator
Ethidiumbromid	Fisher	BP102-1	Visualisierung von PCR-Reaktionsprodukten und DNA-Markern in Agarose-Gel
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose-Gel-Laufpufferkomponente
Gentamicin	Biobasic	GB0217	Zur Herstellung von selektiven
Medien Glycerin	Fisher	G33	Aufbereitung von Bakterienbrühen für die Langzeitlagerung in einem Ultratiefkühl-Inkubator
(Schütteln)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Inkubatorschüttler für das Wachstum von Flüssigkulturen
Inkubator (statisch)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Inkubator Ofen Modell 550D für das Wachstum von festen (LB-Agar) Kulturen
Impfschlaufe	Sarstedt	86.1562.050	Streifen von Kolonien auf Agarplatten
Impfstreuer	Sarstedt	86.1569.005	Streuen von Kultur auf Agarplatten
Lysogeny-Bouillon (LB)-Brühe, Lennox	Fisher	BP1427	Flüssige Wachstumsmedien (20 g/L: 5 g/L Natriumchlorid, 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 zur Zentrifugation von Proben
Mini-Zentrifuge	Fisher	S67601B	Zentrifugation von 0,2 mL PCR-Röhrchen
Petrischalen	SPL Life Sciences	10090	Für feste Wachstumsmedien (Agarplatten): 90 x 15 mm
Pipetten	Mandel	Various	Gilson Einkanalpipetten (P10, P20, P200, P1000)
Stromversorgung	Biorad	1645050	PowerPac Basis-Stromversorgung für die Elektrophorese
IDT	NA		; spezifisch für das gewünschte Gen; hergestellt bei 100 μμ; M wie auf dem Produktdatenblatt angegeben
Saccharose	BioBasic	SB0498	Zur Herstellung von gegenselektiven Medien zur Entfernung des Plasmids pFLP2ab aus transformierter A. baumannii
Taq-DNA-Polymerase	FroggaBio	T-500	PCR-Reaktionskomponente; Polymerase mit einem 10-fach-Puffer geliefert
Thermocycler	Biorad	1861096	Modell T100 für die PCR
Zahnstocher	Fisher	S24559	Zum Patchen von Kolonien auf Agarplatten
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose Gel Laufpufferkomponente
Reinstwasser	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ Wasseraufbereitungssystem: Reinstwasser für die Medien- und Lösungsvorbereitung und Zellwäsche
Breitbereichs-DNA-Marker	Biobasic	M103R-2	Größenbestimmung von PCR-Produkten auf einem Agarose-Gel
Impfstäbchen aus Holz	Fisher	29-801-02	Inokulieren von Kulturen mit Kolonien aus Agarplatten