Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Summary

Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.

Abstract

Die durch braunes Fettgewebe (BAT) vermittelte Thermogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, und ihre Morphologie und Funktion kann durch Umweltreize bei Mäusen und Menschen stark beeinflusst werden. Derzeit ist das murine interscapulare BAT (iBAT), das sich zwischen zwei Schulterblättern in der oberen Rückenflanke von Mäusen befindet, das wichtigste BAT-Depot, das von Forschungslabors zur Untersuchung der BAT-Funktion verwendet wird. Kürzlich wurden einige bisher unbekannte BAT-Depots bei Mäusen identifiziert, darunter eines, das dem menschlichen supraklavikulären braunen Fettgewebe entspricht. Im Gegensatz zu iBAT befindet sich das murine supraklavikuläre braune Fettgewebe (scBAT) in der Zwischenschicht des Halses und ist daher nicht so leicht zugänglich.

Um die Untersuchung neu identifizierter Maus-scBAT zu erleichtern, wird hierin ein Protokoll vorgestellt, das die Schritte zur Sezierung von intaktem scBAT von postnatalen und adulten Mäusen detailliert beschreibt. Aufgrund der geringen Größe von scBAT im Vergleich zu anderen Fettdepots wurden die Verfahren speziell für die Verarbeitung von scBAT modifiziert und optimiert. Zu diesen Modifikationen gehört der Einsatz eines Präpariermikroskops während der Gewebeentnahme, um die Präzision und Homogenisierung von gefrorenen scBAT-Proben zu erhöhen, um die Effizienz der nachfolgenden qPCR-Analyse zu erhöhen. Mit diesen Optimierungen können die Identifizierung, das morphologische Auftreten und die molekulare Charakterisierung des scBAT in Mäusen bestimmt werden.

Introduction

Die zunehmende Prävalenz von Fettleibigkeit in den USA und weltweit hat ein großes Interesse am Verständnis ihrer Ätiologie und an der Identifizierung potenzieller Behandlungen geweckt ^1,2. Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, und eine Fehlregulation des Fettgewebes kann zur Entwicklung von Fettleibigkeit führen. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Fettgewebe, weißes und braunes Fettgewebe. Während weißes Fettgewebe (WAT) chemische Energie speichern und endokrine Faktoren absondern kann, kann braunes Fettgewebe (BAT) chemische Energie nutzen, um Wärme zu erzeugen und die Körpertemperatur in der Kälte aufrechtzuerhalten ^3,4. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeit kann die Aktivierung von BAT auch den Energieverbrauch erhöhen und die Insulinsensitivität verbessern⁵.

BAT übt seine Funktion durch nicht zitternde Thermogenese aus, ein Prozess, der durch die Entkopplung des Proteins 1 (UCP1)⁶ vermittelt wird. Säugetiere, einschließlich Mäuse und Menschen, besitzen unterschiedliche Mengen an BAT. Die klassische Ansicht von BAT ist, dass diese Fettgewebe bei Mäusen und Säuglingen häufiger vorkommen als bei erwachsenen Menschen. iBAT, das sich in der oberen dorsalen Flanke zwischen den Schulterblättern befindet, ist das am besten untersuchte BAT-Depot bei Mäusen. Durch die Anwendung von Radioisotopenbildgebung und Biopsietests identifizierten neuere Studien mehrere BAT-Depots bei erwachsenen Menschen. Einige von ihnen, einschließlich der Depots im tiefen Hals und im supraklavikulären Bereich, waren zuvor nicht bei Mäusen oder anderen Modelltieren identifiziert worden 7,8,9,10,11. Unter diesen BAT-Depots ist das scBAT das am häufigsten gesehene Depot bei erwachsenen Menschen. Um den Ursprung und den molekularen Beitrag dieser neu entdeckten BAT-Depots beim Menschen besser zu verstehen, ist es wichtig, äquivalente Depots in Mäusen zu identifizieren, die genetische und molekulare Manipulationen ermöglichen, um die funktionelle Rolle dieser Depots zu verfolgen und zu testen. Daher identifizierten wir und andere einige bisher unbekannte BAT-Depots an verschiedenen anatomischen Stellen bei Mäusen, darunter scBAT^12,13, thorakale perivaskuläre BAT^14,15, perirenale BAT¹⁶ und periaortale BAT¹⁷. Maus-scBAT ähnelt anatomisch dem menschlichen scBAT und ähnelt morphologisch dem klassischen iBAT, wobei es hohe Konzentrationen von UCP1¹² exprimiert.

Im Gegensatz zu Maus-iBAT, das leicht präpariert werden kann, befindet sich scBAT in der Zwischenschicht des Maushalses, unter den Speicheldrüsen und entlang der äußeren Halsvene. Die Isolierung dieses Depots für histologische und molekulare Analysen kann eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir detailliert das Verfahren zur Dissektion von scBAT aus postnatalen und adulten Mäusen und zur Verarbeitung dieses Depots für die Histologie und Genexpressionsanalyse.

Protocol

Die Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Baylor College of Medicine genehmigt. Alle Verfahren wurden an männlichen C57BL/6J-Mäusen im Alter von 3 Wochen und 3 Monaten durchgeführt. Vor der Sektion wurden alle Mäuse mit dem zugelassenen Kohlendioxid-Euthanasieverfahren von Nagetieren eingeschläfert. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Zerlegung von scBAT

1. Legen Sie den Mäusekadaver auf die Werkbank und reinigen Sie die chirurgische Schere und die superfeine Pinzette mit 70% Ethanol.
2. Besprühen Sie den Bauchhals der Maus mit 70% Ethanol, um das Fell zu befeuchten und die Fellkontamination zu minimieren.
3. Machen Sie einen beidseitigen Schnitt, ca. 1,5 cm, entlang der Schlüsselbeine.
4. Von den Enden des vorherigen Schnitts in Längsrichtung zu den Ohren schneiden, ca. 1 cm lang. Dadurch entsteht ein quadratischer U-förmiger Schnitt um den Hals (Abbildung 1A,B).
   HINWEIS: scBAT liegt in der Zwischenschicht des Halses. Die oberflächliche Schicht, bestehend aus Haut, subkutanem Fettgewebe und Speicheldrüsen, wird bei diesem Schritt freigelegt. Die Zwischenschicht enthält zusammen mit scBAT die Halsvenen und die Nackenmuskulatur. Die tiefe Schicht des Halses, die tiefe Hals-BAT sowie Arterien- und Halsvenen enthält, wird durch Entfernen des Skelettmuskels freigelegt.
5. Legen Sie die Maus unter ein Präpariermikroskop und stellen Sie den freiliegenden Hals scharf (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Dieser zusätzliche Schritt erhöht die Präzision der Gewebeentnahme, die angesichts der geringen Größe von scBAT erforderlich ist, erheblich.
6. Legen Sie die Speicheldrüsen vollständig frei, indem Sie die eingeschnittenen Hautpartien mit einer Pinzette wegheben.
7. Trennen Sie mit einer chirurgischen Schere und Pinzette das Gewebe, das die Speicheldrüsen mit dem Gewebe um die Schlüsselbeine und miteinander verbindet.
8. Legen Sie die scBAT-Depots frei, indem Sie die Speicheldrüsen anheben. Suchen Sie nach der BAT entlang der äußeren Halsvene und möglicherweise verbunden mit der Unterseite der Speicheldrüsen. Identifizieren Sie es an seiner orangefarbenen Farbe, die sich vom umgebenden Gewebe abhebt.
9. Halten Sie das Zielfettgewebe mit einer Pinzette fest und ziehen Sie es vorsichtig von den Speicheldrüsen ab.
10. Nach dem Lösen von den Speicheldrüsen wird das scBAT weiter von der äußeren Halsvene und der Halsmuskulatur getrennt, bis die Depots auf beiden Seiten des Halses vollständig entfernt werden können.
11. Untersuchen Sie jede präparierte scBAT-Probe unter dem Präpariermikroskop (Abbildung 1D, E) und entfernen Sie mit einer Pinzette das restliche Bindegewebe.
12. Geben Sie jede Probe in ein Glasszintillationsfläschchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entfernen Sie die Maus unter dem Mikroskop.

2. Verarbeitung und Hämatoxylin und Eosin (H&E)-Färbung von scBAT (dargestellt in Abbildung 2A)

1. Ersetzen Sie das PBS (Schritt 1.12) durch 10 ml kaltes 4%iges Paraformaldehyd (PFA) und stellen Sie die Durchstechflasche auf einen Nutator, der über Nacht bei 4 °C geschaukelt wird, um den scBAT zu fixieren.
   HINWEIS: Die Perfusionsfixierung kann bei postnatalen, insbesondere erwachsenen Mäusen, angewendet werden, wenn eine weitere Verarbeitung für die immunhistochemische Analyse erforderlich ist.
2. Entfernen Sie am nächsten Tag die PFA-Lösung mit einer sterilen Transferpipette aus der Durchstechflasche und ersetzen Sie sie durch 10-15 ml PBS. Stellen Sie die Durchstechflasche auf einen Nussator und wiegen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie PBS durch 0,85% ige Kochsalzlösung und schaukeln Sie weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur weiter.
   HINWEIS: Die Kochsalzlösung besteht aus 0,85 % Kochsalzlösung (NaCl) w/v in DEPC-behandeltem Wasser (RNase-frei). PBS kann in diesem und dem folgenden Schritt durch die Kochsalzlösung ersetzt werden.
3. Entfernen Sie die 0,85%ige Kochsalzlösung mit einer Transferpipette und geben Sie 10 ml 70%ige Ethanol/0,85%ige Kochsalzlösung in die Durchstechflasche. Lagern Sie die Durchstechflasche über Nacht oder bis zum Einbetten von Paraffin im Kühlschrank bei 4 °C.
   HINWEIS: PBS kann verwendet werden, wenn 0,85% Kochsalzlösung nicht verfügbar ist. scBAT sollte so schnell wie möglich verarbeitet werden, um die Schnitte zu erleichtern und die Gewebemorphologie besser zu erhalten.
4. Dehydrieren Sie scBAT vor der Paraffineinbettung durch eine Reihe von Ethanolaustausch, um Wasser aus dem Gewebe zu entfernen.
   1. Entfernen Sie zunächst 70 % Ethanol/0,85 % Kochsalzlösung mit einer Transferpipette aus der Durchstechflasche und fügen Sie 10-15 ml 95 % Dehydrierungsalkohol hinzu, wobei Sie die Durchstechflasche 1 h lang bei Raumtemperatur auf einem Nährstoffator wiegen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
      Anmerkungen: Ethanol kann anstelle von Dehydrantenalkohollösungen verwendet werden.
   2. Ersetzen Sie als Nächstes 95% Dehydrantenalkohol durch 10-15 ml 100% Dehydrantenalkohol und schaukeln Sie 1 Stunde lang auf einem Nutator weiter. Füllen Sie den neuen 100%igen Dehydrantenalkohol nach und schaukeln Sie je nach Menge scBAT in der Durchstechflasche mehrere Stunden oder über Nacht weiter.
5. Um scBAT für die Einbettung freizugeben, geben Sie 10 ml Toluol in die Durchstechflasche und schaukeln Sie weiter auf einem Nutator, bis scBAT transparent ist, ca. 6-8 h.
   HINWEIS: Die Zeitdauer, die erforderlich ist, um eine zufriedenstellende Klärung zu erreichen, hängt von der Größe des scBVT ab. Es wird empfohlen, morgens sofort mit der Räumung zu beginnen, damit die Versickerung und Einbettung am Nachmittag erfolgen kann.
6. Um scBAT in Paraffinwachs einzubetten, entfernen Sie Toluol und geben Sie 10 ml geschmolzenes Infiltrationsparaffinwachs in die Durchstechflasche. Die Durchstechflasche für 1 h bei 65 °C in den Ofen stellen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit neuem Wachs.
   HINWEIS: Beginnen Sie mit dem Schmelzen der Wachspellets über Nacht in einem Ofen, bevor Sie mit dem Einbetten beginnen, um sicherzustellen, dass das Wachs vollständig flüssig ist.
7. Ersetzen Sie das Infiltrationsparaffinwachs durch das Einbetten von Paraffinwachs und stellen Sie die Durchstechflasche 1 h lang auf die gleiche Temperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
   HINWEIS: Die Infiltrationsphase kann unterbrochen und später fortgesetzt werden. Nehmen Sie die Durchstechflasche aus dem Ofen und lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis Sie fortfahren können.
8. Betten Sie das Gewebe ein, indem Sie es zuerst in eine Gewebeeinbettungsform legen, geschmolzenes Einbettwachs in die Form geben und das Gewebe unter einem Stereomikroskop neu ausrichten. Legen Sie dann eine Einbettkassette auf das Wachs und gießen Sie weiter Einbettwachs darüber, bis es voll ist und die Einbettkappe am Wachsblock befestigt ist. Stellen Sie den Block über Nacht in einen 4 °C-Kühlschrank, damit das Wachs steif wird und schrumpft, bevor Sie die Metallform entfernen.
9. Schneiden Sie die scBAT mit einem Mikrotom auf eine Dicke von 5-6^{μm 18}, drei bis vier Schnitte pro Objektträger, und legen Sie sie in ein warmes Paraffinschnitt-Flotationsbad bei ~42 °C, damit sich die Gewebeschnitte glätten können.
10. Übertragen Sie die Abschnitte auf Objektträger und legen Sie die Objektträger aufrecht gegen das Schwimmbad, damit Wasser von den Objektträgern abtropfen kann.
11. Übertragen Sie die Objektträger in ein rostfreies Färbegestell und stellen Sie das Gestell zum Trocknen über Nacht auf eine Objektträger-Trockenbank.
    HINWEIS: Die Paraffin-Objektträger können vor der Weiterverarbeitung langfristig bei Raumtemperatur gelagert werden.
12. Führen Sie die H&E-Färbung^{durch 19}. Legen Sie zunächst die Objektträger in ein Färbegestell und stellen Sie das Gestell dann für 40 s in ein Färbegefäß mit Xylol. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
    HINWEIS: Wenn Paraffin nach den beiden Phasen immer noch sichtbar ist, warten Sie, bis es sich vollständig aufgelöst hat, bevor Sie fortfahren.
13. Um das Gewebe zu rehydrieren, legen Sie den Objektträger für zwei 20-s-Stufen in ein mit 100 % Dehydrierungsalkohol gefülltes Färbegefäß, gefolgt von einer 15-s-Stufe in 95 % Dehydrierungsalkohol und einer abschließenden 15-s-Spülung in ddH₂O.
14. Die Objektträger werden 75 s lang in eine mit Hämatoxylinlösung gefüllte Färbeschale gelegt, um eine Kernfärbung zu erreichen, und dann die Objektträger in einer Färbeschale mit ddH₂O 45 s lang gespült.
    HINWEIS: Die Zeit kann je nach gewünschter Fleckfarbe angepasst werden.
15. Differenzieren Sie die Färbung, indem Sie die Objektträger 15 s lang in eine mit HCl-Ethanol-Lösung gefüllte Färbeschale tauchen und dann die Objektträger 15 s lang in eine andere ddH₂O-Spülung geben.
    HINWEIS: Die HCl-Ethanol-Lösung wird nach einer veröffentlichten Methode¹⁹ hergestellt.
16. Für die zytoplasmatische Färbung legen Sie den Objektträger für 15 s in eine Eosin-Y-Gegenfärbelösung.
17. Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger jeweils 15 s lang in drei aufeinanderfolgende 95%ige Dehydrantenalkohol-Lösungsstufen tauchen, dann zwei aufeinanderfolgende 100%ige Dehydrantenalkoholbäder - das erste für 15 s und das zweite für 45 s - um die Dehydrierung abzuschließen.
18. Übertragen Sie die Objektträger schließlich für 45 s in ein Xylolbad, um das Gewebe wieder an organische Lösungsmittel zu gewöhnen. Nach diesem Schritt ist die Färbung abgeschlossen; Entfernen Sie das Gewebe aus der Lösung.
19. Tragen Sie Montagemedium auf jedes Objektträger auf und decken Sie es in einem chemischen Abzug ab. Vor der Bildgebung über Nacht trocknen. Die Bildergebnisse sind in Abbildung 2B dargestellt.

3. Genexpressionsanalyse von scBAT

1. Gewebeentnahme (Schleifen)
   1. Geben Sie das Gewebe nach dem Präparieren von scBAT sofort in ein Mikrozentrifugenröhrchen, stechen Sie mit einer sterilen Nadel ein Loch in die Oberseite des Röhrchens und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.
      HINWEIS: Die wichtigsten Schritte des hier beschriebenen Protokolls sind in Abbildung 3A dargestellt. Das Stechen eines Lochs in die Oberseite des Rohrs, bevor es in flüssigen Stickstoff fällt, verhindert, dass das Rohr aufgrund der plötzlichen Druckänderung platzt.
   2. Füllen Sie einen Plastikbecher mit flüssigem Stickstoff und lassen Sie einen Stößel und einen dünnen Spatel einweichen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Temperatur aller Werkzeuge und Gewebeproben während des gesamten Vorgangs so kalt wie möglich zu halten, nahe der Temperatur von flüssigem Stickstoff, um ein Auftauen des Gewebes zu verhindern. Aufgetautes Fettgewebe haftet sehr stark und macht das Pudern schwieriger. Werkzeuge und Proben erst unmittelbar vor Gebrauch aus Flüssigstickstoffbädern entfernen.
   3. Nehmen Sie jeweils eine schockgefrorene Gewebeprobe und gießen Sie sie aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in den Mörser.
   4. Geben Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff in den Mörser und mahlen Sie dann mit dem Stößel das gefrorene Gewebe, bis es vollständig pulverisiert ist.
      HINWEIS: Wenn das Gewebe an irgendeiner Stelle weich oder klebrig wird, taut es auf; Gießen Sie mehr flüssigen Stickstoff in den Mörtel.
   5. Verwenden Sie den dünnen Spatel, um das pulverisierte Gewebe vorsichtig abzukratzen und zurück in das Mikrozentrifugenröhrchen zu geben. Gießen Sie flüssigen Stickstoff während des Schabens in den Mörtel, um übrig gebliebene Gewebereste zu sammeln, bevor Sie sie mit einem Spatel übertragen. Wiederholen Sie die Transferschritte, bis das gesamte Gewebe aus dem Mörtel entfernt ist.
   6. Reinigen Sie den Mörser mit einem leichten Gewebewischer und 70% Ethanol, bevor Sie die nächste Probe zum Mahlen entsorgen. Lagern Sie das pulverisierte Tuch langfristig in einem -80 °C Gefrierschrank.
2. Vollständige RNA-Isolierung
   1. Präparat
      1. Reinigen Sie die Werkbank, Pipetten, Spitzenhalter und Röhrchengestelle mit 70 % Ethanol und Oberflächendekontaminationsmittel, um RNase zu entfernen.
      2. Lassen Sie die Zentrifugenmaschine auf 4 °C laufen.
      3. Erwärmen Sie die Elutionslösung auf 70 °C.
      4. Verdünnen Sie die DNase I durch Mischen von 5 μl rekonstituierter DNase I mit 75 μl DNase-Verdünnungslösung pro Probe. Legen Sie die DNase I-Lösung bis zur Verwendung auf Eis.
   2. Verfahren
      1. Beschriften Sie für jede Probe zwei Mikrozentrifugenröhrchen, zwei Säulenhalteröhrchen (zwei kappenlose graduierte Mikrozentrifugenröhrchen) und eine Bindungsminisäule.
      2. Geben Sie 500 μl RNA-Isolierlösung zu jeder Probe und beschallen Sie sie 30 s lang mit einem Pelletstößelmotor.
      3. Besorgen Sie sich für jede Probe eine Spritze und pipettieren Sie 10x auf und ab, um das Gewebe weiter zu lysieren. Stellen Sie sicher, dass nach dem Spritzen keine Feststoffe sichtbar sind.
      4. Fügen Sie 250 μl Chloroform hinzu und wirbeln Sie gelegentlich vor, während Sie 5 Minuten warten, bis die Proben bei Raumtemperatur inkubiert sind.
      5. Bei 21.000 × g 20 min bei 4 °C zentrifugieren.
      6. Übertragen Sie den oberen wässrigen Teil in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie eine äquivalente Menge von 70% Ethanol (~500 μl) hinzu.
         HINWEIS: Der obere wässrige Teil sollte klar sein, der untere sollte die rote RNA-Isolierlösung sein, und zwischen den beiden Schichten sollten sich einige unerwünschte Feststoffe befinden.
      7. 500 μl des neuen Lysats in die Bindungssäule überführen. Bei 18.000 × g 60 s zentrifugieren und dann das Filtrat verwerfen.
      8. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit dem verbleibenden Lysat, um die gesamte RNA in die Bindungssäule zu bekommen.
      9. 700 μl Wash mit geringer Stringenz in die Bindesäule geben, 30 s zentrifugieren und das Filtrat verwerfen.
      10. Geben Sie 80 μl verdünnte DNase I in jede Bindungssäule. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
      11. Fügen Sie 700 μl hochstringendes Waschen hinzu, zentrifugieren Sie 30 s lang und entsorgen Sie das Filtrat.
      12. 700 μl Wäsche mit geringer Stringenz hinzufügen, 60 s zentrifugieren und das Filtrat verwerfen.
      13. Bewegen Sie die Bindesäulen in das 2^. neue kappenlose Halterohr und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang, um sicherzustellen, dass alle Flüssigkeiten aus der Bindesäule entfernt werden.
      14. Bringen Sie die Bindungssäulen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 30 μl erwärmte Elutionslösung hinzu. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren.
      15. Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang, um die eluierte RNA am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln.
      16. Messen Sie die Gesamt-RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
          HINWEIS: Wenn die Gesamtreinheit der RNA niedrig ist, was durch einen Wert von 260/280 unter 2,0 oder einen Wert von 260/230 unter 1,8 angezeigt wird, können die Proben nach Schritt 3.2.2.12 erneut mit einer Wäsche mit geringer Stringenz gewaschen werden, gefolgt von einem Waschen mit 80 % Ethanol, bevor mit Schritt 3.2.2.13 fortgefahren wird.
      17. Lagern Sie die RNA in einem -80 °C Gefrierschrank.
   3. Reverse Transkription (RT)
      1. Geben Sie in einem PCR-Röhrchenstreifen 0,5-1 μg Gesamt-RNA, die in DEPC-behandeltem Wasser verdünnt ist, zu insgesamt 8 μl für jede RNA-Probe in eine andere Vertiefung.
         HINWEIS: Die für die reverse Transkription verwendete RNA-Menge kann gemäß den Anweisungen des Herstellers nach oben oder unten skaliert werden.
      2. Geben Sie 1 μl Oligo dT und 1 μl dNTPs zu jeder Probe im PCR-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 10 μl pro Probe beträgt.
      3. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in einen Thermocycler und stellen Sie ihn für 5 Minuten auf 65 °C und anschließend auf unbestimmte Zeit auf 4 °C ein.
      4. Nehmen Sie nach 5 min bei 65 °C den PCR-Röhrchenstreifen heraus und legen Sie das Röhrchen für mindestens 2 min auf Eis. Nach der Inkubation auf Eis werden fünf Reagenzien hinzugefügt: 4 μl 5x Erststrangpuffer, 2 μl 25 mM MgCl₂, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl reverse Transkriptase zu jeder Probe. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen jetzt 20 μl pro Probe beträgt.
      5. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen wieder in den Thermocycler und stellen Sie das Programm auf 50 °C für 50 min, dann 85 °C für 5 min und dann 4 °C auf unbestimmte Zeit ein.
      6. Sobald das Programm 4 °C erreicht hat, nehmen Sie den Streifen heraus und fügen Sie 1 μl Ribonuklease H (RNase H) hinzu.
         HINWEIS: RNase H wird verwendet, um alle verbleibenden RNA-Templates in der RT-Reaktion zu entfernen; durch diesen Schritt sollte die gewünschte RNA bereits in cDNA umgewandelt werden.
      7. Legen Sie den Streifen wieder in den Thermocycler und lassen Sie ihn 20 Minuten lang bei 37 °C und dann auf unbestimmte Zeit bei 4 °C laufen.
      8. Die reverse Transkription ist abgeschlossen; cDNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer messen.
      9. Verdünnen Sie die cDNA auf 250 ng/μl; Lagern Sie die cDNA entweder in einem -80 °C- oder -20 °C-Gefrierschrank.
   4. Quantitative PCR (qPCR)
      1. Erstellen Sie eine Tabelle, um die Position jedes Primers und jeder Probe auf der 96-Well-qPCR-Platte zu organisieren.
         HINWEIS: Einer der Primer muss ein Referenzgen sein, um die Expression aller anderen interessierenden Gene, wie z. B. 36B4, zu normalisieren.
      2. Erstellen Sie einen Primer-Mastermix für jede Kombination aus "Primer + Probe". Fügen Sie zu jeder qPCR-Reaktionsvertiefung 3 μl Wasser in molekularbiologischer Qualität, 5 μl qPCR-Enzym-Mastermischung, 0,5 μl Vorwärtsprimer und 0,5 μl Rückwärtsprimer hinzu, was sich auf 9 μl pro Reaktion summiert. Fügen Sie 1 μl cDNA pro Reaktion hinzu, um insgesamt 10 μl pro Reaktionsvertiefung zu erhalten.
         HINWEIS: Der Standard sieht vor, drei technische Replikate für jede Kombination aus "Primer + Probe" zu haben, daher sollte jeder Mastermix das 4-fache der oben genannten Mengen enthalten.
      3. Fügen Sie 1 μl cDNA für jedes Replikat zu jedem Primer-Mastermix hinzu. Wenn jeder Mastermix 4x ist, pipettieren Sie 4 μl jeder Proben-cDNA in ein eigenes markiertes Röhrchen.
      4. Pipettieren Sie schließlich 10 μl jedes Reaktionsgemisches in die 96-Well-qPCR-Platte an den in der Tabelle festgelegten Positionen.
      5. Verschließen Sie die Platte mit einer dicken Klebedichtung und zentrifugieren Sie dann die 96-Well-Platte bei 450 × g bei 20 °C für 2 Minuten.
         HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Platte vollständig versiegelt ist, um zu verhindern, dass Proben während des Thermocyclings verdampfen. Verwenden Sie leichte Gewebewischer, um die Dichtung auf die Platte zu drücken, insbesondere auf die Kanten.
      6. Führen Sie die Platte in einem Echtzeit-PCR-Gerät aus. Programmieren Sie die PCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers: 2 min bei 50 °C, gefolgt von weiteren 2 min bei 95 °C und schließlich 40 Zyklen von 15 s bei 95 °C und 30 s bei 60 °C. Die Ergebnisse der qPCR-Genexpressionsanalyse sind in Abbildung 3B dargestellt.

Results

Im Gegensatz zu iBAT, das sich in der subkutanen Schicht des Rückens zwischen zwei Schulterblättern befindet, befindet sich scBAT in der Zwischenschicht des Halses und erstreckt sich tief zwischen den Schichten der Skelettmuskulatur und der Speicheldrüse, während es entlang der äußeren Halsvene wächst (Abbildung 1A). Das Sezieren von scBAT ist nicht so einfach wie iBAT. Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren mit entscheidenden Schritten zur Dissektion von intaktem scBAT von postnatalen und adulten Mäusen vor (Abbildung 1B,C). Nach dem Öffnen des Halses mit dem mitgelieferten Protokoll kann eine dünne Schicht scBAT unter einem Präpariermikroskop identifiziert und mit einer Pinzette von der angeschlossenen Speicheldrüse und der Vena jugularis externa abgezogen werden (Abbildung 1D,E). Um die Morphologie des Depots zu beurteilen, wurde frisch isoliertes scBAT unter Verwendung des bereitgestellten Verarbeitungsverfahrens in Kombination mit einem zuvor veröffentlichten H&E-Färbeverfahren¹⁹ verarbeitet (Abbildung 2A). Wie in Abbildung 2B gezeigt, besitzt scBAT Gewebestrukturen, die für BAT-Depots typisch sind, und besteht aus vielen kleinen, multilokulären Adipozyten in gesunden postnatalen und adulten Mäusen. Um die Genexpressionsniveaus in scBAT zu bestimmen, wurde RNA aus isolierten scBAT-Depots mit den bereitgestellten Verfahren extrahiert (Abbildung 3A). Die Expressionsniveaus von Genen von Interesse können dann mit Standard-RT-qPCR-Methoden bewertet werden (Abbildung 3A). Wie in Abbildung 3B gezeigt, die unterschiedlichen Expressionsniveaus von Genen, die an der Vermittlung der scBAT-Funktion beteiligt sind, einschließlich Pparg, dem Hauptregulator der BAT-Entwicklung; Fabp4 und Glut4, zwei Nährstofftransporter; und Ucp1 und Ppargc1a, zwei Gene, die an der Thermogenese beteiligt sind, können leicht bestimmt werden. Zum Vergleich wurde RNA aus isoliertem iBAT extrahiert und die Expression der oben aufgeführten Gene ebenfalls mit den bereitgestellten Verfahren bewertet (Abbildung 3A). Die Expressionsniveaus dieser Gene sind zwischen diesen beiden Depots relativ ähnlich. (Abbildung 3B).

Abbildung 1: Anatomische Lage von scBAT und Prozess seiner Dissektion. (A) Lage von scBAT in der Zwischenschicht des Halses. (B) Die oberflächliche Schicht des Halses vor und nach der Hautentfernung. Maßstabsleiste = 250 μm. Gepunktete gelbe Linien umreißen den Bereich, der nach dem U-förmigen Schnitt freigelegt werden sollte. (C) Bild eines Mauskadavers, der unter einem Präpariermikroskop platziert wurde, um die visuelle Klarheit während der Sektion zu erhöhen. (D,E) Repräsentative Bilder der Zwischenschicht des Halses vor und nach der scBAT-Entnahme von Mäusen im Alter von 3 Wochen und 3 Monaten. Maßstabsleiste = 250 μm. Gepunktete gelbe Linien umreißen exponierte bilaterale scBAT-Depots; n = 2. Abkürzungen: scBAT = supraklavikuläres braunes Fettgewebe; SFI = oberflächliche Schicht; sg = Speicheldrüse; tr = Luftröhre; JV = Vena jugularis externa; SM = Skelettmuskel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Verarbeitung von scBAT für die H&E-Färbung. (A) Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte der scBAT-Verarbeitung für die H&E-Färbung veranschaulicht. Nach dem Präparieren des Gewebes wird es nacheinander fixiert, dehydriert, eingebettet, geschnitten und gefärbt. (B) Repräsentative Bilder von H&E-gefärbten scBAT von Mäusen im Alter von 3 Wochen und 3 Monaten; n = 3 für jedes Entwicklungsstadium; Maßstabsleiste = 250 μm für Bilder mit geringerer Vergrößerung; Maßstabsleiste = 50 μm für Bilder mit höherer Vergrößerung. Abkürzungen: scBAT = supraklavikuläres braunes Fettgewebe; PFA = Paraformaldehyd; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vorbereitung der RNA aus scBAT für die Genexpressionsanalyse. (A) Flussdiagramm, das die Stadien der RNA-Isolierung und der RT-qPCR-Analyse der scBAT-Genexpression veranschaulicht. Aufgrund seiner geringen Größe und weichen Textur ist das Einfrieren des scBAT-Depots und das Mahlen in flüssigem Stickstoff entscheidend für eine erfolgreiche RNA-Isolierung. (B) Relative Expression von Markergenen, einschließlich Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 und Ppargc1a, in scBAT und iBAT, isoliert aus männlichen Mäusen im Alter von 3 Monaten, n = 5. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. 36B4 wurde als Haushaltsgen zur Normalisierung verwendet. Abkürzungen: scBAT = supraklavikuläres braunes Fettgewebe; RT-qPCR = reverse Transkriptions-quantitative PCR; LN₂ = flüssiger Stickstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren zur Dissektion und Verarbeitung von scBAT für H&E- und Genexpressionsanalysen detailliert vor. Da sich scBAT in der Zwischenschicht des Halses befindet und entlang der großen Venen liegt, erfordert die Isolierung dieses Depots eine präzise Technik. Um eine klare Sicht auf das Depot zu erhalten, empfehlen wir, die Maus nach dem Öffnen des Halses unter ein Präpariermikroskop zu legen. Verwenden Sie eine superfeine Pinzette, um scBAT von der Speicheldrüse und den umgebenden Venen abzuziehen, und achten Sie darauf, dass die Venen nicht punktiert werden. Übermäßige Blutungen können die Lokalisierung des scBAT erschweren. Um scBAT für die H&E-Färbung zu verarbeiten, passten wir die Verwendung eines veröffentlichten Protokolls¹⁹ mit leichten Modifikationen an, um die Verwendung von 4 % PFA, Dehydrierungsalkoholen und einem organischen Lösungsmittel, Toluol, für die Gewebeverarbeitung einzubeziehen, wie im Protokollabschnitt gezeigt. Das gesamte Verfahren dauert ~6 Tage, und H&E-gefärbte Objektträger können am nächsten Tag nach Abschluss der Färbung abgebildet werden.

Die RT-qPCR mit RNA als Ausgangsmaterial ist die am häufigsten verwendete Methode zur Genexpressionsanalyse im Bereich der Fettgewebebiologie. Da scBAT im Vergleich zu iBAT ein relativ kleines BAT-Depot ist, kann es schwierig sein, ausreichend RNA für die Genexpression zu erhalten. Um die RNA-Ausbeute zu erhöhen, empfehlen wir, sequentielle Lysatvorbereitungsschritte wie im Protokollabschnitt beschrieben anzuwenden, beginnend mit dem Pulverisieren des Gewebes mit einem Stößel und Mörser im gefrorenen Zustand. Mit dieser Lysat-Präparationsmethode ist es uns gelungen, eine ertragreiche und qualitativ hochwertige RNA-Probe für die Genexpressionsanalyse von scBAT von einer erwachsenen Maus zu erhalten. Diese Lysatherstellungsmethode kann auch angewendet werden, um hochwertige Proteinlysate aus scBAT für Western Blotting unter Verwendung von Proteinlysepuffer zu erhalten.

Mit Hilfe von Maus-iBAT haben Forscher umfangreiche Erkenntnisse über die BAT-Funktion in der Thermogenese und im Stoffwechsel gewonnen. Die jüngste Identifizierung einiger bisher unerkannter BAT-Depots bei Mäusen und Menschen, einschließlich scBAT, zeigte, dass weitere Studien erforderlich sind, bevor wir den physiologischen Beitrag von BAT bei Mäusen und erwachsenen Menschen vollständig verstehen können. Insbesondere sind Studien gerechtfertigt, die die Ursprünge, Funktionen und die Beteiligung dieser neu gefundenen BAT-Depots an der Thermogenese und dem regionalen oder Ganzkörperstoffwechsel beleuchten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95 % Dehydrierungsalkohol (Flex 95)	Epredia	8201
100 % Dehydrierungsalkohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-Well-PCR-Platte	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Basisformen (zum Einbetten)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Nadel 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermocycler	Bio-Rad	1840148
Mikrozentrifugenröhrchen ohne Kappe 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Zentrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Niedrigviskoses Eindeckmedium	Epredia	83104
DEPC-behandeltes Wasser	Ambion	AM 9906
Präpariermikroskop	Nikon
DNase Verdünnungslösung	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elutionslösung	Bio-Rad	7326801
EM 400 Einbettmedium Paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0,5 % w/v)	RICCA	2858-16
Formel R Infiltrationsmedium Paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hämatoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (für HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Einbettkassetten	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (für 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Mikrozentrifugenröhrchen 1,7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Dichtungen (haftende Dichtungen)	Bio-Rad	MSB1001
Mikrotom	Leica Biosystems	RM2245
Molekularbiologie	Grade Water Corning	46-000-CM
Mörser Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (für 0,85 % Kochsalzlösung)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spektralphotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffinsektion Flotationsbad	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Stößel von Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Stößel Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Präzisions-Vakuumofen Modell 19	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Grundierung: 36B4  (vorwärts) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Einführung: 36B4 (Rückseite) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Fibel: Fabp4 (forward) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Fibel: Fabp4 (Rückseite) 10 μ M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Fibel: Glut 4 (umgekehrt) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Einführung: PPARg (forward) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Fibel: PPARg (Reserve) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Einführung: Ppargc1a (Rückseite) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Einführung: Ppargc1a(forward) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Einführung: Ucp1 (forward) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
Einführung: Ucp1 (umgekehrt) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			Chen lab Oligo-Datenbank
RNA-Isolationslösung (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (Oberflächendekontaminationsmittel)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase Inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Szintillationsfläschchen (Glas)	Elektronenmikroskopie Sciences	72632
Objektträger-Trockenbank	Elektrothermisch (Cole-Parmer)	MH6616
Edelstahl-Färbegestell	Elektronenmikroskopie Sciences	70312-54
Stereomikroskop (zum Einbetten)	Olympus	SZ51
Sugical Scissors	McKesson	43-1-104
Superfeine Spitze Präparierzange	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transkriptase (enthält 5x Erststrangpuffer und 0,1 M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET Spritze mit Nadel 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR Enzym Master Mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (Tiegel)	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	Artikelnummer: 62540-01
Toluol	Fisher Chemical	T324-1
Transferpipette	Avantor	414004-005
Xylol	Fisher Chemical	X3P-1GAL