Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

Zusammenfassung

Dendritische Stacheln sind postsynaptische Kompartimente der meisten exzitatorischen Synapsen. Veränderungen der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule treten während der neurologischen Entwicklung, des Alterns, des Lernens und vieler neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen auf, was die Bedeutung einer zuverlässigen dendritischen Wirbelsäulenanalyse unterstreicht. Dieses Protokoll beschreibt die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule mit Hilfe einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware.

Zusammenfassung

Synaptische Verbindungen ermöglichen den Austausch und die Verarbeitung von Informationen zwischen Neuronen. Die postsynaptische Stelle der exzitatorischen Synapsen wird häufig an dendritischen Dornen gebildet. Dendritische Dornen sind Strukturen, die in der Forschung rund um synaptische Plastizität, Neuroentwicklung sowie neurologische und psychiatrische Störungen von großem Interesse sind. Dendritische Stacheln durchlaufen im Laufe ihres Lebens strukturelle Veränderungen, wobei sich Eigenschaften wie die Gesamtanzahl der Wirbelsäule, die Größe der dendritischen Wirbelsäule und der morphologisch definierte Subtyp als Reaktion auf verschiedene Prozesse verändern. Die Abgrenzung der molekularen Mechanismen, die diese strukturellen Veränderungen der dendritischen Dornen regulieren, beruht auf morphologischen Messungen. Dies erfordert eine genaue und reproduzierbare Analyse der dendritischen Wirbelsäule, um experimentelle Beweise zu liefern. Die vorliegende Studie skizziert ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit Neurolucida 360 (automatische dreidimensionale Neuronenrekonstruktionssoftware). Dieses Protokoll ermöglicht die Bestimmung wichtiger Eigenschaften der dendritischen Wirbelsäule wie die Gesamtdichte der Wirbelsäule, das Volumen des Wirbelsäulenkopfes und die Klassifizierung in Wirbelsäulensubtypen und ermöglicht so eine effektive Analyse der strukturellen Phänotypen der dendritischen Wirbelsäule.

Einleitung

Dendritische Dornen sind Ausstülpungen von Dendriten, die häufig die postsynaptische Stelle der glutamatergen Synapsen bilden ^1,2. Dendritische Dornen sind im Bereich der synaptischen Plastizität von besonderem Interesse. Die Stacheln verändern sich oft, wenn sich die synaptische Stärke ändert, und werden größer und stärker bei langfristiger synaptischer Potenzierung oder kleiner und schwächer bei langfristiger synaptischer Depression 3,4,5,6,7.^....

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren folgten den Richtlinien der US National Institutes of Health zur Verwendung von Tieren in der intramuralen Forschung und wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung von fixierten Hippocampus-Schnitten

1. Betäubung von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin (Ketamin: 100 mg/kg; Xylazin: 8 mg/kg). Validieren Sie die Anästhesie durch Schwanzklemme und befestigen Sie die Maus an der Perfusionsplatte.
2. Entfernen Sie mit einer großen chirurgischen Schere die Hau....

Ergebnisse

Die effektive Nutzung dieser Analysemethode beginnt mit der Auswahl der dendritischen Segmente für die Rückverfolgung. Wie in Abbildung 1 beschrieben, befinden sich die idealen Dendriten für die Rückverfolgung nicht in unmittelbarer Nähe zu anderen Dendriten. Parallel verlaufende Dendriten können dazu führen, dass Stacheln von einem benachbarten Dendriten falsch identifiziert werden. Dendriten, die sich direkt kreuzen oder senkrecht in einer anderen Z-Ebene verlaufen, erschweren auch die gen.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Schritte der Probenvorbereitung, der Bildgebung und des Prozesses der Quantifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit Hilfe von dreidimensionaler Rekonstruktionssoftware. Diese Software ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das in der Lage ist, robuste Strukturdaten zu erstellen, die zu einer Vielzahl von Untersuchungen beitragen. Während des gesamten Prozesses gibt es einige kritische Schritte, die dieses Protokoll weniger .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
518F Immersionsöl	Zeiss	444960-0000-000
Kryostat	Leica	CM3050S	Für die Schnittvorbereitung
Feine Pinzette	FST	11150-10
Hämostatenzange	FST	13020-12
Große chirurgische Schere	FST	14002-16
LSM 880 Konfokalmikroskop	Zeiss	LSM 880
Mikroskop Deckglas	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltikpumpe II	Harvard Apparatur	70-2027	Für Perfusionen
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Wirbelsäulenanalysesoftware
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Wirbelsäulenanalysesoftware
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	Für Kryostatenschnitte
Paraformaldehyd (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Öl DIC	Zeiss	440762-9904-000
Skalpellklinge	FST	10022-00
Kleine chirurgische Schere	FST	14060-09
Spatel	FST	10091-12
Saccharose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Objektträger	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Eindeckmedium	Vektor Laboratorien	H-1400-10