Method Article

Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

DOI:

10.3791/66493

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September 27th, 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische Stacheln sind postsynaptische Kompartimente der meisten exzitatorischen Synapsen. Veränderungen der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule treten während der neurologischen Entwicklung, des Alterns, des Lernens und vieler neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen auf, was die Bedeutung einer zuverlässigen dendritischen Wirbelsäulenanalyse unterstreicht. Dieses Protokoll beschreibt die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule mit Hilfe einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware.

Abstract

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Synaptische Verbindungen ermöglichen den Austausch und die Verarbeitung von Informationen zwischen Neuronen. Die postsynaptische Stelle der exzitatorischen Synapsen wird häufig an dendritischen Dornen gebildet. Dendritische Dornen sind Strukturen, die in der Forschung rund um synaptische Plastizität, Neuroentwicklung sowie neurologische und psychiatrische Störungen von großem Interesse sind. Dendritische Stacheln durchlaufen im Laufe ihres Lebens strukturelle Veränderungen, wobei sich Eigenschaften wie die Gesamtanzahl der Wirbelsäule, die Größe der dendritischen Wirbelsäule und der morphologisch definierte Subtyp als Reaktion auf verschiedene Prozesse verändern. Die Abgrenzung der molekularen Mechanismen, die diese strukturellen Veränderungen der dendritischen Dornen regulieren, beruht auf morphologischen Messungen. Dies erfordert eine genaue und reproduzierbare Analyse der dendritischen Wirbelsäule, um experimentelle Beweise zu liefern. Die vorliegende Studie skizziert ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit Neurolucida 360 (automatische dreidimensionale Neuronenrekonstruktionssoftware). Dieses Protokoll ermöglicht die Bestimmung wichtiger Eigenschaften der dendritischen Wirbelsäule wie die Gesamtdichte der Wirbelsäule, das Volumen des Wirbelsäulenkopfes und die Klassifizierung in Wirbelsäulensubtypen und ermöglicht so eine effektive Analyse der strukturellen Phänotypen der dendritischen Wirbelsäule.

Introduction

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Dendritische Dornen sind Ausstülpungen von Dendriten, die häufig die postsynaptische Stelle der glutamatergen Synapsen bilden 1,2. Dendritische Dornen sind im Bereich der synaptischen Plastizität von besonderem Interesse. Die Stacheln verändern sich oft, wenn sich die synaptische Stärke ändert, und werden größer und stärker bei langfristiger synaptischer Potenzierung oder kleiner und schwächer bei langfristiger synaptischer Depression 3,4,5,6,7. Über die synaptische Plastizität hinaus verändert sich das Profil der dendritischen Stacheln im Laufe des Lebens. In der frühen Entwicklung gibt es eine Periode der Bildung und des Wachstums der dendritischen Wirbelsäule, gefolgt von der Beschneidung der dendritischen Wirbelsäule bis zum Erreichen eines stabilen Zustands 8,9,10. Im alternden Gehirn geht der Verlust der Wirbelsäule mit einer Schrumpfung des Gehirns und einem kognitiven Verfall einher11. Darüber hinaus sind viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Erkrankungen durch aberrante dendritische Dornen gekennzeichnet. Mehrere Hirnregionen bei Personen, die von Schizophrenie betroffen sind, haben weniger dendritische Stacheln, was wahrscheinlich auf eine veränderte synaptische Beschneidung zurückzuführenist 12. Autismus-Spektrum-Störungen sind auch durch dendritische Wirbelsäulenpathologien gekennzeichnet13. Der Verlust der dendritischen Wirbelsäule ist ein Kennzeichen sowohl der Alzheimer- als auch der Parkinson-Krankheit14,15. Angesichts des breiten Spektrums an Forschungsthemen, die Untersuchungen der Eigenschaften der dendritischen Wirbelsäule umfassen, sind Techniken zur genauen Quantifizierung der Wirbelsäule von größter Bedeutung.

Die Färbung, d.h. die Golgi-Methode, oder die Markierung von Neuronen durch Farbstofffüllung oder die Expression fluoreszierender Proteine sind gängige Methoden zur Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule 16,17,18. Einmal visualisiert, können Spines mit einer Vielzahl von kostenlosen und kommerziell erhältlichen Software-Clients analysiert werden. Das gewünschte Ergebnis der Analyse ist ein wichtiger Faktor, um zu bestimmen, welche Software am meisten genutzt werden kann. Fiji ist eine praktikable Softwareoption für Fragen, die sich auf die Dichte der dendritischen Wirbelsäule konzentrieren. Diese Technik beruht jedoch weitgehend auf zeitaufwändiger manueller Zählung, die das Potenzial für Verzerrungen einführen kann. Neue Plugins wie SpineJ ermöglichen eine automatische Quantifizierung und zusätzlich eine genauere Analyse des Wirbelsäulenhalses19. Ein Nachteil dieser Ansätze ist der Verlust einer dreidimensionalen Analyse zur Bestimmung des Spine-Volumens, da SpineJ auf zweidimensionale Bildstapel beschränkt ist. Darüber hinaus wird die Gewinnung von Informationen über den Spine-Subtyp durch diese Prozesse zu einer Herausforderung. Die vier vorherrschenden Stachelsubtypen dünn, pilzförmig, stumpf und filopodisch bezeichnen alle individuelle Funktionen und werden weitgehend über die Morphologieklassifiziert 20. Dünne Stacheln zeichnen sich durch einen länglichen Hals und einen definierten Kopfaus 21. Pilzstacheln haben einen viel größeren und ausgeprägten Wirbelsäulenkopf22. Die Stummelstacheln sind kurz und weisen eine geringe Varianz zwischen Kopf und Halsauf 23. Filopodien sind unreife Stacheln mit einem langen, dünnen Hals und ohne offensichtlich beobachtbaren Kopf24. Während die Klassifizierung wertvolle Informationen liefert, existieren Spines in einem Kontinuum von Dimensionen. Die Einteilung in Kategorien basiert auf morphologischen Messbereichen25,26. Die manuelle Vermessung von Stacheln für die Klassifizierung erhöht den logistischen Aufwand für die Forscher bei diesem Ansatz.

Andere Softwareoptionen, die sich speziell auf die dreidimensionale Analyse der dendritischen Wirbelsäule konzentrieren, eignen sich besser für die Untersuchung des Wirbelsäulenvolumens und der Subtyp-Eigenschaften 27,28,29,30,31. Trotz der Schwierigkeiten, die die dreidimensionale Analyse mit sich bringt, wie z. B. schlechte z-Ebenen-Auflösung und Abstrich, ermöglichen diese Softwareoptionen eine zuverlässige dreidimensionale Rekonstruktion von Dendriten und dendritischen Dornen in einer benutzergeführten halbautomatischen Weise. Die automatische Klassifizierung der identifizierten Stacheln in ihre Subtypen ist ebenfalls eine Funktion, die in einigen dieser Softwarepakete zur Analyse der Wirbelsäule vorhanden ist. Dies kann Bedenken hinsichtlich einer möglichen Arbeitsbelastung und experimentellen Verzerrung ausräumen. Neurolucida 360 ist eine kommerziell erhältliche Software, die eine zuverlässige und reproduzierbare dreidimensionale dreidimensionale Identifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule ermöglicht32. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, um fixiertes Gewebe effektiv zu präparieren, Bilder zu erfassen und schließlich dendritische Dornen mit dieser Software zu quantifizieren und zu klassifizieren.

Protocol

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Alle tierexperimentellen Verfahren folgten den Richtlinien der US National Institutes of Health zur Verwendung von Tieren in der intramuralen Forschung und wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung von fixierten Hippocampus-Schnitten

  1. Betäubung von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin (Ketamin: 100 mg/kg; Xylazin: 8 mg/kg). Validieren Sie die Anästhesie durch Schwanzklemme und befestigen Sie die Maus an der Perfusionsplatte.
  2. Entfernen Sie mit einer großen chirurgischen Schere die Haut und das Fell von der Brust, um den darunter liegenden Brustkorb leichter sichtbar zu machen.
  3. Machen Sie einen horizontalen Schnitt unterhalb der Breite des Brustkorbs und vermeiden Sie dabei Leber und Zwerchfell. Ziehe mit einer feinen Pinzette den Processus xiphoid nach oben und schneide jede Seite des Brustkorbs durch. Klappen Sie den Brustkorb bis zum Halsbereich hoch und klemmen Sie ihn mit einer Hämostat-Pinzette fest.
  4. Führen Sie eine 21-G-Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens ein und beginnen Sie mit der Perfusion mit Raumtemperatur 1x PBS bei ca. 5 ml/min. Machen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof. Perfundierte mit PBS, bis die Lösung, die den Vorhof verlässt, klar ist.
  5. Schalten Sie die Perfusionspumpe aus, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Schlauch gelangen. Legen Sie den Schlauch von PBS in eiskaltes 4%iges Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Perfundieren Sie mit PFA mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min, bis das Tier vollständig versteift ist, ca. 25 mL.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das PFA frisch ist (nicht älter als 1 Woche, wenn der Vorrat bei 4° C gelagert wird), um eine optimale Fixierung zu gewährleisten.
  6. Entfernen Sie die Haut mit einer kleinen chirurgischen Schere von der Schädeloberfläche. Machen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere einen Schnitt in der Mitte des Schädels. Machen Sie seitliche Schnitte rostral zum Riechkolben und über dem Kleinhirn.
  7. Öffnen Sie den Schädel mit einer feinen Pinzette, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie mit einem Spatel das Gehirn vorsichtig aus den Riechkolben heraus und geben Sie über Nacht 4% PFA in PBS.
    HINWEIS: Für ein umfassenderes Protokoll der Perfusion von Nagetieren verweisen wir auf Gage et al.33.
  8. Kryoschützen Sie das fixierte Gehirn, indem Sie das 4%ige PFA 1 Tag lang durch 15% Saccharose in PBS ersetzen. Ersetzen Sie anschließend die 15% ige Saccharose durch 30% Saccharose in PBS-Lösung für 1 Tag, bis das Gehirn in die Lösung sinkt.
  9. Nehmen Sie das Gehirn aus der Saccharoselösung und geben Sie es in eine Petrischale mit PBS. Schneide das Kleinhirn und den Riechkolben mit einer Skalpellklinge ab.
  10. Geben Sie eine kleine Menge der Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) mit einem Durchmesser von 1-2 cm auf die Oberfläche des Probenhalters. Montieren Sie das Gehirn koronal an den Probenhalter mit der kaudalen Schnittfläche im OCT. Frieren Sie das Gehirn schnell ein, indem Sie den Probenhalter in pulverisiertes Trockeneis legen, bis es sichtbar gefroren ist, ca. 5-7 Minuten.
  11. Achten Sie darauf, dass der Schaufelwinkel des Kryostaten zwischen 0° und 5° eingestellt ist, um gleichmäßige Schnitte zu erzeugen. Passen Sie den Winkel der Walzplatte an, um eine optimale Scheibenabflachung zu erzielen. Spezifische Anweisungen finden Sie im Gerätehandbuch.
  12. Platzieren Sie den Probenhalter so in den Kryostaten, dass die ventrale Oberfläche des Gehirns der Klinge am nächsten ist. Schneiden Sie das Gehirn in 30 μm lange dorsale Hippocampus-Schnitte, wobei alle Scheiben rostral zum Hippocampus verworfen werden.
    HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann an jede gewünschte Gehirnregion angepasst werden. Die Schritte 1.9 bis 1.12 ändern sich je nach interessierter Region.
  13. Übertragen Sie dorsale Hippocampusschnitte auf PBS. Montieren Sie die Hippocampus-Schnitte vorsichtig mit einem Pinsel auf einen Objektträger. Entfernen Sie überschüssige Lösung mit Wattestäbchen oder zarten Tüchern.
  14. Tragen Sie 100 μl hartes Eindeckmedium auf den Objektträger auf, der alle Hirnschnitte bedeckt. Um Blasenbildung zu vermeiden, senken Sie das Deckglas langsam mit einer Pinzette auf das Eindeckmedium ab. Wenn sich Blasen bilden, klopfen Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf das Deckglas, damit sie entweichen können. Lassen Sie die Objektträger über Nacht aushärten, bevor Sie sie aufnehmen.

2. Hochauflösende konfokale Bildgebung

  1. Verwenden Sie Okulare mit geringer Vergrößerung, um fluoreszierende Zellen zu identifizieren. Wechseln Sie zu einem 63-fachen (NA = 1,4) oder höherem Objektiv und wenden Sie das richtige Immersionsmedium auf das Objektiv an.
    HINWEIS: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einem 63-fachen oder höheren Objektiv verwenden.
  2. Identifizieren Sie gut beschriftete dendritische Segmente mit begrenzter Überlappung für die Bildaufnahme. Stellen Sie die Laserleistung und -verstärkung so ein, dass die fluoreszierenden Dendriten nicht gesättigt sind. Darüber hinaus kann eine Verringerung der Scangeschwindigkeit zu einer besseren Bildauflösung führen.
  3. Erfassen Sie Z-Stapel, die die vollständigen dendritischen Segmente für zukünftige Analysen umfassen. Z-Stapel, die größer als 10 μm sind, sind aufgrund des zusätzlichen Potenzials für dendritische Überlappungen in der z-Ebene unerwünscht.
    HINWEIS: Verwenden Sie die kleinste verfügbare Z-Schritt-Größe (0,2-0,7 μm) und 1 Lochblende für eine luftige Einheit. Die kleinere Schrittweite führt zu mehr Bildern im Z-Stapel, wodurch die begrenzte Z-Auflösung vieler Mikroskope kompensiert wird.
  4. Optional: Falls verfügbar, verwenden Sie die jeweilige Dekonvolutionssoftware-Funktionalität des Mikroskops, um Bilder zu entfalten. Dies ermöglicht Bilder mit höherer Auflösung.

3. Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule

  1. Öffnen Sie Neurolucida 360 (v2022.1.1 oder höher). Öffnen Sie die Bilddatei in der Wirbelsäulenanalyse-Software (Datei > > Bild öffnen). Stellen Sie sicher, dass die Bilddatei im Hauptfenster und in der 3D-Umgebung sichtbar ist. Wenn das Fenster "3D-Umgebung" nicht angezeigt wird, klicken Sie mit der linken Maustaste auf "3D-Umgebung" in der oberen Symbolleiste des Hauptfensters auf der Registerkarte "Trace " (Ergänzende Abbildung 1)
    HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls kann für alle dendritischen Bilder angepasst werden, nicht ausschließlich für Dendriten aus Mausgewebe.
  2. Stellen Sie sicher, dass das Bild auf der Registerkarte "Bildanzeige ändern" des Fensters "3D-Umgebung" im Feld "Bild anzeigen als" als 3D-Volumen angezeigt wird. Wählen Sie auf der Registerkarte Bild im Feld Einstellungen für den Bildstapel die Option Maximale Projektion im Dropdown-Menü Oberfläche anzeigen als aus. (Ergänzende Abbildung 2)
  3. Identifizieren Sie ein geeignetes dendritisches Segment für die Rückverfolgung.
    1. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Werkzeug Drehpunkt verschieben in der oberen Symbolleiste des Fensters 3D-Umgebung . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den gewünschten Dendriten, um einen neuen Drehpunkt zu setzen. Dadurch wird die Ausrichtung geändert, um ein effektives Heranzoomen zu ermöglichen.
    2. Stellen Sie die ursprüngliche Ausrichtung wieder her, indem Sie mit der linken Maustaste auf das Symbol Ausrichtung zurücksetzen klicken. Nachdem Sie den Drehpunkt festgelegt haben, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Werkzeug Drehpunkt verschieben , um mit dem Nachzeichnen des Dendriten zu beginnen. (Ergänzende Abbildung 2).
      HINWEIS: Der ideale Dendrit ist ein Dendrit mit begrenzter Überlappung mit anderen Dendriten in einer der Koordinatenebenen, der sich nicht mit einem anderen Dendriten schneidet oder oberflächlich zu einem anderen darunter liegt. Dendriten in geringer Nähe zu anderen in der XY-Ebene sind ebenfalls vorzuziehen, um eine unangemessene Zuordnung benachbarter Stacheln zu dem verfolgten Dendriten zu verhindern. Es muss auch beachtet werden, dass Dendriten unterschiedlicher Dicke, Ordnung und Abstände vom Soma unterschiedliche dendritische Dornendichten aufweisen 34,35. Dies muss bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden. Dendriten sekundärer Ordnung mit einer Dicke von <1,5 μm sind ideale Kandidaten für die Verfolgung (Abbildung 1).
  4. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Struktur des Fensters 3D-Umgebung . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Benutzergeführt, um den Ablaufverfolgungsmodus anzuzeigen, und auf Richtungskernel als Methode in den Ablaufverfolgungsoptionen für Benutzergeführt.
  5. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendriten, wenn ein kreisförmiger Kern erscheint, um die Verfolgung zu starten. Bewegen Sie den Cursor entlang des dendritischen Segments. Dadurch werden die Kernel automatisch gefüllt. Wenn die Kernel nicht automatisch gefüllt werden, siehe Schritt 3.51.
    1. Bewegen Sie den Cursor vorsichtig auf dem Dendriten hin und her, bis sich die Körner bevölkern. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um die vorhandenen erkannten Kernel beizubehalten. Wenn Kernel nicht mehr bestückt werden, klicken Sie mit der linken Maustaste, wenn sich ein Kernel weiter unten im Dendriten befindet, um ihn manuell zu platzieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Ablaufverfolgung zu beenden. Stellen Sie sicher, dass der verfolgte Dendrit mindestens 7 μm lang ist (Ergänzende Abbildung 3).
  6. Überprüfen Sie die Genauigkeit der dendritischen Verfolgung anhand aller drei Richtungen der 3D-Umgebung, Nicken, Gieren und Rollen, indem Sie mit der linken Maustaste auf das Fenster "3D-Umgebung " klicken und es ziehen. Identifizieren Sie Punkte, an denen sich die dendritische Spur außerhalb der entsprechenden Stelle auf dem Dendriten befindet. Es kann Fälle geben, in denen es von oben nach unten genau nachgezeichnet aussieht, aber in der Z-Dimension befinden sich die Punkte nicht auf dem Dendriten (Abbildung 2).
  7. Um falsch nachgezeichnete dendritische Segmente zu korrigieren, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten im Menü Baum . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendriten von Interesse, und klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf Punkte.
  8. Verschieben Sie falsch platzierte Punkte per Klick und Ziehen zurück auf das Dendritensegment. Löschen Sie überflüssige Punkte, indem Sie mit der linken Maustaste auf den Punkt klicken und dann auf die Schaltfläche Löschen klicken. Ändern Sie die Größe der Punkte, wenn der Dendrit nicht ausreichend gefüllt ist. Um die Größe des Punktes zu ändern, klicken Sie mit der linken Maustaste auf einen Punkt, und passen Sie den Schieberegler für die Dicke an, um die Größe zu ändern (Ergänzende Abbildung 4).
    HINWEIS: Unzureichend gefüllte Dendriten können dazu führen, dass falsche Stacheln identifiziert werden, die Bestandteile des dendritischen Segments sind. Umgekehrt kann eine Überfüllung der Dendriten die wahren Stacheln verdecken.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.8 für mehrere Dendriten im Bild, bevor Sie mit der Identifizierung der Wirbelsäule in Schritt 3.10 fortfahren.
  10. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Wirbelsäule im Fenster 3D-Umgebung. Legen Sie die Erkennungseinstellungen für den äußeren Bereich, die minimale Höhe und die minimale Voxelanzahl fest. Je nach Vorbereitung kann es vorkommen, dass die voreingestellten Werte geändert werden müssen, wenn eine klare und spezifische Begründung für Änderungen vorliegt. Die voreingestellten Bedingungen sind: Äußerer Bereich: 2,5 μm, Minimale Höhe: 0,3 μm, Minimale Voxelzahl: 10 Voxel.
    HINWEIS: Unterschiedliche Präparate, wie z. B. Zellkulturen vs. akutes Gewebe, sowie unterschiedliche Entwicklungszeitpunkte erfordern unterschiedliche Kriterien, die aus der vorhandenen Literatur abgeleitet werden müssen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das Ändern der Erkennungseinstellungen die Ergebnisse erheblich verändern kann. So kann z.B. eine höhere Mindesthöhe kurze Stacheln ausschließen. Die Nachweiseinstellungen müssen während des gesamten Verlaufs des Experiments konsistent bleiben.
  11. Stellen Sie die Detektorempfindlichkeit auf 70 % ein und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Alle erkennen. Dadurch werden die durch diese Detektorempfindlichkeit identifizierten Stacheln auf allen Dendriten bevölkert. Wenn die Auswahl von Stacheln auf Dendriten-spezifische Weise gewünscht wird, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Kontrollkästchen Bild klicken, um alle am nächsten Ast zu erkennen, und klicken Sie mit der linken Maustaste auf jeden Dendriten manuell mit unterschiedlichen Detektorempfindlichkeiten.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist es normal, dass sich nicht alle dendritischen Stacheln besiedeln. Ebenso können Nicht-Stacheln falsch ausgefüllt werden. Die anfängliche Empfindlichkeit von 70 % ist ebenfalls flexibel. Dies kann sich je nach Zubereitung ändern.
  12. Untersuchen Sie die durch diese Detektorempfindlichkeit ausgewählten Stacheln, indem Sie auf den Dendriten klicken und ihn in alle drei Richtungen ziehen. Wenn die Mehrheit der erkannten Stacheln nicht vollständig gefüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.12.1 fort. Wenn die erkannten Stacheln überfüllt sind, fahren Sie mit Schritt 3.12.2 fort. Wenn die erkannten Stacheln ausreichend gefüllt zu sein scheinen, fahren Sie mit Schritt 3.13 fort.
    1. Erhöhen Sie die Detektorempfindlichkeit um 5 % bis 10 % und klicken Sie erneut mit der linken Maustaste auf Alle erkennen . Dadurch werden alle zuvor erkannten Stacheln durch neue mit höherer Empfindlichkeit ersetzt. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die erkannten Stacheln ausreichend gefüllt sind.
    2. Verringern Sie die Empfindlichkeit des Detektors um 5 % bis 10 % und klicken Sie erneut mit der linken Maustaste auf Alle erkennen . Dadurch werden alle zuvor erkannten Stacheln durch neue mit geringerer Empfindlichkeit ersetzt. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die erkannten Stacheln ausreichend gefüllt sind.
  13. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Vorhandene Wirbelsäulen beibehalten auf der Registerkarte Wirbelsäule der 3D-Umgebung. Wenn die Option "Bild klicken, um alle im nächstgelegenen Zweig zu erkennen " ausgewählt wurde, deaktivieren Sie die Option.
    HINWEIS: Durch Aktivieren von Vorhandene Stacheln beibehalten wird sichergestellt, dass neu identifizierte dendritische Stacheln manuell keine zuvor identifizierten Stacheln überschrieben werden. Stellen Sie sicher, dass dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, bevor Sie fortfahren, um die vorherige Arbeit nicht zu überschreiben.
  14. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Drehpunkt verschieben und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendriten, der eine weitere Dornerkennung erfordert, um den Drehpunkt zu setzen.
    1. Deaktivieren Sie Drehpunkt verschieben. Identifizieren Sie eine ungefüllte dendritische Wirbelsäule. Erhöhen Sie die Detektorempfindlichkeit um 10%-20% gegenüber der vorherigen Erkennung und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Wirbelsäule. Wenn die erkannte Wirbelsäule unter- oder überfüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.14.3 oder 3.14.4 fort. Wenn der Rücken nicht ausgefüllt wird, wird die Meldung Kein Rücken an der ausgewählten Position kann erkannt werden. Fahren Sie in diesem Fall mit Schritt 3.14.2 fort.
    2. Erhöhen Sie die Detektorempfindlichkeit schrittweise, möglicherweise über 100 %, bis die Wirbelsäule erkannt und ausreichend gefüllt wurde. Wenn die Wirbelsäule erkannt, aber unzureichend gefüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.14.3 fort. Wenn die Wirbelsäule überfüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.14.4 fort (Abbildung 3).
    3. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den unterfüllten Buchrücken. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Entfernen. Deaktivieren Sie die Registerkarte Bearbeiten . Erhöhen Sie die Empfindlichkeit um 5%-10% und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Wirbelsäule. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn der Rücken noch unterfüllt ist.
    4. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den überfüllten Buchrücken. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Entfernen. Deaktivieren Sie die Registerkarte Bearbeiten . Verringern Sie die Empfindlichkeit um 5%-10% und klicken Sie auf die Wirbelsäule. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn der Rücken immer noch überfüllt ist.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 3.14 bis 3.14.4, bis alle durch visuelle Identifizierung identifizierten Stacheln erkannt wurden. Überprüfen Sie den Dendriten auf Stacheln, die zu benachbarten Dendriten gehören, auf falsche Stacheln, die keinem echten Signal entsprechen, oder auf mögliche Dendritensegmente, die fälschlicherweise als Stachel bezeichnet wurden. Löschen Sie diese falschen Spines mit der Remove-Funktion .
  16. Untersuchen Sie die identifizierten Stacheln auf dem Dendriten. In einigen Fällen können mehrere Stacheln als ein Konglomeratstachel erscheinen. Wenn eine Wirbelsäule zwei zu umfassen scheint, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Rücken und dann mit der linken Maustaste auf Auswahl ausblenden. Nachdem Sie einen Konglomeratrücken bestätigt haben, klicken Sie auf der Registerkarte Bearbeiten mit der linken Maustaste auf Auswahl anzeigen , und wählen Sie Teilen aus. Wenn sich mehr als zwei Stacheln in einem Konglomerat befinden, muss dieser Schritt möglicherweise wiederholt werden (Abbildung 4).
    HINWEIS: Wenn sich der Konglomeratwirbel nach Schritt 3.16 nicht spaltet, entfernen Sie den Rücken . Wählen Sie dann die intensivere Wirbelsäule des Konglomerats mit einer niedrigeren Empfindlichkeit. Sobald die intensivere Wirbelsäule gefüllt ist, erhöhen Sie die Empfindlichkeit, um die andere ungefüllte Wirbelsäule auszuwählen. Alternativ kann das Löschen des Konglomeratwirbels und das anschließende Erhöhen der Empfindlichkeit eine korrekte Aufteilung ermöglichen.
  17. Wenn alle visuell identifizierbaren Stacheln erkannt und entsprechend gefüllt wurden, klicken Sie auf der Registerkarte Spine mit der linken Maustaste auf Classify All , um die Stacheln in vier Untertypen zu klassifizieren: Thin, Mushroom, Stubby und Filopodia (Abbildung 5).
    HINWEIS: Die Parameter für die Klassifizierung von Wirbelsäulen können im Fenster "Einstellungen " des Felds "Klassifizierung" auf der Registerkarte "Wirbelsäule " geändert werden. Wie bei den Detektoreinstellungen wird eine klare Begründung für die Änderung der bestehenden Parameter dringend empfohlen. Die voreingestellten Werte sind: Kopf-zu-Hals-Verhältnis: 1,1, Längen-zu-Kopf-Verhältnis: 2,5, Pilzkopfgröße: 0,35 μm, Filopodium-Länge: 3 μm.
  18. Wählen Sie in der oberen Symbolleiste des Fensters "3D-Umgebung" die Option "Speichern und anzeigen" im Neurolucida Explorer aus. Neurolucida Explorer ist der Ort, an dem die Daten aus den Tracings gesammelt werden. Die Arbeit wird als .dat Datei gespeichert, die alle Zeichnungen und Buchrücken enthält.
  19. Klicken Sie im Explorer-Fenster auf der Registerkarte Ansicht mit der linken Maustaste auf Alle auswählen , um alle Dendriten und Stacheln hervorzuheben.
  20. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Analysieren in der oberen Symbolleiste. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Dropdown-Menü Struktur . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Analyse verzweigter Strukturen.
  21. Abhängig von den interessierenden Variablen kann eine beliebige der Analysen ausgewählt werden. Die beiden nützlichsten für Fragen, die sich auf die Wirbelsäulendichte und das durchschnittliche Stachelvolumen konzentrieren , sind Jeder Baum > Jeder Dendrite und Stacheln > Details zur Wirbelsäule. Wählen Sie OK aus, und die Daten werden in zwei separaten Fenstern angezeigt.
  22. Kopieren Sie die Daten zur weiteren Zusammenstellung und Analyse in eine Tabelle.
    HINWEIS: Der einzelne Baum wird durch Dendriten getrennt, das Spine-Volumen jedoch nicht. Mit der Sortierfunktion in der Tabelle können die Spine-Details nach Merkmalen gefiltert werden.

Results

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Die effektive Nutzung dieser Analysemethode beginnt mit der Auswahl der dendritischen Segmente für die Rückverfolgung. Wie in Abbildung 1 beschrieben, befinden sich die idealen Dendriten für die Rückverfolgung nicht in unmittelbarer Nähe zu anderen Dendriten. Parallel verlaufende Dendriten können dazu führen, dass Stacheln von einem benachbarten Dendriten falsch identifiziert werden. Dendriten, die sich direkt kreuzen oder senkrecht in einer anderen Z-Ebene verlaufen, erschweren auch die genaue dendritische Abtastung erheblich. Es ist auch wichtig, die Unterschiede in der Dendritendicke zu beachten. Wie bereits berichtet, gibt es wesentliche Unterschiede in der Dichte der Wirbelsäule bei Dendriten unterschiedlicher Dicke36. Es kann auch Unterschiede im gleichen Dendriten mit zunehmendem Abstand vom Astpunkt37 geben. Die Verfolgung von Dendriten gleicher Ordnung und Dicke, idealerweise mit ähnlichem Ursprung der Astpunkte, kann die bestehende Heterogenität der dendritischen Dorndichte kontrollieren. Die Identifizierung des Astpunktes in einigen Präparaten kann sich als undurchführbar erweisen, aber die Dicke des Dendriten sollte immer ein kontrollierbarer Faktor bei der Dendritenverfolgung sein. Die genaue Verfolgung der dendritischen Segmente ist entscheidend, um genaue Ergebnisse aus dieser Analyse zu erhalten. Es muss sichergestellt werden, dass sich alle Punkte des verfolgten Dendriten wirklich innerhalb des Dendriten befinden. Die Betrachtung des dreidimensionalen Dendriten aus verschiedenen Richtungen kann bei diesem Prozess hilfreich sein. Wie in Abbildung 2A,B gezeigt, zeigt die Draufsicht etwas, das wie ein korrekt nachgezeichneter Dendrit aussieht. In der Seitenansicht; Zahlreiche Punkte befinden sich jedoch nicht auf dem Dendriten selbst. Diese Probleme sind in der Seitenansicht von Abbildung 2C nicht vorhanden. Es ist auch wichtig, dass die Dendriten während der Nachverfolgung richtig gefüllt sind. Ein unterfüllter Dendrit kann dazu führen, dass Dendritenstücke fälschlicherweise als Stacheln identifiziert werden. Ein Dendrit, der überfüllt ist, kann aufgrund der Mindesthöhenschwelle verhindern, dass echte Stacheln identifiziert werden können. Diese manuelle Bewertung der benutzergeführten Abtastung ist entscheidend, um eine genaue Analyse der dendritischen Wirbelsäule zu ermöglichen.

Auch die Identifizierung von dendritischen Dornen erfordert einen benutzergeführten Ansatz. Die Verwendung der Funktion "Alle erkennen" zum Festlegen des einheitlichen Empfindlichkeitsschwellenwerts des Detektors ist aus zahlreichen Gründen unzureichend. Die Verwendung der Funktion "Alle erkennen" ist nützlich, um die offensichtlichsten Stacheln zu identifizieren, aber die Füllung dieser Stacheln muss überprüft werden, um dies zu überprüfen. Die gekennzeichneten Stacheln mit dem Anfangsbuchstaben "Alle erkennen" sind möglicherweise unterfüllt. Um dies zu korrigieren, muss die identifizierte Wirbelsäule einzeln gelöscht und dann manuell mit einer höheren Detektorempfindlichkeit neu identifiziert werden (Abbildung 3A-C). Dadurch wird sichergestellt, dass die Wirbelsäule ausreichend gefüllt ist. Es gibt eine erhebliche Heterogenität in der erforderlichen Detektorempfindlichkeit für Spines, die manuell berücksichtigt werden muss. Wenn Sie die Empfindlichkeit des Detektors erhöhen, um alle zu erkennen, kann dies zu überfüllten Stacheln führen, die ebenfalls manuell korrigiert werden müssen (Abbildung 3D). Ein weiteres Problem bei unsachgemäßer Detektorempfindlichkeit ist die unangemessene Bildung eines Konglomeratwirbels, d. h. eines gefüllten dendritischen Dorns, der mehrere Stacheln umfasst. Zwei Stacheln, die sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, können fälschlicherweise zu einem Konglomeratstachel verschmolzen sein (Abbildung 4A,B). Die Spine-Detection-Software verfügt über eine "Split"-Funktion, mit der Spines, die durch Überfüllung verschmolzen wurden, getrennt werden können. Die "Split"-Funktion ermöglicht es, die einzelnen Spines einfach aus dem Konglomerat-Spine zu generieren (Abbildung 4C). Die genaue Dendritenverfolgung und die Füllung der dendritischen Wirbelsäule ermöglichen eine genaue Klassifizierung in Wirbelsäulen-Subtypen. Die Klassifizierung der Wirbelsäule beruht auf der Morphologie der gefüllten Stacheln und dem Abstand zu den Dendriten, so dass jeder Schritt in diesem Prozess eine Rolle bei der morphologischen Klassifizierung spielt (Abbildung 5).

Aufgrund der Notwendigkeit einer manuellen Auswahl und Schwellenwertsetzung ist es entscheidend, einen einheitlichen Standard für alle Analysen zu befolgen. Dies ist insbesondere dann relevant, wenn mehrere Benutzer an der Datenanalyse beteiligt sind. Um sicherzustellen, dass alle Prüfärzte, die die Analyse durchführen, den gleichen Standard befolgen, sollten die Prüfärzte Daten von denselben verfolgten Dendriten vergleichen. Dies kann das Potenzial für Verzerrungen durch Experimentatoren verringern, indem sichergestellt wird, dass jeder Forscher Stacheln auf der Grundlage gemeinsamer, einheitlicher Kriterien auf verblindete Weise identifiziert. Es besteht auch die Möglichkeit, dass ein einzelner Forscher aufgrund von Müdigkeit zwischen den Tagen oder sogar am selben Tag verzerrt wird. Dies sollte während des gesamten Prozesses der Datenanalyse überwacht werden. Um die Gültigkeit der Analyse weiter zu gewährleisten, stellt der Vergleich der ersten Ergebnisse mit den in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen sicher, dass das Protokoll effektiv befolgt wird. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Vergleich nur dann effektiv ist, wenn die Vorbereitung und die Parameter gemeinsam genutzt werden. Unterschiede in der Färbung, der Erfassung von Fluoreszenzsignalen, der Reihenfolge und Dicke der Dendriten oder der Hirnregion können zu unterschiedlichen Ergebnissen beitragen 8,36. Im Falle fehlender veröffentlichter Ergebnisse ermöglicht der Einsatz mehrerer Forscher zur Validierung der Wirbelsäulenidentifikation ein erhöhtes Vertrauen in die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Analyse. Diesem Manuskript wurde eine ergänzende Analysemappe beigefügt. Dieser Ordner enthält Dateien mit Beispielbildern von dendritischen Segmenten, verfolgten Dendriten, verfolgten Dendriten mit identifizierten und klassifizierten Stacheln und der Datenausgabe (Ergänzende Tabelle 1, Ergänzende Datei 1, Ergänzende Datei 2, Ergänzende Datei 3 und Ergänzende Datei 4). Neue Benutzer können mit diesem Datensatz trainieren, um die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren zu üben. Benutzergenerierte Ergebnisse innerhalb von 10 % des bereitgestellten Beispieldatensatzes gelten als akzeptabel für die Reproduktion des Analysestandards. Aufgrund des potentiell subjektiven Kriteriums einer vollständig gefüllten Wirbelsäule und der Notwendigkeit einer manuellen Untersuchung von automatisch erkannten Wirbelsäulen ist die Varianz zwischen und innerhalb der Forscher ein normaler Teil der Analyse. Sollten die generierten Ergebnisse diesen Schwellenwert überschreiten; Es sollte jedoch ein direkter Vergleich durchgeführt werden, um Fälle unterschiedlicher Wirbelsäulenvolumina sowie falsch ein- oder ausgeschlossener Wirbelsäulen zu bestimmen. Der Beispieldatensatz kann dann erneut analysiert werden, bis der akzeptable Schwellenwert erreicht ist.

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Abbildung 1: Auswahl von Dendriten für die Analyse der dendritischen Wirbelsäule. (A) 3D-Volumendarstellung von konfokalen Z-Stapel-Bildern, die von proximalen CA1-Dendriten in der transgenen Mauslinie THY1-YFP aufgenommen wurden. Man beachte die Heterogenität der Dendritenordnung mit dickeren primären Dendriten in blauen Ovalen und dünneren, sekundären und tertiären Dendriten in rosa Ovalen. (B) Ideale Kandidaten für die Dendritenverfolgung sind durch grüne Ovale gekennzeichnet. Beachten Sie die Dicke und die begrenzten Schnittpunkte, Überlappungen und die Nähe zu anderen Dendriten. Das rote Oval kennzeichnet dendritische Segmente, die aufgrund der hohen Schnittpunkte, Überlappungen und der Nähe zu anderen Dendriten für die dendritische Verfolgung vermieden werden sollten. Dickere, primäre Dendriten sind ebenfalls keine Kandidaten für die Rückverfolgung. Maßstabsleiste = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Genaue Verfolgung dendritischer Segmente. (A) 3D-Volumendarstellung von konfokalen Z-Stapel-Bildern, die von proximalen CA1-Dendriten in der transgenen Mauslinie THY1-YFP aufgenommen wurden, um über die benutzergeführte gerichtete Kernel-Methode verfolgt zu werden. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Beispiel für eine schlechte Dendritenverfolgung. Der Dendrit scheint in der Draufsicht richtig nachgezeichnet zu sein. Die Seitenansicht zeigt, dass der Dendrit falsch mit vom Dendriten abweichenden Spitzen gefüllt ist. (C) Beispiel für eine ordnungsgemäße Dendritenverfolgung. Die Draufsicht sieht ähnlich aus wie B, aber die Seitenansicht unterscheidet sich erheblich. Der Dendrit in C wird korrekt nachgezeichnet, was durch seine vollständige Füllung ohne Abweichungen vom Dendriten angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Genaues Füllen der dendritischen Dornen durch manuelle Auswahl. (A) 3D-Volumendarstellung von konfokalen Z-Stapel-Bildern, die von proximalen CA1-Dendriten in der transgenen Mauslinie THY1-YFP einer Wirbelsäule aufgenommen wurden, die auf die manuelle Detektion wartet. Maßstabsbalken = 0,5 μm. (B) Beispiel für einen unterfüllten dendritischen Dorn. Es ist immer noch ein erhebliches Fluoreszenzsignal sichtbar, das auf eine unvollständige Füllung zurückzuführen ist. (C) Beispiel für eine richtig gefüllte dendritische Wirbelsäule. Das Vorhandensein einer kaum sichtbaren "Korona" des Signals um die Außenseite der Füllung herum ist der Standard für die genaue Füllung dendritischer Dornen. (D) Beispiel für eine überfüllte dendritische Wirbelsäule. Die Empfindlichkeit des Detektors ist zu hoch, was zu einem überfüllten Rücken führt. Die Füllung ist über die Grenzen der Fluoreszenz hinausgegangen und hat eine kaum wahrnehmbare Korona. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Spaltung von dendritischen Dornen im Konglomerat. (A) 3D-Volumendarstellung von konfokalen Z-Stapel-Bildern, die von proximalen CA1-Dendriten in der transgenen Mauslinie THY1-YFP mit zwei Dornen in unmittelbarer Nähe aufgenommen wurden. Maßstabsbalken = 0,15 μm. (B) Ein Beispiel für zwei unabhängige Stacheln, die fälschlicherweise als ein Konglomerat dendritischer Dorn gefüllt sind. (C) Nach der Verwendung der "Split"-Funktion wird die Konglomeratwirbelsäule in zwei unterschiedliche, ordnungsgemäß gefüllte dendritische Dornen aufgeteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Identifizierung der dendritischen Wirbelsäule und Klassifizierung in Subtypen. (A) 3D-Volumendarstellung von konfokalen Z-Stapel-Bildern, die von proximalen CA1-Dendriten in der transgenen THY1-YFP-Mauslinie eines verfolgten dendritischen Segments aufgenommen wurden, das für die Quantifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule isoliert wurde. Maßstabsleiste = 5 μm. (B) Verfolgtes dendritisches Segment, wobei alle dendritischen Stacheln identifiziert und untersucht wurden, um eine ordnungsgemäße Füllung und Spaltung zu gewährleisten. Die Software ordnet in diesem Schritt den identifizierten Stacheln willkürlich Farben zu. (C) Einteilung aller identifizierten dendritischen Dornen in Subtypen unter Verwendung definierter Parameter in der Software. Blau = Pilz, gelb = dünn und grün = stumpf. Filopodien sind aufgrund des Alters dieses Gewebes nicht vorhanden. (D) Repräsentative Bilder von Pilzen, dünnen und stumpfen Stacheln, die ungefüllt (oben) und gefüllt (unten) sind. Maßstabsleiste = 0,3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Zugriff auf die 3D-Umgebung. Z-Stapel von konfokalen Bildern, die in der Softwareoberfläche angezeigt werden. Die Navigation in der 3D-Umgebung auf der Registerkarte "Trace " im Hauptviewer wurde gelb hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Bildparameter und Ausrichtungseinstellungen für die 3D-Umgebung. 3D-Umgebungsviewer für konfokale Z-Stapel-Bilder. Die Parameter auf der hervorgehobenen Registerkarte Bildanzeige ändern , die durch gelbe Pfeile gekennzeichnet sind, sind auf Bild anzeigen als: 3D-Volumen und Oberfläche anzeigen als: Maximale Projektion eingestellt. Drehpunkt verschieben und Ausrichtung zurücksetzen sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Verfolgung von Dendritensegmenten. (A) 3D-Volumen von konfokalen Z-Stapel-Bildern für die Dendritenverfolgung. Wenn die Registerkarte "Baum", "Benutzergeführt" und "Richtungskernel" ausgewählt sind, beginnt die Ablaufverfolgung mit dem Platzieren des Anfangskerns auf dem Dendriten mit einem Linksklick. (B) Ausbreitung von gerichteten Körnern entlang des Dendriten nach der Cursorbewegung. (C) Ein Linksklick weiter unten auf den Dendriten füllt die gerichteten Kerne. (D) Beispiel für gerichtete Kerne, die Dendriten nicht nach unten besiedeln. Stattdessen ist ein einzelner Kernel weiter unten im Segment vorhanden. (E) Ein Linksklick auf den einsamen Kern füllt den Dendriten zwischen den beiden Punkten. Wenn Sie mit der rechten Maustaste klicken, wird die Nachzeichnung beendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Justierpunkte in verfolgten Dendriten. (A) Verfolgtes Dendritensegment bis zur Punktanpassung. Für die Bearbeitung von Dendriten müssen die Registerkarten "Baum" und "Bearbeiten" ausgewählt werden. Beide sind gelb hinterlegt. Dendrit wurde mit einem Linksklick zur Bearbeitung ausgewählt. (B) Die Auswahl der gelb hervorgehobenen Registerkarte "Punkte" ermöglicht die Auswahl einzelner Punkte auf dem Dendritensegment. Der grüne Punkt hat eine Dicke von 1,2 μm. (C) Angepasster Punkt, um den Dendriten genauer zu füllen. Der neue Dickenwert des grünen Punktes beträgt 0,6 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Beispielergebnisse der Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Beispielhafte Bildnachzeichnungen mit Dendriten und spines.dat Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Beispiel-Tracings mit dendrites.dat Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Beispiel für ein Dendritenbild file.czi Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Beispiel-Dendriten-Bilddatei.jpx Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Schritte der Probenvorbereitung, der Bildgebung und des Prozesses der Quantifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit Hilfe von dreidimensionaler Rekonstruktionssoftware. Diese Software ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das in der Lage ist, robuste Strukturdaten zu erstellen, die zu einer Vielzahl von Untersuchungen beitragen. Während des gesamten Prozesses gibt es einige kritische Schritte, die dieses Protokoll weniger methodisch belasten und die Gesamtausgabe der Daten verbessern. Die Methode zur Markierung dendritischer Stacheln ist eines der ersten Dinge, die Forscher berücksichtigen sollten, bevor sie mit diesem Protokoll beginnen. Probleme bei der Quantifizierung der Wirbelsäule können durch unzureichende Markierungsmethoden entstehen. Die Färbung bestimmter Proteine, die in geringen Mengen in den Spins exprimiert werden, kann zu Signalen führen, die für die Software zu niedrig sind. Es muss auch beachtet werden, dass eine Verzerrung durch die Verfolgung der hellsten fluoreszierenden Dendriten eingeführt werden kann. Es ist zwar unklar, ob verschiedene fluoreszierende Dendriten unterschiedliche physiologische Eigenschaften haben, aber es ist immer noch eine Einschränkung des Protokolls zu berücksichtigen. Darüber hinaus tritt in einigen transgenen Linien, wie z. B. der THY1-YFP-H-Linie, die Fluoreszenz in dendritischen Dornen erst um P21 auf. Damit ist diese Linie für Untersuchungen zu jüngeren Entwicklungszeitpunkten ungeeignet. Die Berücksichtigung der Methode, mit der Stacheln für den Untersuchungsweg markiert werden, ist kein trivialer Aspekt, da die Software ohne ausreichende Fluoreszenz die Benutzerfreundlichkeit verringert hat. In ähnlicher Weise muss die Bilderfassungshardware berücksichtigt werden. Es gibt einige Dateitypen, die sich als weniger kompatibel mit der Analysesoftware erweisen als andere. Insbesondere wurden ND2-Dateien als problematische Dateitypen für die effektive Nutzung der Software identifiziert. Die Softwareanbieter empfehlen die Konvertierung in Dateitypen wie JPEG2000, falls Probleme auftreten.

Auch die Gewebepräparation und die Bildaufnahme sind wichtige Schritte für eine qualitativ hochwertige Quantifizierung der Wirbelsäule. Die richtige Fixierung, das Schneiden und Einbetten von Geweben gewährleistet eine langlebige Probe mit minimalen Artefakten, die die Datenanalyse beeinträchtigen können. Bei der Bildgebung des Gewebes geht es auch nicht nur darum, Z-Stapel-Bilder des gesamten Hirnschnitts zu machen. Während der Bildgebung sollte es immer darum gehen, Stapel mit Dendriten für die Quantifizierung der Wirbelsäule zu erfassen. Ein Schwerpunkt sollte auf der Erfassung von Z-Stapeln liegen, die Dendriten enthalten, die leicht zu verfolgen sind. Ein dickerer Z-Stapel führt in der Regel zu mehr Hintergrunddendriten. Dies erschwert die effektive Verfolgung von Dendriten mit der Software. Wenn Sie sich während der Bildgebung zusätzliche Zeit nehmen, um bessere Kandidaten für die Ablaufverfolgung zu finden, sparen Sie mehr Zeit bei der Analyse der Wirbelsäulenquantifizierung. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Z-Stapel-Bilder die gesamten zu verfolgenden Dendriten enthalten. Wenn die Dendriten im Z-Stapel nur teilweise sichtbar sind, erweisen sich die Dendritenverfolgung und die Identifizierung der Wirbelsäule aufgrund des unvollständigen 3D-Renderings als schwierig und ungenau.

Die Verfolgung von Dendriten und die Erstellung eines genauen Profils der identifizierten dendritischen Stacheln kann ein mühsamer Prozess sein. Es gibt ein gewisses Maß an Nuancen. Bei der Dendritenverfolgung kann es vorkommen, dass die benutzergeführte Funktion nicht wie vorgesehen funktioniert. Gelegentlich werden die gerichteten Kernel nicht über ein bestimmtes Segment aufgefüllt oder beginnen nicht mit der Bestückung eines unerwünschten Segments. Eine Möglichkeit, dies zu umgehen, besteht darin, mit einer kleineren typischen Prozessbreite zu beginnen. Dadurch ist der Dendrit in der Software besser erkennbar und ermöglicht eine einfachere Rückverfolgung. Sollte der Richtungskern nicht vollständig bevölkert werden, wird ein Linksklick auf den Dendriten manuell platziert. Es wird zu einem sehr kleinen Punkt kommen und den Dendriten nicht füllen, aber das kann mit der Dickenanpassung korrigiert werden, wie in Schritt 3.8 des Protokolls beschrieben. Während Dendriten manuell verfolgt werden können, sollte sich die Software als unzureichend erweisen, ist die manuelle Verfolgung von Stacheln keine Fähigkeit der Software. Es wird Fälle geben, in denen ein deutlicher Rücken sichtbar zu sein scheint, aber egal wie hoch die Empfindlichkeit des Detektors ist, die Software wird ihn nicht erkennen. Eine Sache, die Sie überprüfen sollten, ist, ob sich die vermutete Wirbelsäule außerhalb des Bereichs befindet. Wenn es sich in Reichweite befindet, aber immer noch nicht von der Software identifiziert wird, wird dieses Rückgrat von der Analyse ausgeschlossen. Dies kann zwar selten vorkommen, ist aber eine Einschränkung, die es zu berücksichtigen gilt. Wie bei jeder Analyse, die eine Schwellenwertbestimmung und eine manuelle Klassifizierungskomponente erfordert, besteht die Möglichkeit, Verzerrungen einzuführen. Dieses Problem kann durch den Vergleich von Daten, die von mehreren Benutzern generiert wurden, noch verschärft werden. Der halbautomatische Charakter dieser Analyse versucht, die Einführung dieser Verzerrung zu minimieren, aber sie wird nicht vollständig beseitigt. In unserem Labor war eine Abweichung von 10 % zwischen den Forschern bei einem Standarddatensatz mit ausreichender Übung und Schulung angemessen. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um Verzerrungen zu minimieren, ist es immer noch wichtig, bei der Auswertung von Daten, die über dieses Protokoll generiert werden, die Voreingenommenheit zwischen Forschern zu berücksichtigen.

Unter Berücksichtigung der geringfügigen Nachteile der Software ist das Ergebnis der dendritischen Dornanalyse mit dieser Technik sehr robust. Wie bereits beschrieben, gibt es eine Vielzahl von Metriken, die aus einer genauen dendritischen Segmentverfolgung und der Identifizierung der Wirbelsäule extrapoliert werden können. Die Möglichkeit, Informationen über Spine-Subtypes zu erhalten, bietet wertvolle Einblicke auf einer tieferen Ebene als die grundlegenden Metriken. Diese Daten sind aufgrund der Interkonnektivität zwischen Struktur und Funktion wichtig. Jeder Spine-Subtype bezeichnet eine Funktion. Dünne Stacheln sind der vorherrschende Subtyp, der einen hohen Umsatz aufweist21. Dünne Stacheln haben auch das Potenzial, sich zu Pilzstacheln zu entwickeln38. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass Pilzstacheln stark mit Lernen und Gedächtnis verbunden sind38,39. Es wird außerdem angenommen, dass Stummelstacheln ein Bestandteil des Lernens sind, möglicherweise als Überbleibsel von Pilzstacheln40. Filopodien sind zwar in vielen adulten Geweben nicht weit verbreitet, aber Vorläufer der Wirbelsäule, die für die Entwicklung von zentralem Interesse sind41,42. Die 3D-Elektronenmikroskopie ist nach wie vor der Goldstandard für die genaueste Klassifizierung von Wirbelsäulen-Subtypen. Diese Technik ist zwar wertvoll, aber durch mühsames manuelles Sortieren und Klassifizieren begrenzt, die anfällig für menschliche Fehler sind. Das halbautomatische Design dieser Analyse reduziert die Fälle, in denen subjektive Verzerrungen eingeführt werden könnten. Obwohl es Nachteile in Bezug auf die absolute Auflösung und die Fluoreszenzintensität geben kann, die für perfekte Klassifizierungen in diesem Protokoll erforderlich sind, bietet es immer noch eine methodisch weniger anstrengende Alternative zur 3D-Elektronenmikroskopie und manuellen Klassifizierung. Darüber hinaus ist eine vollständige Dendritenanalyse mehrerer dendritischer Äste aus einem breiteren Spektrum von Hirnregionen mit der in dieser Arbeit beschriebenen Analyse möglich. Bei der Elektronenmikroskopie ist dies nicht der Fall. Durch die Verwendung dieses Protokolls ist es möglich, strukturzentrierte Fragestellungen in mehreren Disziplinen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf synaptische Plastizität, Entwicklung sowie neurologische und psychiatrische Störungen, auf zuverlässige und reproduzierbare Weise zu beantworten.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin und dem NIMH SNIR für ihre technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei der Bethesda Biomedical Research Study Group der Colgate University bedanken. Diese Arbeit wird durch das NIMH Intramural Program (1ZIAMH002881 bis Z.L.) unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
518F ImmersionsölZeiss444960-0000-000
KryostatLeicaCM3050SFür die Schnittvorbereitung
Feine PinzetteFST11150-10
HämostatenzangeFST13020-12
Große chirurgische SchereFST14002-16
LSM 880 KonfokalmikroskopZeissLSM 880
Mikroskop DeckglasFisherbrand12-541-035
Mini-Peristaltikpumpe IIHarvard Apparatur70-2027Für Perfusionen
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1Wirbelsäulenanalysesoftware
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1Wirbelsäulenanalysesoftware
OCT CompoundSakura Finetek4583Für Kryostatenschnitte
Paraformaldehyd (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Öl DICZeiss440762-9904-000
SkalpellklingeFST10022-00
Kleine chirurgische SchereFST14060-09
SpatelFST10091-12
SaccharoseFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus ObjektträgerDiaggerES4951+
Vectashield HardSet EindeckmediumVektor LaboratorienH-1400-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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