Maus-Wundmodelle und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

Zusammenfassung

Diese Studie stellt zwei entscheidende experimentelle Techniken vor: die Konstruktion eines murinen Wundmodells zur Beurteilung des Wundverschlusses und die Herstellung von einzelligen Suspensionen aus der Haut von Mäusen, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Zusammenfassung

Die Behandlung von akuten Hautverletzungen in voller Dicke stellt in der klinischen Praxis eine erhebliche Herausforderung dar. Die Komplexität der Wundheilung, an der verschiedene Zellpopulationen und die komplizierte Wundmikroumgebung beteiligt sind, erschwert die Bewertung von Behandlungseffekten und deren Wechselwirkungen mit herkömmlichen experimentellen Ansätzen. Die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierungstechnologie hat das Verständnis der zellulären Funktionen und Mechanismen während der Wundheilung revolutioniert. Die Variabilität der Methoden zur Erstellung von Mauswundmodellen führt jedoch zu Störfaktoren, die sich auf die experimentellen Ergebnisse auswirken können. Darüber hinaus stellt der Prozess der Dissoziation von Maushautgewebe erhebliche technische Hürden dar, was den dringenden Bedarf an hochwertigen Einzelzellsuspensionen für eine genaue Transkriptomsequenzierung unterstreicht. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Konstruktion von Mauswundmodellen zu optimieren, um Veränderungen des Wundverschlusses genau zu beurteilen und gleichzeitig Variablen zu eliminieren, die das nachfolgende Sequenzierungsergebnis beeinflussen könnten. Darüber hinaus wurde die Herstellung von Einzelzellsuspensionen sowohl unter Verwendung von Enzymvorbereitungsprotokollen als auch von Testkit-Protokollen durchgeführt, um Kosten und Wirksamkeit zu optimieren.

Einleitung

Die Maus ist ein weithin anerkanntes Tiermodell in der Forschung wegen ihrer hochgradig homologen genetischen Sequenz zum Menschen, der schnellen Fortpflanzung, der Kosteneffizienz und der überschaubaren Größe¹. Allerdings gibt es Unterschiede in der Hautstruktur zwischen Mäusen und Menschen. Mäuse haben eine ausgeprägte Hautmembranschicht, die zur Hautkontraktion beiträgt und eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung bei dieser Spezies spielt. Im Gegensatz dazu beinhaltet die Wundheilung beim Menschen in erster Linie die Reepithelisierung und die Bildung von Granulationsgewebe¹.

Trotz dieser Unterschiede in der Hautstruktur zwischen den Spezies bleibt das Mausmodell die bevorzugte Wahl in der Wundheilungsforschung und behält im Vergleich zu anderen Tiermodellen eine signifikante Bedeutung^2,3. Bei der Verwendung von Maushaut zur Nachahmung menschlicher Wundheilungsprozesse ist eine sorgfältige Abwägung verschiedener Einflussfaktoren unerlässlich. Zu diesen Faktoren gehören die Auswahl geeigneter Stellen für chirurgische Eingriffe, die Berücksichtigung des Follikelzyklus der Maushaare und das Verständnis der Auswirkungen der Hautmembrankontraktion^4,5. Die Implementierung entsprechender Maßnahmen ist von entscheidender Bedeutung, um die Versuchsbedingungen zu optimieren und die Genauigkeit der Beobachtungsergebnisse zu verbessern.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) sequenziert Zellen auf einem viel feineren Niveau als die herkömmliche RNA-Sequenzierung und stellt eine viel höhere Anforderung an die Probenqualität mit minimalen Unterschieden innerhalb der Gruppe. Es wurden mehrere Experimente durchgeführt, um ein stabiles Mausmodell für akute Hautdefekte in voller Dicke zu verfeinern. Diese Experimente nutzten eine Kombination aus etablierten Methoden aus der Literatur und innovativen Ansätzen, um die Wundheilung umfassend zu bewerten^2,5. Um das Wundheilungsmodell zu entwickeln, wurde die Exzision der Haut von Mäusen in voller Dicke verwendet, um den physiologischen Prozess der Wundheilung und -regeneration zu replizieren. Ziel war es, die potenziellen Veränderungen zu bewerten, die durch verschiedene Behandlungen mit scRNA-seq induziert werden. Die Dissoziation von Hautgewebe bei Mäusen stellt bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen eine Herausforderung dar, einschließlich geringer Zellviabilität und hoher Aggregationsraten⁶. Diese Schwierigkeiten können zu Problemen wie Verstopfungen des Geräts und anomaler Zellenerfassung führen, die die Datenqualität beeinträchtigen können. Angesichts der erheblichen Kosten der Einzelzellsequenzierung ist die Durchführung mehrerer Vorversuche von entscheidender Bedeutung, um die Stabilität und Zuverlässigkeit der Einzelzellsuspension zu gewährleisten. In dieser Studie wurde die Wirksamkeit der Dissoziation gemischter Enzyme und der Dissoziationsmethode des Gewebekits untersucht, um den optimalen Ansatz für die Dissoziation des Gewebes zu identifizieren^6,7. Diese Studie schafft eine solide Grundlage für weitere vertiefende Untersuchungen.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des siebten medizinischen Zentrums des chinesischen PLA General Hospital, China, genehmigt. Es wurden männliche C57/BL6-Mäuse im Alter von 6 Wochen verwendet.

1. Modell zur Heilung von Mauswunden

1. Gruppierung von Tieren
   1. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip Versuchs- und Kontrollgruppen (jeweils 6) zu. Unterbringen Sie Mäuse in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Tiereinrichtung mit einer Temperatur von 23-25 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 50 % bis 60 % und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
   2. Bieten Sie Mäusen uneingeschränkten Zugang zu Standardfutter und autoklaviertem Leitungswasser.
2. Präoperative Vorbereitung
   1. Halten Sie die Maus vorsichtig mit einem Rückhaltesystem fest oder halten Sie die Maus sicher in Bauchlage. Füllen Sie die Spritze mit 1 % Pentobarbital-Natrium, das auf Raumtemperatur wiederhergestellt wurde, und verabreichen Sie es in einer Dosis von 0,1 ml/20 g Körpergewicht.
      HINWEIS: Die 1%ige Pentobarbital-Natriumlösung sollte in einer dunklen Umgebung bei 4 °C gelagert werden.
   2. Reinigen Sie den Bauch der Maus mit Alkohol-Wattestäbchen. Führen Sie die Spritze in einem leichten Winkel in den Bauch ein. Vor der Injektion aspirieren, um eine versehentliche Verabreichung in die Blase oder den Darm zu verhindern. Warten Sie 10 Minuten.
   3. Nachdem die Maus aufhört zu zucken und nicht mehr auf Reize reagiert, tragen Sie weißes Vaseline auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Verwenden Sie einen Rasierer, um längeres Rückenfell zu kürzen.
   4. Tragen Sie Enthaarungscreme auf den Rücken auf, warten Sie 2 Minuten und wischen Sie sie vorsichtig mit feuchter Gaze ab, um die Haut der Maus nicht zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass die Enthaarungscreme nicht über einen längeren Zeitraum einwirkt.
   5. Desinfizieren Sie die umliegende Haut sanft mit drei abwechselnden Tupfern Betadin und 70% Alkohol.
   6. Autoklavieren Sie Hautbiopsienstanze, Scheren, Pinzetten und andere Instrumente für die Sterilisation. Pflegen Sie einen sterilen Arbeitsbereich. Führen Sie die anschließende Operation mit einem frischen OP-Tuch durch.
3. Exzision der Haut in voller Dicke
   HINWEIS: Das Wundschienenmodell wurde verwendet, um die Wirksamkeit der Behandlung für die Wundheilung zu beurteilen.
   1. Markieren Sie mit einem Permanentmarker den oberen mittleren Bereich des Rückenbereichs der Maus mit einem Kreis von 8 mm Durchmesser.
   2. Heben Sie die Rückenhaut mit einer sauberen Pinzette an und machen Sie den ersten Schnitt mit einer feinen chirurgischen Schere. Halten Sie nach dem ersten Schnitt die teilweise entfernte Hautpartie mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die markierten Kreise vorsichtig aus.
   3. Verwenden Sie einen speziell angefertigten Edelstahlring (Innendurchmesser 15 mm, Außendurchmesser 18 mm). Den Metallring mit 5-0 nicht resorbierbaren Nähten an die Peripherie der Inzisionsstelle nähen, um eine Kontraktion der Haut an der Inzisionsstelle zu verhindern (Abbildung 1A). Verwenden Sie Edelstahl als Ringmaterial, um Rost und Verformung zu vermeiden.
   4. Verabreichen Sie eine einzelne subkutane Injektion von 0,1 ml mit 10 % Buprenorphinhydrochlorid-Verdünnung in der Nähe der Wunde, um postoperative Schmerzen zu behandeln.
   5. Führen Sie die Maus wieder ein, um einzelne Käfige zu reinigen. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bevor die Maus wieder zu Bewusstsein kommt.
   6. Beobachten und fotografieren Sie die Mauswunde alle 2 Tage, um die Wundgröße nach der Anästhesie, wie in Schritt 1.2 beschrieben, zu messen.
4. Wundstempelmarkierung zur Gewinnung von Biopsiegewebe
   1. Bereiten Sie sich auf das Experiment vor, wie in den Schritten 1.1 und 1.2 beschrieben.
   2. Erstellen Sie benutzerdefinierte Markierungsstempel für Mauswunden mit einem Kreisdurchmesser von 8 mm und einer quadratischen Seitenlänge von 10 mm (Abbildung 1B).
   3. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage und desinfizieren Sie die Rückenhaut mit alkoholischen Wattestäbchen. Tauchen Sie den Stempel in Tinte. Markieren Sie den oberen mittleren Teil des Rückens der Maus mit dem Stempel.
   4. Schneiden Sie vorsichtig die gesamte Hautschicht des Rückens entlang der kreisförmigen Markierung mit einer chirurgischen Schere heraus und legen Sie die Muskelschicht vollständig frei. Lassen Sie die Wunde ohne Verband offen, um den Zustand der Wunde nicht zu beeinträchtigen. Halten Sie die Sterilität der Wunde aufrecht, indem Sie die Maus in eine saubere und desinfizierte Umgebung bringen und die Wunde auf natürliche Weise einen Schorf bilden lassen.
   5. Verabreichen Sie eine einzelne subkutane Injektion von 0,1 ml mit 10 % Buprenorphinhydrochlorid-Verdünnung in der Nähe der Wunde, um postoperative Schmerzen zu behandeln.
   6. Führen Sie die Maus wieder ein, um einzelne Käfige zu reinigen. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bevor die Maus wieder zu Bewusstsein kommt.
   7. Beobachten und fotografieren Sie die Mauswunde alle 2 Tage, um die Wundgröße nach der Anästhesie, wie in Schritt 1.2 beschrieben, zu messen.
   8. Die Behandlung wird wie in 1.4 beschrieben durchgeführt
   .
5. Verabreichung der Behandlung
   1. 4 Stunden, nachdem die Maus das Bewusstsein wiedererlangt hat, führen Sie eine Anästhesie durch, wie in den Schritten 1.2.2-1.2.3 beschrieben.
   2. Subkutan injizieren Sie die gewünschte Behandlung, hier 100 μg mesenchymales Stammzell-Exosom (hucMSC-Exo) des menschlichen Nabelschnurnabelschnurs, gelöst in 200 μl PBS um die Inzisionsstelle für die Behandlungsgruppe.
   3. Injizieren Sie subkutan 200 μl PBS um die Inzisionsstelle für die Kontrollgruppe.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.2 und 1.5.3 alle zwei Tage für bis zu 14 Tage. Untersuchen Sie die Injektionsstelle auf Schwellungen, Rötungen oder Anzeichen einer Infektion.

2. Vorbereitung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

1. Gewebeentnahme und -aufbereitung
   1. Führen Sie die Anästhesie wie in den Schritten 1.2.2-1.2.3 beschrieben durch.
   2. Heben Sie die Rückenhaut mit einer sauberen Pinzette an und entfernen Sie den Schorf. Schneiden Sie etwa 2 cm² der Haut in der Nähe der Wunde ab und schneiden Sie Fettgewebe und große Blutgefäße ab.
   3. Übertragen Sie die Hautbiopsie mit einer sterilen Pinzette in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit vorgekühlten 4 mL PBS gefüllt ist.
   4. Waschen Sie mit PBS, indem Sie die Biopsie nacheinander in neue Vertiefungen (6-Well-Platte) übertragen, die mit 4 ml PBS gefüllt sind, bis kein sichtbares Blut mehr vorhanden ist.
   5. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell in ca. 2 mm große Stücke, waschen Sie sie weiter in DPBS mit 0,04 % BSA und entfernen Sie alle Ablagerungen.
2. Enzymatische Dissoziation (Abbildung 2)
   1. Kombinieren Sie 1 ml Kollagenase I (10 mg/ml), 1 ml Kollagenase IV (5 mg/ml), 1 ml Kollagenase D + Dispase II (15 mg/ml), 1 ml DNase I (5 mg/ml) und 6 ml DPBS in einem sterilen konischen Röhrchen, um die Aufschlusslösung herzustellen. Mischen Sie die Komponenten gründlich, um die Homogenität zu gewährleisten.
   2. Stellen Sie das konische Rohr für 10 Minuten in ein auf 37 °C eingestelltes Wasserbad, um die Aufschlusslösung vorzuwärmen.
   3. Geben Sie 2,5 ml Aufschlusslösung in das Gewebe und verdauen Sie es 70 Minuten lang bei 37 °C, wobei Sie das Reagenzglas alle 10 Minuten wenden, um es gründlich zu mischen.
   4. Ein 70 μm Sieb mit Waschpuffer (0,2 % BSA in PBS) vorbefeuchten. Übertragen Sie das Reaktionsgemisch, einschließlich dissoziierter Zellen und restlicher Gewebefragmente, mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit breiter Bohrung auf das Sieb.
   5. Filtrieren Sie diese Mischung durch das vorfeuchte 70-μm-Zellsieb in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen.
   6. Das Reaktionsgemisch mit verdautem Gewebe bei 300 x g, Raumtemperatur für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet (die Zellen) für den nächsten Dissoziationsschritt aufbewahren.
3. Lyse der roten Blutkörperchen
   1. Verdünnen Sie die Lyselösung für rote Blutkörperchen (10x) im Verhältnis 1:10 mit doppelt destilliertem Wasser. Verdünnen Sie die Zellen mit 1x Erythrozyten-Lyselösung im Verhältnis 1:10 in einem konischen Röhrchen.
   2. Die Mischung 5 s lang vortexen, 2 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann 5 min bei 300 x g zentrifugieren. Den Überstand aspirieren, die Zellen in DPBS gleichen Volumens resuspendieren und auf Eis lagern.
4. Filtrierung
   1. Entnehmen Sie die Zellsuspension und filtrieren Sie sie durch ein 40-μm-Sieb in ein neues konisches Röhrchen.
   2. Spülen Sie das Röhrchen 2x mit 4,5 mL RPMI (10 % FCS), um die Entnahme aller verbleibenden Zellen sicherzustellen.
   3. Fahren Sie fort, die Zellsuspension bei 300 x g bei Raumtemperatur 5 Minuten lang zu zentrifugieren.
   4. Entsorgen Sie den Überstand, schnippen Sie vorsichtig mit dem Pellet und resuspendieren Sie die Zellen mit breiten Spitzen in 50 μl 0,04 % BSA PBS. Halten Sie die Zellen während dieses Prozesses auf Eis.
5. Entfernung abgestorbener Zellen
   1. Mischen Sie das Totzellenentfernungskit 20x Stammpuffer mit nukleasefreiem Wasser im Verhältnis 1:20, um einen 1x Bindungspuffer zu erhalten.
   2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 μl Mikrokügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen für 60 mg Hautprobe hinzu.
   3. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie Stammpuffer hinzu, bis er 500 μl erreicht. Laden Sie die Probe in die vorbereitete Säule des Kits und befestigen Sie sie am Dissoziator.
   4. Führen Sie das Dissoziatorprogramm aus, um lebende Zellen zu trennen. Nach Beendigung des Programms wird die Suspension durch einen 30-μm-Filter filtriert und mit gleichem Volumen D-PBS.
      HINWEIS: Wenn sich die Tropfgeschwindigkeit merklich verlangsamt, tauschen Sie die Säule sofort aus, um zu verhindern, dass Verunreinigungen die Poren verstopfen und die Zellregeneration beeinträchtigen.
   5. Führen Sie die Färbung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) und die Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler durch. Verwenden Sie die folgenden Akzeptanzkriterien: Zellviabilität ≥ 85 %, Zellaggregationsrate < 20 % und keine sichtbaren roten Blutkörperchen oder Zellfragmente.
6. Dissoziationsverfahren für das Multigewebe-Dissoziationskit (Alternative)
   1. Mischen Sie 2,5 ml RPMI 1640, 100 μl Enzym D, 50 μl Enzym R und 12,5 μl Enzym A1 in ein schonendes MACS C-Röhrchen (Komponenten aus dem Multi Tissue Dissociation Kit).
   2. Übertragen Sie das Gewebe in das sanfte MACS C-Röhrchen mit dem Enzymmix und verschließen Sie es fest.
   3. Legen Sie das Röhrchen bei 37 °C für 90 Minuten in ein Wasserbad mit sanfter Inversion alle 10 Minuten, um eine ausreichende Exposition des Gewebes mit der Dissoziationslösung zu gewährleisten.
   4. Entsorgen Sie die Dissoziationslösung und waschen Sie das Taschentuch mit DPBS.
   5. Einzelzellsuspensionen nacheinander durch 70 μm und 40 μm Zellsiebe passieren und 10 min bei 4 ΰC bei 300 x g zentrifugieren.
   6. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit dem Reagenz für die Lyse roter Blutkörperchen nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.3.
   7. Entfernen Sie tote Zellen mit dem Kit zur Entfernung toter Zellen nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.5⁸.
   8. Führen Sie AO/PI-Färbung und Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler durch. Verwenden Sie die folgenden Akzeptanzkriterien: Zellviabilität ≥ 85 %, Zellaggregationsrate < 20 % und keine sichtbaren roten Blutkörperchen oder Zellfragmente.

Ergebnisse

Es wurden mehrere Variationen des Verfahrens untersucht. Stanzprotokolle wurden bevorzugt, da sie die Wundheilung nur minimal beeinträchtigen und die Wundintegrität gegenüber Störungen wie Kratzen und Nähten bewahren. Dies dient dazu, Störgrößen auf Einzelzell-Ebene bei der nachfolgenden Sequenzierung zu vermeiden. Die Anlage von Wunden auf beiden Seiten einer Maus führte aufgrund der inhärenten Elastizität der Mäusehaut zu erkennbaren Unterschieden in der Wundfläche (Abbildung 3A,B<...

Diskussion

Mehrere entscheidende Schritte waren für den Erfolg des Protokolls unerlässlich. Zu diesen Schritten gehörten die präzise Vorbereitung des Wundbereichs durch gründliches Rasieren und Reinigen, das Anlegen standardisierter Wunden bestimmter Größe und Tiefe sowie die sorgfältige Nachsorge nach der Wunde, um Infektionen zu überwachen und geeignete Behandlungen durchzuführen. Die Standardisierung dieser Verfahren gewährleistete die Konsistenz unter allen experimentellen Bedingungen und erhöhte dadurch die Zuverlässigkeit und...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
75% Alcolchol	Liuhe	JIUJING500ML
C57/BL6J Mäuse	Charles River Laboratories
Kollagenase D + Dispase II	Roche	11088858001
Kollagenase I	Roche	5349907103
Kollagenase IV	Roche	5267439001
Wattestäbchen	Haishi	MIANQIAN
Kit zur Entfernung toter Zellen	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNase I	Roche	10104159001
gentleMAC Dissoziator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Medizinischer Nylonfaden	Jinlong	HM507
Multigewebe-Dissoziationskit 1	Miltenyi Biotec	130-110-201
Stanze Biopsienadel	Integra Miltex
Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen	Miltenyi Biotec	130-094-183
Chirurgische Schere	Jinglu	JIANDAO
Weißes Vaseline	Shangyuan	BAIFANSHILIN