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Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

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DOI:

10.3791/66503

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10. Mai 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Plattenepithel der Speiseröhre ist direkt der Umwelt ausgesetzt und ständig fremden Antigenen, einschließlich Lebensmittelantigenen und Mikroben, ausgesetzt. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Epithelbarriere ist entscheidend für die Vorbeugung von Infektionen und die Vermeidung von Entzündungen, die durch harmlose Antigene aus der Nahrung verursacht werden. Dieser Artikel enthält vereinfachte Protokolle für die Generierung von humanen Organoiden der Speiseröhre und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen aus Patientenbiopsien, um das epitheliale Kompartiment der Speiseröhre im Zusammenhang mit Gewebehomöostase und -krankheit zu untersuchen. Diese Protokolle waren in den letzten zehn Jahren bedeutende wissenschaftliche Meilensteine und beschreiben dreidimensionale organähnliche Strukturen aus patientengewonnenen Primärzellen, Organoiden und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Sie bieten die Möglichkeit, die Funktion spezifischer Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signalwege im Ösophagepithel in einem dreidimensionalen Rahmen unter Beibehaltung der phänotypischen und genetischen Eigenschaften des Spenders zu untersuchen. Organoide liefern Informationen über die Mikroarchitektur des Gewebes, indem sie das Transkriptom und Proteom nach Zytokinstimulation bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglichen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen die Beurteilung der Integrität der epithelialen Barriere durch Messungen des transepithelialen Widerstands (TEER) oder des Makromolekülflusses. Die Kombination dieser Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu beeinträchtigten Bedingungen der epithelialen Barriere der Speiseröhre voranzutreiben.

Einleitung

Eine Entzündung der Speiseröhre beeinträchtigt die Integrität der Epithelbarriere 1,2,3,4,5, wie bei der eosinophilen Ösophagitis (EoE), einer Th2-dominierten chronischen Entzündungserkrankung der Speiseröhre6, beobachtet wird. EoE wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben 7,8 und wird überwiegend durch die Lebensmittelantigene 9,10,11,12,13 induziert. Die am häufigsten auftretenden Symptome von EoE in der erwachsenen Bevölkerung sind Dysphagie und Nahrungsmittelimpaktion14. Bei Kindern manifestiert sich EoE typischerweise mit Gedeihstörungen, Nahrungsverweigerung, Erbrechen und Bauchschmerzen15. Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben EoE-Risikogene identifiziert, die an der Integrität der Epithelbarriere beteiligt sind, wodurch das Epithel in den Fokus der EoE-Forschung gerücktist 16,17,18. Die EoE-Transkriptomik zeigte weiterhin, dass ein gestörter Differenzierungsprozess und eine reaktive Basalzonenhyperplasie die beeinträchtigte Barrierefunktion des Ösophagepithels verursachen 3,5,19,20,21,22. Das frühe Verständnis, dass EoE eine Th2-vermittelte Erkrankungist 6, führte zur Entdeckung von IL-13 als treibender Mediator durch Störung der epithelialen Integrität 3,4,21,23. Experimentelle Systeme, die es ermöglichen, Zytokin-vermittelte Effekte auf die Epithelintegrität von intrinsischen Barrierebeeinträchtigungen durch genetische Prädisposition zu disparieren, bieten die Möglichkeit, das komplexe Zusammenspiel zwischen Immunzellen und Epithel in EoE zu untersuchen. Humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) wurden als wertvolle Werkzeuge vorgeschlagen, um die Auswirkungen der Zytokinstimulation auf die epitheliale Integrität zu analysieren5.

Das erste Protokoll zur Generierung adulter gewebespezifischer Stammzellen (ASC)-abgeleiteter Ösophagus-Organoide wurde fünf Jahre nach den ersten veröffentlichten Berichten über Darmorganoide im Jahr 2009 etabliert, bei denen intestinale Lgr5+-ASCs verwendet wurden, die das Epithelkompartiment des Dünndarms rekapitulieren24. DeWard et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Organoiden aus murinen Ösophagus-Epithelzellen25. Im Jahr 2018 erzeugten Kasagi et al. humane Ösophagus-Organoide aus der immortalisierten humanen Plattenepithelzelllinie EPC2-hTERT und primären patienteneigenen Zellen26. Im selben Jahr gelang es Zhang et al., aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Organoide der Speiseröhre zu erzeugen. Sie skizzierten die Bedeutung der Hemmung von TGFβ und knochenmorphogenetischem Protein (BMP) für die Entwicklung von Vorläuferzellen der Speiseröhre (EPC) und die entscheidende Rolle des Notch-Signalwegs bei der Differenzierung des geschichteten Plattenepithels26,27. Trisno und Kollegen ergänzten diese Befunde, indem sie Sox2 als Wnt-Inhibitor identifizierten, der das Entwicklungsschicksal in Richtung Ösophagusdifferenzierung lenkt28. Die anschließende Verfeinerung der Protokolle, der Zusammensetzung des Mediums und der Kulturbedingungen erhöhte die Organoidbildungsrate und ermöglichte die Subkultivierung und Rückgewinnung von Organoiden nach der Kryokonservierung 26,29,30,31,32. Obwohl diese Organoide leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Gewebearchitektur und der Expression potenzieller Zielgene nach Stimulation mit Zytokinen sind, bieten Organoide der Speiseröhre nicht die Möglichkeit, den transepithelialen Widerstand (TEER) oder den Makromolekülfluss als direkte Messungen für die Barriereintegrität zu messen. Wie zuvor von Sherrill und Kollegen22 beschrieben, ermöglichen ALI-Kulturen, die die epitheliale Differenzierung4 modellieren, eine direkte Beurteilung der epithelialen Integrität. Die Kombination von patienteneigenen Organoiden und ALI-Kulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Gewebearchitektur und der Integrität der Epithelbarriere bei EoE.

Hier finden Sie Verfahren mit Anweisungen zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Ösophagusbiopsien und zur Etablierung von Organoid- und ALI-Kulturen der Speiseröhre, die weiter verwendet werden können, um die Auswirkungen von Zytokinen auf die Integrität der Barriere zu untersuchen.

Protokoll

Die Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alle Patienten gaben vor der endoskopischen Untersuchung eine schriftliche Einverständniserklärung für den experimentellen Einsatz von Biopsien ab. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellisolierung von patienteneigenen Organoiden der Speiseröhre

ANMERKUNG: Eine Liste der Bestandteile des Mediums für die Kultivierung humaner Organoide der Speiseröhre ist in Tabelle 1 enthalten.

  1. Besorge dir die Biopsien.
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden zwei Biopsien aus einem Speiseröhrensegment während der Ösophagogastroduodenoskopie mit einer Biopsiezange unter Verwendung eines Gastroskops mit einem 2,8-mm-Arbeitskanal gewonnen.
  2. Überführen Sie die Biopsien in ein kommerziell erhältliches keratinozytenserumfreies Medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    HINWEIS: Biopsien können bis zur Verwendung mehrere Stunden auf Eis gelagert werden.
  3. Ersetzen Sie das KSFM-Medium durch 1 mL Dispase I (10 U/mL) und inkubieren Sie die Biopsien 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.
  5. Aspirieren Sie die Dispase mit einer 1000-μl-Pipette, ohne die Biopsien und das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.
  6. Spülen Sie die Biopsien mit 1 mL Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
  7. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.
  8. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.
  9. Inkubieren Sie die Biopsien mit 500 μl Trypsin-EDTA (0,05%) bei 37 °C für 10 min und schütteln Sie bei 800 U/min.
  10. Führen Sie den mechanischen Aufschluss durch wiederholtes Auf- und Ab-Pipettieren durch, bis eine einzellige Suspension erhalten wird.
  11. Filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb mit dem Gummikolbenkopf einer Tuberkulinspritze.
  12. Waschen Sie das Sieb mit 2-4 mL Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (250 μg/mL).
  13. Filtern Sie die Zellen durch ein 35-μm-Zellsieb mit einer Schnappkappe auf einem 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
  14. Übertragen Sie die einzellige Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  15. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  16. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.
  17. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl KSFM-Medium.
  18. Mischen Sie 10 μl Trypanblau mit 10 μl Zellsuspension.
  19. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.

2. Vom Patienten stammende Organoidkultur

  1. Geben Sie nach der Zählung 1-2 ml KSFM in die Zellsuspension.
  2. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  3. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000 μL-Pipette, ohne das Zellpellet zu stören.
  4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einer Hydrogel-Matrix aus Basalmembranextrakt (BME) (40 μl BME pro 20.000 Zellen).
    HINWEIS: Halten Sie die Zellen nach der Zugabe des BME auf Eis, um eine vorzeitige Verfestigung des BME zu verhindern.
  5. Schneiden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze ab, um das viskose BME-Zell-Suspensionsgemisch abzusaugen.
  6. Bilden Sie 40 μl Tröpfchen in einer vorgewärmten (37 °C) Suspensionszellkulturplatte.
  7. Inkubieren Sie die Platte ohne Medium für 20-30 min bei 37 °C, um eine Verfestigung der BME-Tröpfchen zu gewährleisten.
  8. In den ersten beiden Kulturtagen wird vorgewärmtes KSFM-C-Medium, das mit 10 μM Y27632 (ROCK-Inhibitor) ergänzt wird, zugegeben.
  9. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch ein neues KSFM-C-Medium (ohne Y27632 und +/- Zytokin von Interesse).
  10. Aspirieren Sie das Medium und kratzen Sie die Tröpfchen mit der Pipettenspitze ab, während Sie kontinuierlich 1 ml Dispase II (1,5 U/ml) in die Vertiefung geben.
  11. Das BME-Dispase-Gemisch in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen und 20 min bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad inkubieren, um das BME zu verdauen.
  12. Bei 250 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren und die Dispase II aspirieren.
  13. Gehen Sie gemäß dem Protokoll der Interessenauslesung vor (z. B. RNA-Isolierung, Proteinisolierung oder Fixierung mit 4 % PFA für die Histologie).

3. Zellisolierung für vom Patienten stammende Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen (ALI)

  1. Besorge dir die Biopsien. Bei der Ösophagogastroduodenoskopie mit einem Gastroskop mit einem 2,8-mm-Arbeitskanal werden mit einer Biopsiezange zwei Biopsien aus einem Speiseröhrensegment entnommen.
  2. Geben Sie die Biopsien in ein kommerziell erhältliches keratinozyten-serumfreies Medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) und bis zur Verwendung mehrere Stunden auf Eis lagern.
  3. Tauschen Sie KSFM durch 1 mL Dispase (10 U/mL) aus. Inkubieren Sie die Biopsien anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.
  5. Entfernen Sie die Dispase mit einer 1000-μl-Pipette, ohne die Biopsien und das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.
  6. Waschen Sie die Biopsien mit 1 mL DPBS.
  7. Bei Raumtemperatur die Biopsien bei 300 x g für 2 min herunterschleudern.
  8. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.
  9. Inkubieren Sie die Biopsien in 500 μl Trypsin-EDTA (0,05%) bei 37 °C für 10 min und mischen Sie sie während der Inkubation kontinuierlich bei 800 U/min.
  10. Unterbrechen Sie die Biopsien mechanisch durch wiederholtes Auf- und Ab-Pipettieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird.
  11. Führen Sie die dissoziierten Zellen durch ein 70 μm Zellsieb mit einem Gummikolbenkopf aus einer Tuberkulinspritze und sammeln Sie die Zellen in einem konischen 50 mL Röhrchen.
  12. Waschen Sie das Sieb mit 2-4 mL Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (250 μg/mL), um die restlichen Zellen aus dem Sieb zu entfernen.
  13. Filtern Sie die Zellen mit einem 35-μm-Zellsieb-Schnappverschluss in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
  14. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  15. Bei 300 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren.
  16. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000-μl-Pipette.
  17. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 mL KSFM-Medium (Ca2+ 0,09 mM), einschließlich 10 μM Y27632.
  18. Übertragen Sie die Zellen in einen T25-Zellkulturkolben.
  19. Um die primären Keratinozyten zu erweitern, kultivieren Sie die Zellen etwa 1 Woche lang bis zu 60%-80% Konfluenz.
    HINWEIS: Passage (P)0 bildet inselartige Zellkonglomerate und ist keine Monoschicht. Primäre Keratinozyten bilden ab P1 Monoschichten.
  20. Passage bei 60 %-80 % Konfluenz und erneute Aussaat von P1 in 2-3 T25 oder 1-2 T75 Zellkulturflaschen.
  21. Wieder Passage P1, wenn Keratinozyten eine Monoschicht mit 60%-80% Konfluenz bilden.

4. Vom Patienten stammende Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur (ALI)

  1. Säen Sie primäre P2-Keratinozyten auf Transwell-Inserts für die ALI-Kultur.
    HINWEIS: 400.000 Zellen in 12 Well-Inserts (200.000 Keratinozyten pro 0,6 cm2) in 500 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/ml BPE) aussäen.
    1. 150.000 Zellen in 24 Well-Inserts (155.000 Keratinozyten pro 0,5 cm2) in 100 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) säen.
    2. Alternativ können Sie die gefrorenen Zellen im KSFM-Medium (Ca2+ 0,09 mM + 10 % DMSO) bei -80 °C für 24 h einfrieren und anschließend für die spätere Verwendung in flüssigen Stickstoff überführen.
      HINWEIS: Bei Verwendung von gefrorenen Fläschchen die Passage nach dem Auftauen erneut durchführen, bevor die Zellen für die ALI-Kultur verwendet werden.
  2. Geben Sie Medium in die untere Vertiefung unter dem Einsatz der Transwell-Kulturplatte.
    HINWEIS: Für 12-Well-Platten: 1,5 mL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Für 24-Well-Platten: 600 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. Ersetzen Sie das mittlere bis hohe Kalzium KSFM (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) nach 2 Tagen.
  4. Wechseln Sie das kalziumreiche KSFM-Medium jeden zweiten Tag bis zum 7. Tag.
  5. Führen Sie an Tag 7 einen Lufttransport durch, indem Sie das Medium aus der oberen Kammer ansaugen und das Medium in der unteren Kammer durch KSFM mit hohem Calciumgehalt (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) mit 10 ng/mL KGF (= FGF7), 75 μg/mL Ascorbinsäure (AA) ersetzen.
    1. Optional: Geben Sie das gewünschte Zytokin in der gewünschten Konzentration in das Medium.
  6. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag.

5. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)

  1. Sterilisieren Sie die Elektrode des TEER-Messgeräts, indem Sie sie 10-15 Minuten lang in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 5 % Natriumhypochlorit eintauchen.
  2. Waschen Sie das 5%ige Natriumhypochlorit ab, indem Sie die Elektrode in 4 aufeinanderfolgende Vertiefungen mit sterilem ddH2O eintauchen und die Elektrode an der Luft trocknen lassen.
  3. Setzen Sie den Rohling fest, indem Sie eine Elektrode in die Vertiefung und die zweite Elektrode in den Transwell-Einsatz einsetzen, ihn mit PBS füllen und den TEER messen.
    HINWEIS: Empfohlene Volumina für TEER-Messungen: Für 12-Well-Platten (1900 μl im Well und 900 μl im Einsatz). Für 24-Well-Platten (750-1000 μl im Well und 250 μl im Einsatz).
  4. Ersetzen Sie das Medium der ALI-Kulturen durch steriles PBS bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Entfernen Sie das Medium aus der unteren Vertiefung und in einem zweiten Schritt aus dem Transwell-Einsatz. Geben Sie PBS in ähnlicher Weise zuerst in den Einsatz und dann in die untere Vertiefung, um eine Ablösung der ALI-Kultur von der Transwell-Membran zu verhindern.
  5. Platzieren Sie die TEER-Meterelektroden in den Experimentiervertiefungen mit ALI-Kulturen und führen Sie die TEER-Messung1 durch.
    HINWEIS: Führen Sie TEER-Messungen jeden zweiten Tag durch, bevor das Medium gewechselt wird.

6. Makromolekularer Fluss

  1. Die FITC-Dextran (3-5 kDa) Stammlösung wird auf eine Arbeitskonzentration von 1 mg/ml verdünnt.
    HINWEIS: Schützen Sie FITC-Dextran immer vor Lichteinwirkung.
  2. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe mit abnehmender FITC-Konzentration (1000 μg/mL bis 0,25 μg/mL) als Standard für die Ablesung vor.
  3. Geben Sie 500 μl FITC-Dextran-Lösung (1 mg/ml) in die obere Kammer des Transwells und 1,5 ml Medium (+/- Zytokin von Interesse) in das untere Fach und stellen Sie die Platte in den Inkubator.
  4. Sammeln Sie 120 μl Medium aus dem unteren Fach zu den jeweiligen Zeitpunkten (z. B. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min und 180 min).
  5. Pipettieren Sie Duplikate (50 μl/Well) jedes Zeitpunkts in eine schwarze, transparente 96-Well-Platte mit flachem Boden.
  6. Stimulieren Sie das FITC-Dextran bei 490 nm und lesen Sie die Emission bei einer Wellenlänge von 520 nm mit einem Plattenleser ab.
  7. Berechnen Sie die Menge des makromolekularen Flussmittels gemäß der Norm.

Ergebnisse

Organoide der Speiseröhre wachsen aus Primärzellen, die aus Patientenbiopsien gemäß den Anweisungen des bereitgestellten Protokolls extrahiert wurden, wie mit einem inversen Hellfeldmikroskop dokumentiert (Abbildung 1). Epithel-ASCs beginnen innerhalb der ersten zwei Tage der Kultur mit der selbstorganisierenden Bildung von Zellclustern, nachdem sie die isolierten Zellen in den Basalmembranextrakt eingesät haben, der als Gerüst dient. Die Größe und Anzahl der Zellcluster, die mit einem inversen Hellfeldmikroskop erkennbar sind, nehmen innerhalb der ersten Woche kontinuierlich zu (Abbildung 2). Zu diesem Zeitpunkt fehlt den Zellclustern jedoch die zwiebelartige Struktur, die für das mehrschichtige Plattenepithel eines ASC-abgeleiteten Ösophagus-Organoids charakteristisch ist. Am 9. Tag der Kultur werden die zwiebelartige mehrschichtige Struktur und ein wachsender keratinisierter Kern im Zentrum des Organoids sichtbar (Abbildung 2A). Die Organoidkultur kann bis zu 21 Tage aufrechterhalten werden26. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Organoide zwischen dem 11. und dem 14. Tag ihre volle Reife und maximale Größe erreichen. Ab dem 11. Tag ist der Kulturprozess überwiegend durch das Fortschreiten der Verhornung und die Reduktion metabolisch aktiver, lebensfähiger Zellen gekennzeichnet 5,26. Der optimale Zeitpunkt für die Entnahme von Organoiden für Experimente hängt also vom gewünschten Differenzierungsstadium ab und liegt zwischen 5 und 11 Tagen.

Bis zu 3 Passagen sind möglich, bevor die Organoide aufhören zu wachsen, da der zunehmende Keratinkern die Anzahl der lebensfähigen Zellen reduziert. Die Organoide können an den gewünschten Tagen für die RNA- oder Proteinisolierung geerntet werden, um die Gen-/Proteinexpression zu analysieren oder für die Histologie und das Biobanking.

Die ersten Schritte zur Zellisolierung für die ALI- und die Organoidkultur sind identisch. Bevor die ALI-Kultur etabliert werden kann, müssen die frisch isolierten Primärzellen im Gegensatz zum Organoid-Protokoll expandiert werden. Nach der zweiten Passage werden die primären Keratinozyten auf Transwell-Inserts ausgesät und in einem Medium mit niedriger Kalziumkonzentration kultiviert, um die Bildung von Monoschichten zu induzieren und eine vorzeitige Differenzierung der isolierten primären Keratinozyten zu verhindern. Nach 48 Stunden, wenn eine konfluente Monoschicht gebildet wird, wird die Kalziumkonzentration des Mediums auf 1,8 mM erhöht, was zu einer Differenzierung und Schichtung der Epithelschicht führt. Nach 7 Tagen wird durch die Luftbrücke die apikale Seite des mehrschichtigen Epithels der Luft ausgesetzt, um eine Verhornung zu verursachen. Die ALI-Kulturen können in der Regel bis zu 14 Tage aufbewahrt werden (Abbildung 2B). TEER-Messungen und makromolekulare Flussexperimente werden die Funktionalität des Epithels überwachen. Hier wurden TEER-Messungen in ALI-Kulturen aus primären Ösophagus-Keratinozyten, in primären Keratinozyten-ALI-Kulturen mit einer NIH/3T3-Fibroblasten-Fütterungsschicht auf dem Boden jeder Vertiefung und in primären Keratinozyten-ALI-Kulturen mit einer NIH/3T3-Fibroblasten-Fütterungsschicht auf jedem Insert durchgeführt (Abbildung 2C).

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Abbildung 1: Der Prozess der Kultivierung von Organoiden aus der Speiseröhre durch Patienten. Ein Diagramm, das das Verfahren zur Probenentnahme, die Zellisolierung, die Organoid-Kultivierung und mögliche experimentelle Anwendungen von patientengewonnenen Ösophagus-Organoiden veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Bildung und Differenzierung von patienteneigenen Ösophagusorganoiden. (A) Repräsentative Hellfeldbilder von Ösophagus-Organoiden, die aus primären Zellen von Patienten gezüchtet wurden. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von ALI-Kulturen der Speiseröhre, die an Tag 14 aus aus Biopsien gewonnenen Primärzellen kultiviert wurden. Maßstabsleisten: 50μM. (C) Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) an den angegebenen Tagen in ALI-Kulturen (Air-Liquid Interface) aus primären Ösophagus-Keratinozyten, ALI, kultiviert aus primären Keratinozyten mit einer NIH/3T3-Fibroblasten-Fütterungsschicht auf dem Boden jeder Vertiefung, und ALI-Kultivierung aus primären Keratinozyten mit einer NIH/3T3-Fibroblasten-Fütterungsschicht auf jedem Einsatz unterhalb der Keratinozytenschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MittelKSFMKSFM-C
Boden mittelKeratinozyten-SFMKeratinozyten-SFM
ErgänzungenPenicillin/Streptomycin1%1%
Rinder-Hypophysen-Extrakt (BPE)50 μg/ml50 μg/ml
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)1 ng/ml1 ng/ml
Calciumchlorid (CaCl2)0,09 mM0,6 Mio. m
Y-27632 (ROCK-Hemmer)-10 μM

Tabelle 1: Primäre zelluläre Organoidmedien der Speiseröhre. Liste der Bestandteile des Mediums für die Kultivierung menschlicher Organoide der Speiseröhre. SFM: Serumfreies Medium.

Diskussion

Die zur Verfügung gestellten Verfahren ermöglichen die Kultivierung von patientengewonnenen Organoiden und ALI-Kulturen mit hohen Erfolgsaussichten. Das Organoid-Protokoll wurde aus dem ersten veröffentlichten Protokoll, das über die Erzeugung humaner Ösophagus-Organoide berichtet26, und aus einem kürzlich veröffentlichten Protokoll32 angepasst. Sherill und Kollegen haben das ALI-Modell22 beschrieben. Organoide und ALI-Kulturmodelle unterstützen sich gegenseitig bei der Untersuchung des Einflusses von Zytokinen und anderen Mediatoren auf die epitheliale Barriere der Speiseröhre im Rahmen von Speiseröhrenerkrankungen, wie z.B. EoE 5,26.

Ein Vorteil des Organoid-Protokolls ist seine Einfachheit im Kulturprozess und in der Zusammensetzung des Zellkulturmediums. Im Gegensatz zu anderen ASC- und PSC-basierten Protokollen, die meist die Zugabe mehrerer teurer Ergänzungen und Wachstumsfaktorenerfordern 24,25,27,28,33, ist das KSFM-Medium relativ kostengünstig. Es erfordert lediglich die Zugabe des humanen rekombinanten epithelialen Wachstumsfaktors (hEGF) und des Rinderhypophysenextrakts (BPE). KSFM ist ein Basismedium, das für die Keratinozytenkultur optimiert ist und die Notwendigkeit einer Fibroblasten-Feeder-Schicht34 überflüssig macht. Es ist notwendig, die Ca2+-Konzentration des KSFM von 0,09 mM auf 0,6 mM unter Verwendung von CaCl2 zu titrieren, um das KSFM-C-Medium zu erhalten, das für die Organoidkultur verwendet wird. ALI-Kulturen erfordern eine höhere Ca2+-Konzentration von 1,8 mM als das Organoid-Modell. Die hohe Ca2+-Konzentration ist essentiell, um die Keratinozytendifferenzierung zu initiieren und anschließend die Bildung der typischen zwiebelartigen Konfiguration von mehrschichtigem Plattenepithel, das in Ösophagus-Organoiden vorhanden ist, zu erleichtern 26,34,35 und die epitheliale Schichtung in ALI-Kulturen 22.

Um eine vorzeitige Keratinozytendifferenzierung sowie die Bildung von Organoiden und ALI-Kulturen zu verhindern, müssen hohe Ca2+-Konzentrationen während der Zellisolierung vermieden werden. Eine frühe Differenzierung verringert die Koloniebildung und behindert die selbstorganisierende Bildung von Organoiden und die Bildung einer konfluenten Monoschicht aus undifferenzierten Keratinozyten als Grundlage der ALI-Kulturen. Die Verwendung von serumhaltigen Medien zur Beendigung der enzymatischen Aktivität von Trypsin während der Zellisolierung beeinträchtigt die erfolgreiche Organoidgenerierung, indem sie eine vorzeitige Differenzierung auslöst, ähnlich wie die Verwendung eines mitCa 2+ angereicherten Mediums während der Zellisolierung36. Stattdessen wird ein Soja-Trypsin-Hemmer oder ein anderer serumfreier Trypsin-Hemmer empfohlen, um die enzymatische Reaktion nach dem Biopsieverdau mit Trypsin zu stoppen. Das Kulturmedium wird in den ersten beiden Tagen der Kultur mit dem Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitor Y27632 ergänzt, um die Koloniebildungsrate zu erhöhen. Die Hemmung von ROCK wirkt antiapoptotisch, verhindert die Seneszenz der Keratinozyten und verbessert somit die Organoidbildungsrate37,38.

Es wird empfohlen, etwa 20.000 Zellen in einem 40-μl-BME-Tröpfchen zu säen, um eine gedeihende Organoidkultur zu gewährleisten, und 150.000 bis 400.000 Zellen für die ALI-Kultur. Eine ausreichende Zellaussaatzahl garantiert ausreichend Material für die nachfolgende Transkriptomik, Proteomik und Histologie. Bei der Verwendung von Zelllinien wie der humanen Ösophagus-Epithelzelllinie EPC2-hTERT kann die Anzahl der Seeding-Zellen aufgrund der erhöhten Organoidbildungsrate dieser Zelllinie verringert werden26. Dieses Phänomen ist wahrscheinlich auf die Homogenität und überlegene Synchronizität des Zellzyklus zurückzuführen, die Zelllinien im Vergleich zu aus Biopsien gewonnenen Primärzellen aufweisen. Die immortalisierte EPC2-hTERT-Zelllinie behält auch ihre proliferative Kapazität bei und ermöglicht so eine unendliche Passage von Organoiden.

Umgekehrt können humane Organoide, die aus Ösophagusbiopsien gewonnen wurden, nicht für die Langzeitkultur aufbewahrt werden 26,28. Der Rückgang der sich teilenden, lebensfähigen Zellen innerhalb voll entwickelter Organoide der Speiseröhre und eine abnehmende Rate der Organoidbildung mit jeder Passage26 deutet darauf hin, dass der Verlust der proliferativen Kapazität in primären zellabgeleiteten Organoiden auf die terminale Differenzierung und Keratinisierung von Vorläuferzellen zurückzuführen ist. Frühere Versuche, die proliferative Kapazität durch Ergänzung des Kulturmediums mit Noggin, Wnt3a oder A83-01 aufrechtzuerhalten, waren erfolglos 26,28,32. Daher bleibt das langfristige Biobanking von patienteneigenen Ösophagus-Organoiden eine Herausforderung, die in zukünftigen Studien angegangen werden muss.

Das Aufkommen der Organoidkultur hat neue experimentelle Möglichkeiten eröffnet, die die Entdeckung wichtiger Entzündungsmediatoren und Umweltfaktoren, die für epitheliale Veränderungen in EoE verantwortlich sind, erheblich ermöglicht haben 5,39,40,41,42. Nichtsdestotrotz ist es wichtig zu beachten, dass ASC- und PSC-abgeleitete Ösophagus-Organoide Einschränkungen aufweisen, da sie nicht alle zellulären Kompartimente der Speiseröhre perfekt rekapitulieren. ASC-abgeleitete Organoide rekapitulieren das Epithelkompartiment 24,26,27,33, während PSC-abgeleitete Organoide die epithelialen, endothelialen und mesenchymalen Kompartimente rekapitulieren 28,43,44. Allen aktuellen Organoidmodellen fehlt jedoch die immunologische Mikroumgebung. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden humane Ösophagus-Organoide und ALI-Kulturen mit Zytokinen aus der IL-20-Zytokinfamilie stimuliert, um einen neuen Aspekt der Dysfunktion der Epithelbarriere in EoE5 zu entschlüsseln. Die Kombination beider dreidimensionaler Kulturmodelle bewertete indirekte und direkte Messungen der Integrität der Epithelbarriere. Weitere Publikationen werden wahrscheinlich Ösophagus-Organoide in Kombination mit ALI-Kulturen verwenden, um die Auswirkungen definierter Zytokine auf das Epithel aufzuklären. Während dieser Ansatz die Komplexität der Wechselwirkung zwischen dem Immunsystem und dem Epithel reduziert, um die Funktion spezifischer Mediatoren auf dem Epithel aufzudecken, vernachlässigt er viele andere potenziell beteiligte Faktoren. Die Kombination der Organoid- und Organ-on-a-Chip-Technologie könnte eine Lösung für diese Einschränkung bieten. Die auf Mikrofluidik basierende Organ-on-a-Chip-Technologie kann die luminale und basolaterale Mikroumgebung röhrenförmiger Organe replizieren und so den Ein- und Ausfluss von Immunzellen und anderen zirkulatorischen und luminalen Komponenten ermöglichen. Dies ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen dem Epithel und Immunzellen bei Homöostase und Krankheit 45,46. Die erfolgreiche Kultivierung physiologisch polarisierter Nierentubuli-Organoide, die eine intakte Epithelbarriere und einen funktionellen transepithelialen Ionentransport auf einer Organ-on-a-Chip-Plattformaufweisen 47, unterstützt den erweiterten Einsatz der patientenabgeleiteten Organoid-on-a-Chip-Technologie. Darüber hinaus wird ein weiterer Fortschritt bei der Nutzung der Organoid-on-a-Chip-Technologie durch die erweiterte Kultivierung von Organoiden, die aus Primärzellen stammen, durch die Implementierung eines luminalen Flusses durch die mikrofluidischen Kanäle auf der apikalen Seite von röhrenförmigen Organoiden demonstriert, um die Ablösung von Epithelzellenzu eliminieren 46. Solche Fortschritte unterstreichen das Potenzial dieser Technologie, In-vivo-Umgebungen in vitro zu replizieren.

Die Fähigkeit, 3D-Organoide zu kultivieren, die vom Epithelkompartiment bis hin zu einem nahezu vollständigen Mini-Organ mit den meisten Zelltypen alles ähneln, drängt nach möglichen klinischen Anwendungen 5,26,46. Während in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte erzielt wurden, müssen noch weitere Hürden überwunden werden, bevor Organoide in der klinischen Praxis eingesetzt werden können. Eine wesentliche Hürde für die klinische Implementierung von Organoiden ist das Vorhandensein von tierischen Proteinen im Nährmedium und in den Gerüst-ECM-Produkten. Während tierische proteinfreie Medien für Keratinozytenkulturen bereits verfügbar sind und BPE-freie KSFM-Varianten kürzlich aufgetaucht sind, scheint die Herstellung tierischer proteinfreier EZM-Alternativen mit ähnlichen Eigenschaften und Kulturergebnissen wie bei herkömmlichen EZM-Produkten eine größere Herausforderung zu sein. Kürzlich wurde über eine potenziell vielversprechende, vollständig chemisch synthetisierte Alternative berichtet48. Dennoch gibt es derzeit kein kommerziell erhältliches ECM-Produkt ohne tierischen Ursprung.

Organoide der Speiseröhre und ALI-Kulturen sind wichtige Instrumente für die Untersuchung von EoE. Die Kultivierung von Organoiden und ALI-Kulturen mit den hier zur Verfügung gestellten Protokollen diente als Grundlage für neue Erkenntnisse über die Beteiligung des epithelialen Kompartiments an der eosinophilen Ösophagitis 5,26,39,41,42,49,50. Die einfache Implementierung dieser Protokolle und die kontinuierliche Weiterentwicklung dreidimensionaler Zellkulturtechnologien erleichtern die experimentelle Annäherung an die In-vivo-Umgebung, was zu einer verbesserten Übertragbarkeit der Entdeckungen und möglicherweise zu einer allmählichen Reduzierung von Tierversuchen führt.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Das SNF-Stipendium 310030_219210 an J.H.N. unterstützte die Veröffentlichung dieses Manuskripts ohne Einschränkungen. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1250 &Mikro; L Griptip - FilterIntegra4445
300 µ L Griptip - FilterIntegra4435
70 µ M Zell-SiebSarstedt83.3945.070
AscorbinsäureSigma-Aldrich (Merck)A4544
Rinder-Hypophysen-ExtraktGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
CalciumchloridSigma-Aldrich (Merck)21115
Zellkultur-Multiwell-Platten CELLSTAR für SuspensionskulturenGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basalmembran-Extrakt (BME), Typ 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethylsulfoxid (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automatisierter ZellzählerNanoEntekEVE-MC
EVE ZellzählobjektträgerNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Schnappkappe für das ZellsiebFalcon352235
Fluorescin-Isothiocyanat (FITC)-DextranSigma-Aldrich (Merck)FD4durchschnittliches Molgewicht 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Rekombinanter epidermaler WachstumsfaktorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinozyten-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Rekombinantes humanes KGF/FGF-7 ProteinR& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Schraubverschlussröhrchen, 15 mLSarstedt62.554.502
Einkanal EVOLVE 100-1000 µ L Integra3018
Einkanal EVOLVE 20-200 & Mikro; L Integra3016
Spritze 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin-Inhibitor aus Glycine max (Sojabohne)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 DihydrochloridTocris (Bio-Techne)1254

Referenzen

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