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Methodenartikel

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

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DOI:

10.3791/66503

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10. Mai 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Plattenepithel der Speiseröhre ist direkt der Umwelt ausgesetzt und ständig fremden Antigenen, einschließlich Lebensmittelantigenen und Mikroben, ausgesetzt. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Epithelbarriere ist entscheidend für die Vorbeugung von Infektionen und die Vermeidung von Entzündungen, die durch harmlose Antigene aus der Nahrung verursacht werden. Dieser Artikel enthält vereinfachte Protokolle für die Generierung von humanen Organoiden der Speiseröhre und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen aus Patientenbiopsien, um das epitheliale Kompartiment der Speiseröhre im Zusammenhang mit Gewebehomöostase und -krankheit zu untersuchen. Diese Protokolle waren in den letzten zehn Jahren bedeutende wissenschaftliche Meilensteine und beschreiben dreidimensionale organähnliche Strukturen aus patientengewonnenen Primärzellen, Organoiden und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Sie bieten die Möglichkeit, die Funktion spezifischer Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signalwege im Ösophagepithel in einem dreidimensionalen Rahmen unter Beibehaltung der phänotypischen und genetischen Eigenschaften des Spenders zu untersuchen. Organoide liefern Informationen über die Mikroarchitektur des Gewebes, indem sie das Transkriptom und Proteom nach Zytokinstimulation bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglichen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen die Beurteilung der Integrität der epithelialen Barriere durch Messungen des transepithelialen Widerstands (TEER) oder des Makromolekülflusses. Die Kombination dieser Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu beeinträchtigten Bedingungen der epithelialen Barriere der Speiseröhre voranzutreiben.

Einleitung

Eine Entzündung der Speiseröhre beeinträchtigt die Integrität der Epithelbarriere 1,2,3,4,5, wie bei der eosinophilen Ösophagitis (EoE), einer Th2-dominierten chronischen Entzündungserkrankung der Speiseröhre6, beobachtet wird. EoE wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben 7,8 und wird überwiegend durch die Lebensmittelantigene 9,10,11,12,13 induziert. Die am häufigsten auftretenden Symptome von EoE in der erwachsenen Bevölkerung sind Dysphagie und Nahrungsmittelimpaktion14. Bei Kindern manifestiert sich EoE typischerweise mit Gedeihstörungen, Nahrungsverweigerung, Erbrechen und Bauchschmerzen15. Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben EoE-Risikogene identifiziert, die an der Integrität der Epithelbarriere beteiligt sind, wodurch das Epithel in den Fokus der EoE-Forschung gerücktist 16,17,18. Die EoE-Transkriptomik zeigte weiterhin, dass ein gestörter Differenzierungsprozess und eine reaktive Basalzonenhyperplasie die beeinträchtigte Barrierefunktion des Ösophagepithels verursachen 3,5,19,20,21,22. Das frühe Verständnis, dass EoE eine Th2-vermittelte Erkrankungist 6, führte zur Entdeckung von IL-13 als treibender Mediator durch Störung der epithelialen Integrität 3,4,21,23. Experimentelle Systeme, die es ermöglichen, Zytokin-vermittelte Effekte auf die Epithelintegrität von intrinsischen Barrierebeeinträchtigungen durch genetische Prädisposition zu disparieren, bieten die Möglichkeit, das komplexe Zusammenspiel zwischen Immunzellen und Epithel in EoE zu untersuchen. Humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) wurden als wertvolle Werkzeuge vorgeschlagen, um die Auswirkungen der Zytokinstimulation auf die epitheliale Integrität zu analysieren5.

Das erste Protokoll zur Generierung adulter gewebespezifischer Stammzellen (ASC)-abgeleiteter Ösophagus-Organoide wurde fünf Jahre nach den ersten veröffentlichten Berichten über Darmorganoide im Jahr 2009 etabliert, bei denen intestinale Lgr5+-ASCs verwendet wurden, die das Epithelkompartiment des Dünndarms rekapitulieren24. DeWard et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Organoiden aus murinen Ösophagus-Epithelzellen25. Im Jahr 2018 erzeugten Kasagi et al. humane Ösophagus-Organoide aus der immortalisierten humanen Plattenepithelzelllinie EPC2-hTERT und primären patienteneigenen Zellen26. Im selben Jahr gelang es Zhang et al., aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Organoide der Speiseröhre zu erzeugen. Sie skizzierten die Bedeutung der Hemmung von TGFβ und knochenmorphogenetischem Protein (BMP) für die Entwicklung von Vorläuferzellen der Speiseröhre (EPC) und die entscheidende Rolle des Notch-Signalwegs bei der Differenzierung des geschichteten Plattenepithels26,27. Trisno und Kollegen ergänzten diese Befunde, indem sie Sox2 als Wnt-Inhibitor identifizierten, der das Entwicklungsschicksal in Richtung Ösophagusdifferenzierung lenkt28. Die anschließende Verfeinerung der Protokolle, der Zusammensetzung des Mediums und der Kulturbedingungen erhöhte die Organoidbildungsrate und ermöglichte die Subkultivierung und Rückgewinnung von Organoiden nach der Kryokonservierung 26,29,30,31,32. Obwohl diese Organoide leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Gewebearchitektur und der Expression potenzieller Zielgene nach Stimulation mit Zytokinen sind, bieten Organoide der Speiseröhre nicht die Möglichkeit, den transepithelialen Widerstand (TEER) oder den Makromolekülfluss als direkte Messungen für die Barriereintegrität zu messen. Wie zuvor von Sherrill und Kollegen22 beschrieben, ermöglichen ALI-Kulturen, die die epitheliale Differenzierung4 modellieren, eine direkte Beurteilung der epithelialen Integrität. Die Kombination von patienteneigenen Organoiden und ALI-Kulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Gewebearchitektur und der Integrität der Epithelbarriere bei EoE.

Hier finden Sie Verfahren mit Anweisungen zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Ösophagusbiopsien und zur Etablierung von Organoid- und ALI-Kulturen der Speiseröhre, die weiter verwendet werden können, um die Auswirkungen von Zytokinen auf die Integrität der Barriere zu untersuchen.

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Protokoll

Die Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alle Patienten gaben vor der endoskopischen Untersuchung eine schriftliche Einverständniserklärung für den experimentellen Einsatz von Biopsien ab. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellisolierung von patienteneigenen Organoiden der Speiseröhre

ANMERKUNG: Eine Liste der Bestandteile des Mediums für die Kultivierung humaner Organoide der Speiseröhre ist in Tabelle 1 enthalten.

  1. Besorge dir die Biopsien.
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden zwei Biopsien aus einem Speiseröhrensegment während der Ösophagogastroduodenoskopie mit einer Biopsiezange unter Verwendung eines Gastroskops mit einem 2,8-mm-Arbeitskanal gewonnen.
  2. Überführen Sie die Biopsien in ein kommerziell erhältliches keratinozytenserumfreies Medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    HINWEIS: Biopsien können bis zur Verwendung mehrere Stunden auf Eis gelagert werden.
  3. Ersetzen Sie das KSFM-Medium durch 1 mL Dispase I (10 U/mL) und inkubieren Sie die Biopsien 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.
  5. Aspirieren Sie die Dispase mit einer 1000-μl-Pipette, ohne die Biopsien und das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.
  6. Spülen Sie die Biopsien mit 1 mL Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
  7. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.
  8. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.
  9. Inkubieren Sie die Biopsien mit 500 μl Trypsin-EDTA (0,05%) bei 37 °C für 10 min und schütteln Sie bei 800 U/min.
  10. Führen Sie den mechanischen Aufschluss durch wiederholtes Auf- und Ab-Pipettieren durch, bis eine einzellige Suspension erhalten wird.
  11. Filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb mit dem Gummikolbenkopf einer Tuberkulinspritze.
  12. Waschen Sie das Sieb mit 2-4 mL Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (250 μg/mL).
  13. Filtern Sie die Zellen durch ein 35-μm-Zellsieb mit einer Schnappkappe auf einem 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
  14. Übertragen Sie die einzellige Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  15. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  16. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.
  17. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl KSFM-Medium.
  18. Mischen Sie 10 μl Trypanblau mit 10 μl Zellsuspension.
  19. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.

2. Vom Patienten stammende Organoidkultur

  1. Geben Sie nach der Zählung 1-2 ml KSFM in die Zellsuspension.
  2. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  3. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000 μL-Pipette, ohne das Zellpellet zu stören.
  4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einer Hydrogel-Matrix aus Basalmembranextrakt (BME) (40 μl BME pro 20.000 Zellen).
    HINWEIS: Halten Sie die Zellen nach der Zugabe des BME auf Eis, um eine vorzeitige Verfestigung des BME zu verhindern.
  5. Schneiden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze ab, um das viskose BME-Zell-Suspensionsgemisch abzusaugen.
  6. Bilden Sie 40 μl Tröpfchen in einer vorgewärmten (37 °C) Suspensionszellkulturplatte.
  7. Inkubieren Sie die Platte ohne Medium für 20-30 min bei 37 °C, um eine Verfestigung der BME-Tröpfchen zu gewährleisten.
  8. In den ersten beiden Kulturtagen wird vorgewärmtes KSFM-C-Medium, das mit 10 μM Y27632 (ROCK-Inhibitor) ergänzt wird, zugegeben.
  9. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch ein neues KSFM-C-Medium (ohne Y27632 und +/- Zytokin von Interesse).
  10. Aspirieren Sie das Medium und kratzen Sie die Tröpfchen mit der Pipettenspitze ab, während Sie kontinuierlich 1 ml Dispase II (1,5 U/ml) in die Vertiefung geben.
  11. Das BME-Dispase-Gemisch in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen und 20 min bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad inkubieren, um das BME zu verdauen.
  12. Bei 250 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren und die Dispase II aspirieren.
  13. Gehen Sie gemäß dem Protokoll der Interessenauslesung vor (z. B. RNA-Isolierung, Proteinisolierung oder Fixierung mit 4 % PFA für die Histologie).

3. Zellisolierung für vom Patienten stammende Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen (ALI)

  1. Besorge dir die Biopsien. Bei der Ösophagogastroduodenoskopie mit einem Gastroskop mit einem 2,8-mm-Arbeitskanal werden mit einer Biopsiezange zwei Biopsien aus einem Speiseröhrensegment entnommen.
  2. Geben Sie die Biopsien in ein kommerziell erhältliches keratinozyten-serumfreies Medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) und bis zur Verwendung mehrere Stunden auf Eis lagern.
  3. Tauschen Sie KSFM durch 1 mL Dispase (10 U/mL) aus. Inkubieren Sie die Biopsien anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.
  5. Entfernen Sie die Dispase mit einer 1000-μl-Pipette, ohne die Biopsien und das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.
  6. Waschen Sie die Biopsien mit 1 mL DPBS.
  7. Bei Raumtemperatur die Biopsien bei 300 x g für 2 min herunterschleudern.
  8. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.
  9. Inkubieren Sie die Biopsien in 500 μl Trypsin-EDTA (0,05%) bei 37 °C für 10 min und mischen Sie sie während der Inkubation kontinuierlich bei 800 U/min.
  10. Unterbrechen Sie die Biopsien mechanisch durch wiederholtes Auf- und Ab-Pipettieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird.
  11. Führen Sie die dissoziierten Zellen durch ein 70 μm Zellsieb mit einem Gummikolbenkopf aus einer Tuberkulinspritze und sammeln Sie die Zellen in einem konischen 50 mL Röhrchen.
  12. Waschen Sie das Sieb mit 2-4 mL Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (250 μg/mL), um die restlichen Zellen aus dem Sieb zu entfernen.
  13. Filtern Sie die Zellen mit einem 35-μm-Zellsieb-Schnappverschluss in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.
  14. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  15. Bei 300 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren.
  16. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000-μl-Pipette.
  17. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 mL KSFM-Medium (Ca2+ 0,09 mM), einschließlich 10 μM Y27632.
  18. Übertragen Sie die Zellen in einen T25-Zellkulturkolben.
  19. Um die primären Keratinozyten zu erweitern, kultivieren Sie die Zellen etwa 1 Woche lang bis zu 60%-80% Konfluenz.
    HINWEIS: Passage (P)0 bildet inselartige Zellkonglomerate und ist keine Monoschicht. Primäre Keratinozyten bilden ab P1 Monoschichten.
  20. Passage bei 60 %-80 % Konfluenz und erneute Aussaat von P1 in 2-3 T25 oder 1-2 T75 Zellkulturflaschen.
  21. Wieder Passage P1, wenn Keratinozyten eine Monoschicht mit 60%-80% Konfluenz bilden.

4. Vom Patienten stammende Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur (ALI)

  1. Säen Sie primäre P2-Keratinozyten auf Transwell-Inserts für die ALI-Kultur.
    HINWEIS: 400.000 Zellen in 12 Well-Inserts (200.000 Keratinozyten pro 0,6 cm2) in 500 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/ml BPE) aussäen.
    1. 150.000 Zellen in 24 Well-Inserts (155.000 Keratinozyten pro 0,5 cm2) in 100 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) säen.
    2. Alternativ können Sie die gefrorenen Zellen im KSFM-Medium (Ca2+ 0,09 mM + 10 % DMSO) bei -80 °C für 24 h einfrieren und anschließend für die spätere Verwendung in flüssigen Stickstoff überführen.
      HINWEIS: Bei Verwendung von gefrorenen Fläschchen die Passage nach dem Auftauen erneut durchführen, bevor die Zellen für die ALI-Kultur verwendet werden.
  2. Geben Sie Medium in die untere Vertiefung unter dem Einsatz der Transwell-Kulturplatte.
    HINWEIS: Für 12-Well-Platten: 1,5 mL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Für 24-Well-Platten: 600 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. Ersetzen Sie das mittlere bis hohe Kalzium KSFM (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) nach 2 Tagen.
  4. Wechseln Sie das kalziumreiche KSFM-Medium jeden zweiten Tag bis zum 7. Tag.
  5. Führen Sie an Tag 7 einen Lufttransport durch, indem Sie das Medium aus der oberen Kammer ansaugen und das Medium in der unteren Kammer durch KSFM mit hohem Calciumgehalt (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) mit 10 ng/mL KGF (= FGF7), 75 μg/mL Ascorbinsäure (AA) ersetzen.
    1. Optional: Geben Sie das gewünschte Zytokin in der gewünschten Konzentration in das Medium.
  6. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag.

5. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)

  1. Sterilisieren Sie die Elektrode des TEER-Messgeräts, indem Sie sie 10-15 Minuten lang in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 5 % Natriumhypochlorit eintauchen.
  2. Waschen Sie das 5%ige Natriumhypochlorit ab, indem Sie die Elektrode in 4 aufeinanderfolgende Vertiefungen mit sterilem ddH2O eintauchen und die Elektrode an der Luft trocknen lassen.
  3. Setzen Sie den Rohling fest, indem Sie eine Elektrode in die Vertiefung und die zweite Elektrode in den Transwell-Einsatz einsetzen, ihn mit PBS füllen und den TEER messen.
    HINWEIS: Empfohlene Volumina für TEER-Messungen: Für 12-Well-Platten (1900 μl im Well und 900 μl im Einsatz). Für 24-Well-Platten (750-1000 μl im Well und 250 μl im Einsatz).
  4. Ersetzen Sie das Medium der ALI-Kulturen durch steriles PBS bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Entfernen Sie das Medium aus der unteren Vertiefung und in einem zweiten Schritt aus dem Transwell-Einsatz. Geben Sie PBS in ähnlicher Weise zuerst in den Einsatz und dann in die untere Vertiefung, um eine Ablösung der ALI-Kultur von der Transwell-Membran zu verhindern.
  5. Platzieren Sie die TEER-Meterelektroden in den Experimentiervertiefungen mit ALI-Kulturen und führen Sie die TEER-Messung1 durch.
    HINWEIS: Führen Sie TEER-Messungen jeden zweiten Tag durch, bevor das Medium gewechselt wird.

6. Makromolekularer Fluss

  1. Die FITC-Dextran (3-5 kDa) Stammlösung wird auf eine Arbeitskonzentration von 1 mg/ml verdünnt.
    HINWEIS: Schützen Sie FITC-Dextran immer vor Lichteinwirkung.
  2. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe mit abnehmender FITC-Konzentration (1000 μg/mL bis 0,25 μg/mL) als Standard für die Ablesung vor.
  3. Geben Sie 500 μl FITC-Dextran-Lösung (1 mg/ml) in die obere Kammer des Transwells und 1,5 ml Medium (+/- Zytokin von Interesse) in das untere Fach und stellen Sie die Platte in den Inkubator.
  4. Sammeln Sie 120 μl Medium aus dem unteren Fach zu den jeweiligen Zeitpunkten (z. B. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min und 180 min).
  5. Pipettieren Sie Duplikate (50 μl/Well) jedes Zeitpunkts in eine schwarze, transparente 96-Well-Platte mit flachem Boden.
  6. Stimulieren Sie das FITC-Dextran bei 490 nm und lesen Sie die Emission bei einer Wellenlänge von 520 nm mit einem Plattenleser ab.
  7. Berechnen Sie die Menge des makromolekularen Flussmittels gemäß der Norm.

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Ergebnisse

Organoide der Speiseröhre wachsen aus Primärzellen, die aus Patientenbiopsien gemäß den Anweisungen des bereitgestellten Protokolls extrahiert wurden, wie mit einem inversen Hellfeldmikroskop dokumentiert (Abbildung 1). Epithel-ASCs beginnen innerhalb der ersten zwei Tage der Kultur mit der selbstorganisierenden Bildung von Zellclustern, nachdem sie die isolierten Zellen in den Basalmembranextrakt eingesät haben, der als Gerüst dient. Die Größe und Anzahl der Zellcluster, die mit einem inver...

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Diskussion

Die zur Verfügung gestellten Verfahren ermöglichen die Kultivierung von patientengewonnenen Organoiden und ALI-Kulturen mit hohen Erfolgsaussichten. Das Organoid-Protokoll wurde aus dem ersten veröffentlichten Protokoll, das über die Erzeugung humaner Ösophagus-Organoide berichtet26, und aus einem kürzlich veröffentlichten Protokoll32 angepasst. Sherill und Kollegen haben das ALI-Modell22 beschrieben. Organoide und ALI-Kulturmodelle unterstützen sich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Das SNF-Stipendium 310030_219210 an J.H.N. unterstützte die Veröffentlichung dieses Manuskripts ohne Einschränkungen. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1250 &Mikro; L Griptip - FilterIntegra4445
300 µ L Griptip - FilterIntegra4435
70 µ M Zell-SiebSarstedt83.3945.070
AscorbinsäureSigma-Aldrich (Merck)A4544
Rinder-Hypophysen-ExtraktGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
CalciumchloridSigma-Aldrich (Merck)21115
Zellkultur-Multiwell-Platten CELLSTAR für SuspensionskulturenGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basalmembran-Extrakt (BME), Typ 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethylsulfoxid (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automatisierter ZellzählerNanoEntekEVE-MC
EVE ZellzählobjektträgerNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Schnappkappe für das ZellsiebFalcon352235
Fluorescin-Isothiocyanat (FITC)-DextranSigma-Aldrich (Merck)FD4durchschnittliches Molgewicht 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Rekombinanter epidermaler WachstumsfaktorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinozyten-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Rekombinantes humanes KGF/FGF-7 ProteinR& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Schraubverschlussröhrchen, 15 mLSarstedt62.554.502
Einkanal EVOLVE 100-1000 µ L Integra3018
Einkanal EVOLVE 20-200 & Mikro; L Integra3016
Spritze 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin-Inhibitor aus Glycine max (Sojabohne)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 DihydrochloridTocris (Bio-Techne)1254

Referenzen

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

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