Methodenartikel

Charakterisierung von Modulatoren von Protease-aktivierten Rezeptoren mit einem Calciummobilisierungsassay unter Verwendung eines Plattenreaders

DOI:

10.3791/66507

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24. Mai 2024

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1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es wurde ein verbessertes Protokoll für einen Kalziummobilisierungsassay mit Endothelzellen entwickelt, der zur Identifizierung von Liganden von Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs) verwendet wird. Das neue Protokoll reduziert die Gesamttestzeit um 90-120 Minuten und liefert reproduzierbare Konzentrations-Wirkungs-Kurven.

Zusammenfassung

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Veränderungen der Kalziumkonzentration in Zellen werden mit Hilfe von intrazellulären, fluoreszierenden, kalziumbindenden Farbstoffen und bildgebenden Instrumenten, die Fluoreszenzemissionen von bis zu 1.536 Wells gleichzeitig messen können, schnell und im Hochdurchsatz überwacht. Diese Instrumente sind jedoch viel teurer und können im Vergleich zu weit verbreiteten Plattenlesegeräten, die die Wells einzeln scannen, eine Herausforderung in der Wartung darstellen. Hier wird ein optimierter Platten-Reader-Assay für die Verwendung mit einer Endothelzelllinie (EA.hy926) beschrieben, um die Protease-aktivierte Rezeptor (PAR)-getriebene Aktivierung desG-αq-Signalwegs und die anschließende Kalziummobilisierung unter Verwendung des Kalzium-bindenden Farbstoffs Fluo-4 zu messen. Dieser Assay wurde zur Charakterisierung einer Reihe von PAR-Liganden verwendet, einschließlich der allosterischen, auf PAR1 abzielenden entzündungshemmenden "Parmodulin"-Liganden, die im Dockendorff-Labor identifiziert wurden. Dieses Protokoll macht einen automatisierten Liquid Handler überflüssig und ermöglicht das Screening von PAR-Liganden bei mittlerem Durchsatz in 96-Well-Platten und sollte für die Untersuchung anderer Rezeptoren anwendbar sein, die die Kalziummobilisierung initiieren.

Einleitung

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Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs)1,2,3 sind eine Unterfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) der Klasse A, die in einer Vielzahl von Zelltypen exprimiert werden, einschließlich Blutplättchen und Endothelzellen 4,5,6,7. Im Gegensatz zu den meisten GPCRs haben PARs einen einzigartigen intramolekularen Aktivierungsmodus. Die meisten GPCRs werden durch lösliche Liganden aktiviert, die mit einer ausgeprägten Bindungstasche interagieren, aber PARs werden durch die proteolytische Spaltung des N-Terminus aktiviert, was zu einem neuen angebundenen Liganden führt, der mit der extrazellulären Schleifen-2-Domäne auf der Oberfläche einer Zelle interagieren kann 6,8,9. Diese Interaktion aktiviert den Rezeptor und kann mehrere Signalwege initiieren, die Effekte wie Entzündungen und Thrombozytenaktivierung fördern 4,10,11,12. Verschiedene Proteasen können PARs durch Spaltung an einzigartigen Stellen am N-Terminus aktivieren, wodurch unterschiedliche angebundene Liganden (TL) sichtbar werden, die Rezeptorkonformationen stabilisieren, die unterschiedliche Signalwege initiieren 9,13,14,15. Zum Beispiel wird bei dem am besten untersuchten Mitglied der Unterfamilie, PAR1, die Spaltung durch Thrombin verwendet, um zahlreiche biologische Prozesse zu unterstützen, einschließlich der Thrombozytenaktivierung und der Leukozytenrekrutierung in das Endothel, kann aber zu schädlichen Effekten führen, wenn der Rezeptor überexprimiert oder überaktiviert wird 4,16,17,18,19,20,21 . Umgekehrt kann die Spaltung durch aktiviertes Protein C (aPC) die entzündungshemmende Wirkung und die Aufrechterhaltung der Endothelbarrieren fördern 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs können auch durch Peptidanaloga der TLs intermolekular aktiviert werden 13,30,31. Diese Peptide werden routinemäßig zur Messung der PAR-Hemmung (Modulation) anstelle von PAR-Targeting-Proteasen verwendet, und sie werden in diesem Protokoll verwendet.

Zahlreiche Erkrankungen sind mit pathologischer PAR1-Signalgebung verbunden, darunter Sepsis22,32, Herz-Kreislauf-Erkrankungen 33,34,35,36,37,38, Nierenerkrankungen 39,40,41,42, Sichelzellanämie 43, Fibrose44, Osteoporose und Osteoarthritis45,46, Neurodegeneration 47,48,49,50,51 und Krebs 52,53,54,55,56,57,58,59. Antagonisten von PAR1 werden seit den 1990er Jahren als Thrombozytenaggregationshemmer für Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht, und die wachsende Liste von Krankheiten, die mit dem Rezeptor in Verbindung gebracht werden, erfordert die Identifizierung neuartiger Liganden für den Einsatz als biologische Sonden (Werkzeugverbindungen) oder als potenzielle Therapeutika. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen PAR1-Antagonisten, Vorapaxar, der zur Behandlung der koronaren Herzkrankheit bei Hochrisikopatienten eingesetzt wird 34,36,37,60. Ein alternativer PAR1-Antagonist, das Pepducin PZ-128, schloss eine erfolgreiche Phase-II-Studie zur Thromboseprävention bei Herzkatheterpatienten ab38. Die Arbeitsgruppe Dockendorff hat sich auf die medizinische Chemie und Pharmakologie einer separaten Klasse von kleinen Molekülen, den PAR1-Liganden, den Parmodulinen61,62, konzentriert. Im Gegensatz zu berichteten PAR1-Antagonisten wie Vorapaxar sind Parmoduline allosterische, verzerrte Modulatoren von PAR1, die selektiv denG-αq-Signalweg blockieren und gleichzeitig zytoprotektive Effekte ähnlich wie aPC fördern. Im Gegensatz zu potenten orthosterischen PAR1-Antagonisten wie Vorapaxar sind publizierte Parmoduline auch reversibel 63,64,65.

Zunächst wurden Parmoduline von Flaumenhaft und Mitarbeitern hinsichtlich ihrer Fähigkeit identifiziert, die P-Selektin-Expression oder die Granulsekretion in Blutplättchen zu hemmen61,66. Es war jedoch eine alternative Methode erforderlich, um die Auswirkungen von Parmodulinen auf Endothelzellen zu untersuchen. Eine gängige Methode zur Überwachung der GPCR-bezogenen Signalübertragung ist die Messung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung, eines wichtigen sekundären Botenstoffs, der mit einem geeigneten intrazellulären Kalziumbindungsfarbstoff gemessen werden kann67,68. Es wurden substanzielle Beweise dafür vorgelegt, dass die durch PAR1 induzierte Calciummobilisierung durch die Aktivierung von Gαq 69,70 erfolgt. Sobald PAR1 durch seinen angebundenen Liganden (oder einen geeigneten exogenen Liganden) aktiviert wird, erfährt es eine Konformationsänderung, die dazu führt, dass Guanosindiphosphat (GDP), das an die Gαq-Untereinheit gebunden ist, durch Guanosintriphosphat (GTP) ersetzt wird68. Die Gαq-Untereinheit aktiviert dann die Phospholipase Cβ (PLC-β), die die Hydrolyse von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) katalysiert und 1,4,5-Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) bildet. Schließlich bindet IP3 an IP3-empfindliche Ca2+-Kanäle in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, wodurch Ca2+ in das Zytoplasma freigesetzt werden kann, wo es anCa2+-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluo-4 binden kann, die den Zellen zugesetzt werden71. Dieser Prozess findet innerhalb von Sekunden statt und kann die Konzentration von Ca2+ um das 100-fache erhöhen, was zu einer drastischen Veränderung der Menge an calciumgebundenem Farbstoff und einem robusten Fluoreszenzsignal führt.

Im Jahr 2018 stellte die Dockendorff-Gruppe einen Ca2+ -Mobilisierungsassay mit mittlerem Durchsatz vor, der zur Identifizierung von Antagonisten desG-αq-Signalwegs von PAR172 verwendet werden konnte. Der Assay verwendete EA.hy92673, eine hybride humane Endothelzelllinie, die für mehrere Passagen ohne merkliche Veränderung der PAR1-Expression verwendet werden kann und für In-vitro-Messungen zytoprotektiver Wirkungen etabliert ist.

Das ursprüngliche Protokoll verwendete EA.hy926-Zellen in 96-Well-Platten, die mit Fluo-4/AM-Farbstoff beladen waren, der aufgrund seiner intensiven Fluoreszenz bei 488 nm und seiner hohen Zellpermeabilität ausgewählt wurde. Nachdem der Farbstoff in die Zellen geladen war, wurden langwierige Waschschritte mit einem automatisierten 8-Kanal-Liquid-Handler durchgeführt (schnellere Methoden des Liquid Handlings, wie z. B. ein 96-Kanal-Wascher, waren nicht zugänglich). Die Reproduzierbarkeit dieses Assays war besser als die ohne den sorgfältigen, automatisierten robotischen Medienwechsel. Antagonisten wurden dann mit den Zellen inkubiert, PAR1 wurde durch die sequentielle Zugabe eines selektiven Agonisten (jeweils 16 Wells) aktiviert, und Veränderungen der Fluoreszenz infolge der Kalziummobilisierung und Farbstoffbindung wurden gemessen, um die Aktivität zu bestimmen.

Dieses Protokoll ermöglicht zwar die Messung der PAR1-vermittelten Kalziummobilisierung, ist jedoch durch die Zeit begrenzt, die für den Assay jeder 96-Well-Platte erforderlich ist. Lange Experimentierzeiten sind nicht nur deshalb problematisch, weil die Anzahl der Verbindungen, die täglich gescreent werden können, begrenzt ist, sondern auch, weil der Farbstoffausfluss im Laufe der Zeit auftritt und das Assay-Fenster durch Erhöhung der basalen Fluoreszenz verengt. Ein Beitrag zur langen Versuchszeit ist die Verwendung eines 8-Kanal-Liquid-Handlers für die Plattenreinigung, der jedes Experiment um mehr als 30 Minuten verlängert. Die erforderlichen Trinkgelder wurden auch aufgrund von Problemen in der Lieferkette schwierig. Hier wird über ein aktualisiertes Protokoll für den PAR-vermittelten Calciummobilisierungsassay berichtet, der keinen Liquid Handler benötigt und daher mit höherem Durchsatz ausgeführt werden kann. Dieses Protokoll sollte auch für die Messung der Signalübertragung mit anderen GPCRs geeignet sein, die zu einer intrazellulären Kalziummobilisierung führen. Dieses aktualisierte Plattenleseprotokoll ist ideal für akademische und kleine industrielle Labore, die nicht über die Ressourcen für teure Zellbildgebungsinstrumente verfügen, aber zahlreiche Verbindungen schnell screenen müssen. Ein Beispiel für einen Calciummobilisierungsassay mit einem Plate Imager finden Sie unter Caers et al.74.

Protokoll

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Alle in den Schritten 1 und 2 des folgenden Protokolls vorgenommenen Medienaustausche/-ergänzungen werden in einer sterilen Haube durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, müssen alle Kunststoffe, die in der sterilen Haube verwendet werden, sterilisiert und versiegelt gekauft oder ordnungsgemäß im Autoklaven sterilisiert werden.

1. Initiierung der EA.hy926-Zelllinie

  1. Erwerben Sie EA.hy926-Zellen.
  2. Lagern Sie Fläschchen mit Zellen in der Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks.
  3. Bereiten Sie das DMEM-Komplettmedium vor, indem Sie zuerst DMEM, FBS und Stift/Streptokokken (siehe Materialtabelle für spezifische Details) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 15-30 Minuten erwärmen. Fügen Sie 50 mL FBS und 1 mL Pen/Streptokokken zu 500 mL DMEM hinzu. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Inversion.
    HINWEIS: Zu starkes Mischen führt zu übermäßiger Menge an Blasen.
  4. Nehmen Sie ein Fläschchen mit Zellen aus flüssigem Stickstoff und erwärmen Sie es 5 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad.
  5. Sterilisieren Sie das Fläschchen mit den Zellen und die Flasche mit dem DMEM-Komplettmedium, indem Sie es mit Alkohol besprühen, und begeben Sie es dann in die Sterilhaube.
  6. Verwenden Sie eine 1.000-μl-Pipette, um die Zellen vorsichtig in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Geben Sie 1 ml DMEM in die Durchstechflasche, spülen Sie sie und geben Sie sie in das Zentrifugenröhrchen.
  7. Mit einer Zentrifuge (150 × g, 5 min, 22 °C) wird ein Pellet aus Zellen hergestellt. Entfernen Sie das Medium durch Aspiration aus dem Zentrifugenröhrchen; Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
  8. Geben Sie 3 mL DMEM-Komplettmedium in das Zentrifugenröhrchen und brechen Sie das Pellet vorsichtig auf, indem Sie die Zellsuspension mit einer 1.000-μl-Pipette mischen.
    HINWEIS: Blasenbildung durch zu starkes Mischen sollte vermieden werden, da dies die Zellen aktivieren oder schädigen könnte.
  9. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Pipette mit 20 μl oder 200 μl Spitzen. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension/Trypanblau-Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen.
    HINWEIS: Die Verwendung von 0,1-10 μl Pipettenspitzen kann die Zellen scheren. Spitzen dieser Größe sollten beim Umgang mit der Zellsuspension nicht verwendet werden.
  10. Geben Sie DMEM-Komplettmedium in die Zellsuspension, um eine Dichte von 66.000 Zellen/ml mit einer serologischen 10- oder 25-ml-Pipette zu erreichen. Pipettieren Sie 15 ml der Zellsuspension in einen oder mehrere T-75-Kulturflaschen. Eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension wird gewährleistet, indem der Kolben von Norden nach Süden und von Osten nach Westen bewegt wird.
  11. Inkubieren Sie die Zellen, bis sie die Konfluenz erreichen (typischerweise nach 4-6 Tagen), wie durch Untersuchung unter einem Mikroskop geschätzt. Verwenden Sie zu diesem Zeitpunkt die Zellen im Experiment (beginnend mit Abschnitt 2) oder säen Sie sie zur Expansion in neue Kolben aus, um gefrorene Brühen vorzubereiten (bei einer empfohlenen Aussaatdichte von 1.000.000 Zellen in 15 ml vollständigem Medium pro T-75-Kolben).
    HINWEIS: Zellen können bis zu 3 Wochen lang in den Kulturflaschen gezüchtet werden, ohne dass es zu einem merklichen Unterschied in Form, Gesundheit oder Leistung im Assay kommt. Das komplette Medium sollte alle 3-4 Tage ausgetauscht werden.

2. Zugabe von EA.hy926-Zellen zu 96-Well-Platten

HINWEIS: Zellen aus einem konfluenten T-75-Kulturkolben können zur Vorbereitung von zwei oder drei Assay-Platten verwendet oder optional in bis zu 15 frische T-75-Kolben erweitert werden. Mindestens fünf Assay-Platten können an einem normalen Arbeitstag nach dem Protokoll in den Abschnitten 4 und 5 gescreent werden. Die folgenden Anweisungen beschreiben das Vorbereiten und Testen einer Assay-Platte, aber zusätzliche Platten können durch Wiederholen der Schritte 2.2, 2.7, 2.12 und 3.2 vorbereitet werden, um die gewünschte Anzahl von Assay-Platten vorzubereiten. In der Regel werden vier Assay-Platten pro Tag hergestellt, um die Konzentrationsreaktionen mit bis zu 16 Verbindungen zu messen, wofür zwei T-75-Kolben mit konfluenten Zellen erforderlich sind.

  1. DMEM complete medium in einem 37 °C Wasserbad für 15-30 min erwärmen. Sterilisieren Sie die Flasche mit DMEM complete medium, indem Sie sie mit Alkohol besprühen, und stellen Sie sie dann in die sterile Haube.
  2. Geben Sie 100 μl einer sterilisierten 0,4%igen Gelatinelösung in alle Vertiefungen einer schwarzwandigen 96-Well-Platte mit klarem Boden und Deckel. Die Platte mit der Gelatinelösung in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) 30 min inkubieren.
  3. Bestätigen Sie mit einem inversen Mikroskop, dass die Zellen in einem T-75-Kulturkolben zu 80-100 % konfluent sind. Entfernen Sie das DMEM-Komplettmedium durch Aspiration aus dem T-75-Kolben.
  4. Waschen Sie die Zellen im Kolben mit 10 mL PBS und bewegen Sie den Kolben vorsichtig von Norden nach Süden und von Osten nach Westen. Entfernen Sie das PBS durch Aspiration aus dem Kolben.
  5. Geben Sie 5 mL Zelldissoziationslösung in den Kolben und inkubieren Sie den Kolben in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2) für ~12 min. Klopfen Sie nach 6 Minuten auf die Flasche, um die Dissoziation zu erleichtern.
    HINWEIS: Eine Inkubation von Zellen für einen Zeitraum von mehr als 15 Minuten mit dem referenzierten Zelldissoziationsmittel führt dazu, dass die Zellen zu verklumpen beginnen, was die Erzielung einer genauen Zellzahl erschwert und den Assay beeinträchtigen kann.
  6. 5 ml des vorgewärmten DMEM-Alleinmediums in den Kolben geben und vorsichtig in die Zelldissoziationslösung/Zellsuspension einmischen. Geben Sie die Zellsuspension mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Mit einer Zentrifuge (150 × g, 5 min, 22 °C) wird ein Pellet aus Zellen hergestellt.
  7. Während das Pellet gebildet wird, entfernen Sie die Gelatinelösung durch Aspiration mit einer Pasteurpipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, aus der 96-Well-Platte. Entfernen Sie den Plattendeckel ab dem Zeitpunkt der Gelatineentfernung, bis die Lösung bereit zum Plattieren ist.
    HINWEIS: Optional kann eine Mehrkanalpipette oder ein steriler Verteiler verwendet werden, der an ein Vakuum angeschlossen ist.
  8. Entfernen Sie das Medium aus dem Zentrifugenröhrchen durch Aspiration mit einer Pasteurpipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, oder einer serologischen Pipette; Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
  9. Geben Sie frisches DMEM-Komplettmedium mit einer serologischen 5- oder 10-ml-Pipette in das Zentrifugenröhrchen. Brechen Sie das Zellpellet vorsichtig auf, indem Sie das DMEM-Komplettmedium mit einer 1.000-μl-Pipette oder einer serologischen 5-ml-Pipette mischen.
    HINWEIS: In der Regel werden acht Milliliter DMEM verwendet, aber es können auch höhere Volumina hinzugefügt werden, um die Zellzählung zu erleichtern.
  10. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Pipette mit 20 μl oder 200 μl Spitzen. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension/Trypanblau-Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen.
  11. Geben Sie DMEM-Komplettmedium in die Zellsuspension, um eine Dichte von 600.000 Zellen/ml mit einer serologischen 10- oder 25-ml-Pipette zu erreichen. Dies ergibt eine endgültige Dichte von 60.000 Zellen/Well in einer 96-Well-Platte (die durch Experimente als optimale Dichte bestimmt wurde).
    HINWEIS: Eine normale erfolgreiche Zellkultur ergibt zwischen 12.000.000 und 15.000.000 Zellen, die zwei bis drei 96-Well-Platten aussäen können.
  12. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Zentrifugenröhrchen vorsichtig umdrehen und in ein 50-ml-Mehrkanal-Pipettenreservoir geben. Mischen Sie die Suspension alle 30 s im Reservoir, indem Sie das Reservoir vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen, und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung. Setzen Sie die transparente Plattenabdeckung wieder auf und schütteln Sie die Platte vorsichtig, indem Sie sie auf der Oberfläche der Sterilhaube von Norden nach Süden und von Osten nach Westen schieben, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Platte im Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für 16-24 h.
    HINWEIS: Zusätzliche Zellsuspension kann verwendet werden, um zusätzliche Platten vorzubereiten, oder die Schritte 1.10-1.11 können wiederholt werden, um die Zelllinie fortzusetzen.

3. Vorbereitung des Calcium-Mobilisierungsassays

  1. Bereiten Sie die Assay-Reagenzien vor.
    1. Bereiten Sie Sondenecidlösung (250 mM, wässrig) vor, indem Sie 36 mg Probenecid in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und in 0,6 M NaOH (500 μL) auflösen. Vortex die Lösung.
      HINWEIS: Probenecid verbessert die Retention von Farbstoff in der Zelle, indem es organische Ionentransporter hemmt 75,76,77.
    2. Um HBSS-HEPES-Assay-Puffer herzustellen, fügen Sie HEPES (1,19 g) zu einer 500-ml-Flasche Ca/Mg/phenolrot-freiem HBSS hinzu (wodurch eine 10-mM-Lösung von HEPES hergestellt wird). Ergänzen Sie den Puffer mit MgCl2 (1 M wässrige Lösung, 500 μL) und CaCl2 (1 M wässrige Lösung, 500 μL). Die Lösung mischen und bei Nichtgebrauch bei 5 °C im Kühlschrank lagern.
      1. Geben Sie für jede 96-Well-Platte 50 ml des HBSS-HEPES-Assay-Puffers in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, ergänzen Sie es mit 500 μl der Probenecid-Lösung und mischen Sie es gut. Erwärmen Sie den Puffer vor der Verwendung auf Raumtemperatur.
    3. Stellen Sie eine 10%ige Pluronic F-127-Lösung in DMSO her, indem Sie Pluronic F-127 (20 mg) in ein Mikrozentrifugenröhrchen oder HPLC-Fläschchen geben und mit 200 μl DMSO auflösen.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden und reicht für ca. 30 Platten. Pluronic F-127 löst sich bei Raumtemperatur sehr langsam auf und sollte sanft erhitzt werden, um die Auflösung zu erleichtern.
    4. Bereiten Sie den Farbstoffladepuffer vor, indem Sie zuerst 24 μl DMSO in ein Fläschchen mit Fluo-4/AM (50 μg) geben, um den Farbstoff aufzulösen. In ein folienumwickeltes 15-ml-Zentrifugenröhrchen 6 ml HBSS-HEPES-Assay-Puffer geben und mit 6 μl 10 % Pluronic F-127 und 6 μl Fluo-4/AM-Lösung ergänzen. Die Lösung kurz vortexen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Licht ziehen lassen.
      HINWEIS: Um ein Photobleichen von Fluo-4 zu verhindern, halten Sie den Farbstoff vor Licht geschützt, indem Sie Aluminiumfolie um das Zentrifugenröhrchen mit der Farbstofflösung und den Deckel der Testplatte wickeln.
  2. Bereiten Sie die Assay-Platten vor.
    1. Nehmen Sie die Assay-Platte aus dem Inkubator und bestätigen Sie die Konfluenz mit einem inversen Mikroskop. Entfernen Sie das DMEM-Komplettmedium manuell, indem Sie es in ein Waschbecken schnippen und die Oberseite der Platte mit einem Papiertuch abtupfen.
      HINWEIS: Das Medium wird ausreichend entfernt, indem Sie die Platte waagerecht halten und schnippen, gefolgt von einer Drehung der Platte um 180° und einer Wiederholung.
    2. Geben Sie den HBSS-HEPES-Assay-Puffer plus Probenecid-Lösung in ein 50-ml-Mehrkanal-Pipetten-Lösungsmittelreservoir.
      HINWEIS: Diese Lösung wird für spätere Waschschritte verwendet und sollte beiseite gelegt und bis zur Verwendung mit Alufolie abgedeckt werden.
    3. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl des HBSS-HEPES-Assay-Puffers plus Probenecid-Lösung in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang in Gegenwart von Probenecid ruhen. Entfernen Sie den HBSS-HEPES-Assay-Puffer, indem Sie ihn auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.2.1 in die Spüle schnippen.
    4. Geben Sie den Farbstoffladepuffer in ein separates 50-ml-Mehrkanal-Pipetten-Lösungsmittelreservoir. Geben Sie 50 μl des Farbstoffladepuffers mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der Assay-Platte. Die Platte 45 min lang inkubieren (37 °C, 5 % CO2).
    5. Während sich die Platte im Inkubator befindet, bereiten Sie die Agonisten-/Antagonistenlösungen vor.
      1. Antagonistenlösungen werden als 31,6 mM-Lösungen in DMSO gespeichert. In einem PCR-Röhrchen verdünnen Sie 2 μl der Stammlösung mit 38 μl 0,1 % BSA/Wasser, um eine 1,58 mM-Lösung zu erhalten. 2 μl dieser Lösung ergeben eine Endkonzentration von 31,6 μM in der Assay-Platte. 4 μl der 1,58 mM Antagonistenlösung mit 36 μl 5 % DMSO/Wasser (ohne BSA-Zusatz) verdünnen und die restlichen Konzentrationen durch serielle Verdünnungen vorbereiten.
      2. Bereiten Sie eine 108,3 μM (16,7x) Lösung von TFLLRN-NH2 in HBSS-HEPES-Assay-Puffer vor, die eine Endkonzentration von 6,5 μM ergibt, wenn 6 μl in jede Vertiefung der Assay-Platte gegeben werden. Lösen Sie beispielsweise ein 2 mg Aliquot von TFLLRN-NH2 mit 5,244 ml HBSS-HEPES-Assay-Puffer auf, um eine 0,5 mM Stammlösung zu erhalten. Mischen Sie 1,083 mL dieser Lösung mit 3,917 mL HBSS-HEPES-Assay-Puffer , um eine 108,3 μM Lösung zu erhalten.
        HINWEIS: TFLLRN-NH2-Lösungen sollten bei Nichtgebrauch in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert werden.
    6. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und stellen Sie die Farbstoffaufnahme sicher, indem Sie ein Fluoreszenzmikroskop in einer geeigneten Einstellung verwenden (typischerweise für grün fluoreszierendes Protein, siehe Abbildung 1 für ein Beispiel für Fluo-4, das erfolgreich in Zellen geladen wurde). Entfernen Sie den Farbladepuffer, indem Sie die Platte auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.2.1 schnippen.
    7. Waschen Sie die Zellen 2x mit 50 μl des HBSS-HEPES-Assay-Puffers plus Probenecid-Lösung (aus Schritt 3.2.3) in jeder Vertiefung (entfernen Sie sie durch Schnippen von Medium in die Spüle).
    8. Geben Sie 92 μl HBSS-HEPES-Assay-Puffer in jede Vertiefung und betrachten Sie die Zellen erneut mit einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass der überschüssige Farbstoff vollständig entfernt wurde und die Zellen adhärent bleiben.
    9. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 2 μl der Antagonistenlösungen und des Vehikels in die entsprechenden Vertiefungen zu geben (siehe Tabelle 1 für eine repräsentative Plattenkarte).

4. Durchführung des Kalziummobilisierungsassays

  1. Stellen Sie den Plattenleser wie folgt ein: Temperatur: 37 °C; Anregungswellenlänge: 485 nm; Emissionswellenlänge: 525 nm; Messhöhe: 7,8 mm (optimiert); Anzahl der Blitze: 100; Anzahl der Wiederholungen: 20.
  2. Inkubieren Sie die Platte 15 min lang im Plattenleser bei 37 °C. Messen Sie die Hintergrundfluoreszenz in den Spalten 1 und 2 (fünf Scans pro Well).
  3. Werfen Sie die Platte aus dem Plattenlesegerät aus und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette schnell 6 μl Agonistenlösung in jede Vertiefung in den Spalten 1 und 2 aus einem PCR-Streifen mit 8 Röhrchen.
    HINWEIS: Für diesen Schritt verwenden wir eine elektronische 8-Kanal-Pipette mit 0,1-10 μl Pipettenspitzen.
  4. Messen Sie die Änderung der Fluoreszenz, wenn die Kalziummobilisierung in den Zellen stattfindet. Führen Sie 20 Scans jeder Vertiefung gemäß den obigen Einstellungen durch.
    HINWEIS: Das Scannen jedes Wells in zwei Spalten mit jeweils 20x dauert ca. 5 Minuten (d. h. ~15 s zwischen den Scans jedes Wells).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 für die Spalten 3 bis 12 in zwei Spaltenschritten.

5. Datenanalyse

  1. Exportieren Sie Daten aus dem Assay als separate Tabellenkalkulationen für jede zweispaltige Gruppe.
  2. Ermitteln Sie den Durchschnitt der basalen Fluoreszenzmesswerte mit der Funktion AVG (erster Scan: letzter Scan). Tun Sie dies für jede Vertiefung in beiden Spalten.
  3. Ermitteln Sie die maximale Fluoreszenz nach Zugabe eines Agonisten mit der Funktion MAX (erster Scan: letzter Scan).
  4. Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenz, indem Sie die basale Fluoreszenz von der maximalen Fluoreszenz subtrahieren.
  5. Subtrahieren Sie die für die Negativkontrolle berechnete Änderung der Fluoreszenz (Addition eines Vehikels ohne Agonist) von jeder Vertiefung in derselben Spalte.
  6. Ermitteln Sie die relative (normalisierte) Änderung der Fluoreszenz, indem Sie die Fluoreszenzänderung in jedem Well durch die Änderung der Fluoreszenz im Vehikel (0,1 % DMSO/Wasser) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 teilen.
  7. Kopieren Sie die Nicht-Kontrollwerte als Prozentsätze in ein Statistik- und Grafiksoftwareprogramm. Wenn Sie die referenzierte Software verwenden, wählen Sie die Option XY-Tabelle, wobei die Zahlen als X-Achse ausgewählt sind und die Werte in nebeneinander liegenden Unterspalten als Y-Achse repliziert werden.
  8. Verwenden Sie das Programm, um Konzentrations-Wirkungs-Kurven (CRCs) aus den Daten zu zeichnen. Wenn Sie die referenzierte Software verwenden, wählen Sie die Option log(inhibitor) vs. response - Variable slope (four parameters).

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Zweck dieses Assays besteht im Allgemeinen darin, Konzentrations-Wirkungs-Kurven (CRCs) für drei bis vier neue Parmoduline zu erstellen. Auf jeder Assay-Platte wird oft ein zusätzlicher CRC für eine bekannte Verbindung, wie z.B. NRD-21, erzeugt, der aufgrund seines bekannten IC50 als Qualitätscheck für das Experiment dient. Zur Generierung von CRCs sollte eine Plattenkarte, wie sie in Tabelle 1 dargestellt ist, geplant werden. Wenn stattdessen Einzelpunkt-Konzentrationsreaktionen gewünscht sind, sollten Verbindungen mit Endkonzentrationen von 10 μM (oder anderen bevorzugten Konzentrationen) in mindestens drei Vertiefungen gegeben werden.

Bei der Durchführung des Assays sollte es zu einem schnellen Anstieg der Fluoreszenz kommen (der Anstieg sollte innerhalb der ersten 3-4 Scans beginnen), der vom Plattenleser angezeigt wird (siehe Abbildung 2A für eine Beispielausgabe im Vergleich zur fehlgeschlagenen Ausgabe in Abbildung 2B). Es ist wichtig zu beachten, dass der Agonist schnell (innerhalb von 15 s) hinzugefügt werden muss, damit der Platten-Reader den Anstieg der Fluoreszenz genau erfassen kann. In einem Arbeitsexperiment sollte das Fluoreszenzsignal für die Vehikelvertiefung flach bleiben, während das Fluoreszenzsignal in den positiven Kontrollvertiefungen (Vehikel + 6,5 μM TFLLRN-NH2) nach drei oder vier Scans ansteigen sollte. Sobald der Maximalwert erreicht ist (nach ~10 Scans), sollte das Fluoreszenzsignal langsam abzunehmen. In Experimenten mit hochwirksamen Antagonisten sollten die Vertiefungen mit den höchsten Konzentrationen an Antagonisten ein Signal haben, das relativ flach bleibt, ähnlich wie bei der Negativkontrolle. Es sollte auch kaum einen Unterschied zwischen dem Signal der positiven Kontrollvertiefungen und denen mit niedrigen Konzentrationen des Antagonisten geben (Abbildung 2C). Wenn die niedrigsten Konzentrationen des Antagonisten immer noch die Kalziummobilisierung hemmen, sollten die gescreenten Konzentrationen angepasst werden, um niedrigere Konzentrationen einzubeziehen. Generierte CRCs sollten mindestens einen Datenpunkt ~100% haben, um die sigmoidale Natur der Kurve vollständig darzustellen.

Das häufigste Anzeichen dafür, dass ein Experiment nicht funktioniert hat, ist, wenn die Positivkontrollvertiefung (Vehikel + 6,5 μM TFLLRN-NH2) keinen starken Anstieg der Fluoreszenz zeigt (Abbildung 2B). Dies kann aus verschiedenen Gründen geschehen: Die Zellzahl könnte niedrig sein (wenn die Konfluenz nicht bestätigt wurde), die Agonistenlösung könnte kompromittiert sein oder es könnten zu geringe Mengen an Farbstoff von den Zellen aufgenommen worden sein. Es ist auch möglich, bestimmten Vertiefungen versehentlich keinen Agonisten hinzuzufügen.

Bei einer programmierten Methode werden die Daten in sechs separaten Tabellenkalkulationen ausgegeben, die jeweils Daten für zwei Spalten enthalten. Die fünf Scans der basalen Fluoreszenz befinden sich in einer eigenen Reihe, wobei die 20 Scans nach Zugabe des Agonisten in der Zeile direkt darunter aufgenommen wurden (siehe Abbildung 3 für repräsentative Ausgabe). Für eine Beispielrechnung wird eine Säule aus einem Experiment mit NRD-21 verwendet. In der exportierten Datei (Abbildung 3) wird die basale Fluoreszenz aus jedem Well in die Spalten C bis G ausgegeben, und die Daten nach der Agonistenzugabe (die folgenden 20 Scans) werden in den Spalten C bis V in der nachfolgenden Zeile ausgegeben. Die Zeilen 14 bis 17 in der Datei enthalten die positive Kontrolle von zwei separaten Spalten. Der Durchschnitt der basalen Reihe für eine der positiven Kontrollvertiefungen wurde mit dem Befehl "=MITTELWERT(C16:G16)" berechnet, was einen Wert von 1.039,8 ergab. Dieser Befehl wurde für die zusätzlichen basalen Messungen in jeder Vertiefung wiederholt. Das Maximum der experimentellen Scans wurde mit dem Befehl "=MAX(C16:V16)" berechnet, was einen Wert von 2.629 ergab. Auch hier wurde der Befehl für alle Brunnen wiederholt. Die basale Fluoreszenz für jede Vertiefung wurde dann vom Maximalwert abgezogen. In diesem Experiment wurden die Daten normalisiert, indem die Änderung der Fluoreszenz in der Negativkontrolle von jedem Well subtrahiert wurde (die in der Beispielspalte 142,6 betrug). Diese Werte wurden dann durch den ähnlich berechneten Wert der Positivkontrolle dividiert. In dieser Spalte betrug der Maximalwert 2.629, die durchschnittliche Basalmessung 1.039,8 und der subtrahierte Wert für den Blindwert 142,6. Der adjustierte positive Kontrollwert beträgt somit 1.446,6 (berechnet aus der Gleichung). Diese Gleichung wird für jede Vertiefung in der Spalte wiederholt, und die berechneten Werte werden durch 1.446,6 dividiert, um ihre relative Änderung der Fluoreszenz zu erhalten. Die Kennzahlen wurden dann in Prozentsätze umgerechnet und in die Analysesoftware kopiert. Dieser Vorgang wurde für die anderen 11 Spalten wiederholt.

Um die Daten mit der referenzierten Software zu verarbeiten, sollte eine XY-Tabelle mit der Option ausgewählt werden, drei wiederholte Messungen in nebeneinander liegenden Spalten zu haben. Die -log-Werte jeder Konzentration sollten in die x-Werte eingegeben und die berechneten Prozentsätze zu den y-Werten addiert werden. Die Daten sollten einer nichtlinearen Regressionsanalyse unterzogen werden, die dazu führt, dass vier Konzentrations-Wirkungs-Kurven erstellt werden. Das Programm gibt auch IC50-Werte , quantifizierte Fehlerstatistiken und Statistiken zur Güte der Anpassung aus.

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Abbildung 1: Fluo-4/AM wird in EA.hy926-Zellen geladen. Fluo-4 wurde nach der Farbstoffinkubation und den Waschschritten selektiv in EA.hy926-Zellen geladen. Die gesamte Fluoreszenz befindet sich innerhalb der Zellen, ohne Farbstoffleckagen. Das Bild wurde mit der GTP-Einstellung eines EVOS Cell Imagers und einer 20-fachen Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Potentielle Ausgabe des Assays. (A) Repräsentative Ausgabe des Plattenlesers eines Arbeitsassays. Reihe A ist die Negativkontrolle und hat keine Änderung der Fluoreszenz. Reihe B ist die Positivkontrolle und zeigt einen schnellen Anstieg der Fluoreszenz. Die Reihen C-H sind die experimentellen Vertiefungen, wobei die höheren Konzentrationen von Parmodulin in der Platte niedriger sind. (B) Beispielausgabe eines fehlgeschlagenen Experiments. In Reihe B, der Positivkontrolle, ist kein Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten. (C) Veränderung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit, induziert durch den PAR1-Agonisten TFLLRN-NH2. Das Scannen von zwei Spalten einer 96-Well-Platte mit den bereitgestellten Einstellungen dauert ~5 Minuten auf dem PerkinElmer EnSpire-Plattenleser (d. h. ~15 s zwischen den Scans jeder Well). Verschiedene NRD-21-Lösungen sind wie angegeben, "Agonist" ist 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Beispiel für eine Excel-Ausgabe für einen funktionierenden Assay. Die basale Fluoreszenz wird in geradzahligen Zeilen ab Reihe 10 ausgegeben, und das Ergebnis der ersten 10 Scans nach der Agonistenaddition wird in den nachfolgenden ungeraden Zeilen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Robotergestütztes Liquid Handling vs. "Flicking". Das Vorbeschichten der Assay-Platten mit Gelatine und das manuelle Durchführen des Medienwechsels durch Schnippen der Platte und das Trockentupfen der Platte erzeugen Konzentrations-Wirkungs-Kurven mit geringerer Variabilität. (A) Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Parmoduline ML161 und NRD-21 und 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (automatisiertes Liquid Handling). (B) Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Parmoduline ML161 und NRD-21 und 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (gelatinierte, geflickte Platten). Die Daten beziehen sich ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Temperaturstudien. Die Durchführung des Assays bei 37 °C erzeugt mehr reproduzierbare Daten als bei Raumtemperatur. (A) Konzentrations-Wirkungs-Kurven von ML161 und 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (Raumtemperatur). (B) Konzentrations-Wirkungs-Kurven von ML161 und 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Die Daten beziehen sich ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Untersuchungen der Zelldichte. Die optimale Zelldichte beträgt 60.000 Zellen/Well, wenn die Aussaat 16-24 Stunden vor Beginn eines Assays erfolgt. (A) Konzentrations-Wirkungs-Kurven von TFLLRN-NH2 bei verschiedenen Zelldichten, n = 3. (B) Konzentrations-Wirkungs-Kurve von TFLLRN-NH2 bei der optimalen Zelldichte von 60.000 Zellen/Well. Die Daten beziehen sich ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-7
Abbildung 7: Assay-Volumen. Bei Verwendung eines Assay-Volumens von 100 μl werden reproduzierbarere Konzentrations-Wirkungs-Kurven erzeugt als bei Assays mit einem Endvolumen von 200 μl. (A) Konzentrations-Wirkungs-Kurven von ML161 und 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (200 μl Endvolumen). (B) Konzentrations-Wirkungs-Kurven von ML161 und 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (100 μL Endvolumen). Die Daten beziehen sich ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Generierung von Z'-Faktoren zur Bestimmung der Fähigkeit des Assays, eine Trefferverbindung zu erkennen. Calcium-Mobilisierungsreaktionen mit 6,5 μM TFLLRN-NH2 (Spalte B) plus optionalen PAR1-Antagonisten 10 μM NRD-21 (Spalte C) oder 0,316 μM Vorapaxar (Spalte D). (A) Der Assay wurde 16 Stunden nach der Zellaussaat abgeschlossen. (B) Der Assay wurde 24 Stunden nach der Zellaussaat abgeschlossen. (C) Tabelle der berechneten Z'-Faktoren unter Verwendung der folgenden Gleichung: figure-results-9, wobei σp die Standardabweichung der Positivkontrolle, σn die Standardabweichung für die Negativkontrolle oder Stichprobe, μp der Mittelwert der Positivkontrolle und μn der Mittelwert der Negativkontrolle oder Stichprobe ist. Jeder Wert wird berechnet, indem Fahrzeug + 6,5 μM TFLLRN-NH2 als Positivkontrolle bezeichnet und mit dem angegebenen Zustand als Negativkontrolle (Fahrzeug) oder Probe (NRD-21 und Vorapaxar) verglichen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Calciummobilisierung durch einen PAR2-Agonisten. Änderung der Fluoreszenz über die Zeit, induziert durch 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Die Daten sind Mittel ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Beispiel für eine 96-Well-Plattenkarte für das Screening von Verbindungen. Jede Konzentration wird in dreifacher Ausfertigung gemessen. Reihe A enthält Negativkontrollen (kein Antagonist, kein Agonist) und Reihe B enthält Positivkontrollen (kein Antagonist, Agonist). Die Spalten 1 bis 3 enthalten sechs halbe Log-Konzentrationen des Parmodulins NRD-21, die optional zur Qualitätskontrolle verwendet werden können. PM-A, PM-B, PM-C sind unbenannte Parmoduline. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Vergleich des zuvor veröffentlichten Protokolls und des neuen, optimierten Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

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Während das zuvor berichtete Protokoll72 im Allgemeinen zuverlässig war und es uns ermöglichte, ein neues Leitparmodulin zu identifizieren, war NRD-21,62 ein effizienteres Protokoll gewünscht. Der Assay wurde während der durch die COVID-19-Pandemie verursachten Lieferengpässe weiter beeinträchtigt. Die Beschaffung von Spitzen für den automatisierten Liquid Handler wurde schwierig, und der Versuch, die Spitzen zu waschen, zu sterilisieren und wiederzuverwenden, führte zu Darmkrebs mit erheblicher Varianz. Dies ermöglichte eine dringende Reihe von Experimenten, die darauf abzielten, einen verbesserten PAR-gesteuerten Kalziummobilisierungsassay zu rationalisieren.

Die Identifizierung einer validen Alternative zum Einsatz des automatisierten Liquid Handlers für Waschschritte stand in dieser Studie im Vordergrund. Während der bisherigen Assay-Entwicklung wurden durch den Einsatz des robotergestützten Liquid Handlers Fehler reduziert, die durch manuellen Medienwechsel verursacht wurden. Dies verlängerte jedoch die Zeit des Assays erheblich, da der Medienaustausch mit dem 8-Kanal-Liquid-Handler die Gesamtzeit jeder Assay-Platte um 30-45 Minuten verlängerte. Obwohl zuvor eine "Flicking"-Methode des Medienaustauschs ausprobiert worden war, wurden diese Experimente durchgeführt, ohne dass die Assay-Platten vor der Zellaussaat mit Gelatine beschichtet wurden. Durch die Vorbehandlung der Platten mit Gelatine wurde sichergestellt, dass die Zellen unabhängig von der Kraft, die zur manuellen Entnahme des Mediums aufgewendet wird, an Ort und Stelle bleiben. CRCs, die in einem Assay mit gelatinebeschichteten, geflickten Platten erzeugt wurden, wiesen an mehreren Datenpunkten bessere Anpassungswerte und kleinere Fehlerbalken auf als Kurven, bei denen der automatisierte Liquid Handler verwendet wurde (Abbildung 4). Die RMSE-Werte (Root-Mean-Square Error) für die Platte mit dem automatisierten Liquid Handler betrugen 9,687 für die ML161-Kurve und 10,690 für die NRD-21-Kurve, während die RMSE-Werte für die Platte mit Gelatine und manuellem Medienaustausch 7,658 für die ML161-Kurve und 6,408 für die NRD-21-Kurve betrugen. Niedrigere RMSE-Werte geben eine Kurve an, die besser zu den angegebenen Daten passt. Diese Änderung reduziert auch die Gesamttestzeit erheblich. Alternativ kann auch eine mehrkanalige automatisierte Blechwaschanlage eingesetzt werden.

Die Methode der Agonistenaddition war ein zusätzlicher Faktor, der untersucht wurde. Dies geschah, um festzustellen, ob Agonist zu allen Plattenvertiefungen gleichzeitig hinzugefügt werden konnte, gefolgt von einem Scan der gesamten Platte auf einmal; Dadurch müssten die Forscher für die Dauer des zeitkritischen Assays nicht mehr in der Nähe des Plattenlesegeräts bleiben, um zahlreiche separate Agonistenzugaben zu erhalten, was den Durchsatz erheblich erhöhen könnte. Leider war die Zugabe eines Agonisten zu allen Vertiefungen und das Scannen der gesamten Platte problematisch, da die Reaktion zu schnell ist, um die vorübergehende maximale Kalziumkonzentration in jeder Vertiefung zuverlässig zu messen, was zu sehr variablen Darmkrebs führt. Die Reduzierung der Anzahl der gescannten Säulen von 12 auf 6 verbesserte die Ergebnisse leicht, aber die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn nur zwei Säulen (16 Vertiefungen) gleichzeitig gescannt wurden. Man könnte die Hypothese aufstellen, dass eine Reduzierung der Temperatur des Assays von 37 °C auf Raumtemperatur die Änderung der Kalziumkonzentration so weit verlangsamen könnte, dass zuverlässige Messungen möglich sind. Obwohl mehrere Calciummobilisierungsprotokolle mit unterschiedlichen Farbstoffen oder Zelllinien bei Raumtemperatur validiert wurden 78,79, werden in diesem speziellen Assay verbesserte Ergebnisse bei 37 °C beobachtet. Die gemessenen Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Antagonisten bei Raumtemperatur (~23 °C) waren nicht so einheitlich wie bei 37 °C (Abbildung 5A vs. Abbildung 5B). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde festgestellt, dass das Scannen von zwei Säulen gleichzeitig bei 37 °C optimal ist.

Eine weitere Variable, die untersucht wurde, um die Assay-Zeit zu verkürzen, war die Inkubationszeit des Antagonisten. Im vorherigen Protokoll wurden die Antagonisten vor der Agonistenzugabe 40 Minuten lang inkubiert, aber hier wurde festgestellt, dass 15 Minuten ausreichend Zeit für Parmoduline sind, um mit PAR1 zu interagieren. Dies wurde getestet, indem Parmodulinlösungen gleichzeitig zu mehreren Säulen hinzugefügt wurden, gefolgt von der Zugabe eines Agonisten zu unterschiedlichen Zeitpunkten (der Agonist wurde bei t = 15 min, 30 min und 45 min hinzugefügt). Die Aktivität der Parmoduline wurde beibehalten, aber nicht verbessert, indem die Antagonisten länger inkubiert wurden. Als Ergebnis dieser Erkenntnis werden im neuen Protokoll Antagonistenlösungen auf einmal zur gesamten Platte und Agonistenlösungen nach einer Inkubation von 15 Minuten zu den ersten Säulen hinzugefügt. Diese Änderung reduziert die Gesamtversuchszeit um weitere 30 Minuten. Es sollte beachtet werden, dass Antagonisten mit langsamer Bindungskinetik, wie z. B. Vorapaxar, längere Inkubationszeiten erfordern können80,81.

Während die Verkürzung der Assay-Zeit und die Eliminierung der Abhängigkeit vom Liquid Handler die Hauptfaktoren waren, die eine Aktualisierung des Assay-Protokolls erforderlich machten, wurde auch eine alternative Zellkultivierungsmethode getestet. Früher wurden die Platten mit Zellen direkt aus gefrorenen Beständen besät und nach der Aussaat 40-48 h in den Platten wachsen gelassen. Die verlängerte Zeit zwischen dem Aussäen der Platten und der Durchführung von Assays schränkte jedoch die Anzahl der Experimente ein, die pro Woche durchgeführt werden konnten. Durch die Verwendung von Zellen, die in Kulturkolben gezüchtet wurden, wird diese Zeit drastisch reduziert. Die Zellen wurden in mit Gewebekulturen behandelten T-75-Kolben gezüchtet und mit Hilfe eines nicht-enzymatischen Zelldissoziationsmittels von der Kolbenoberfläche entfernt. Dies kann wichtig sein, um eine Schädigung bestimmter Zelloberflächenrezeptoren, insbesondere PAR2, mit Trypsin zu vermeiden. Nach der Zugabe zur Assay-Platte benötigen die Zellen ausreichend Zeit, um sich abzusetzen und an der Gelatine zu haften. Da die Flicking-Methode der Medienentfernung auch Zellen verdrängen kann, wird genügend Zeit benötigt, damit sich die Zellen in die Gelatine einbetten können. Ein Experiment, bei dem sich die Zellen zwei Stunden lang ansiedeln konnten, führte zu einem signifikanten Verlust von Zellen, was zu einem unbrauchbaren Assay führte (Daten nicht gezeigt). Absetzzeiten zwischen 2 h und 12 h begrenzen die Anzahl der Platten, die an einem einzigen Tag analysiert werden können, so dass eine längere Inkubation über Nacht bevorzugt wird. Es zeigte sich, dass die Inkubation der neu kultivierten Zellen zwischen 16 und 24 Stunden es den Zellen ermöglichte, vollständig an der Gelatine zu haften, und es können reproduzierbare Daten erhalten werden.

Der Wechsel von gefrorenen zu in Kulturflaschen gezüchteten Zellen veränderte auch die optimale Zellaussaatdichte. Wie vorherzusehen war, ermöglichte das Aussaaten von Wells mit der im vorherigen Protokoll üblichen Dichte von 25.000 Zellen/Wells den Zellen nicht, die Konfluenz mit einer kürzeren Inkubationszeit zu erreichen. Agonisten-CRCs wurden mit acht separaten Zelldichten erzeugt, um optimale Bedingungen zu bestimmen (Abbildung 6). Zuvor wurde TFLLRN-NH2 als PAR1-Agonist bei 5 μM verwendet, da dies einen vernünftigen Antagonismus mit Parmodulinen mit geringerer Löslichkeit ermöglichte. Es gibt keinen signifikanten Unterschied im Hintergrund- oder Maximalsignal bei der Aussaat mit 45.000-65.000 Zellen/Well, aber es gibt eine Abnahme der Variabilität mit 5 μM TFLLRN-NH2 bei der Zugabe von 60.000 Zellen/Well. Interessanterweise gibt es bei einer höheren Anzahl von Zellen keinen signifikanten Anstieg der maximalen Fluoreszenz, so dass aufgrund der verringerten Variabilität 60.000 Zellen/Well als optimale Dichte gewählt wurde. Agonisten-CRCs erzeugten auch einen EC50 von 6,5 μM für TFLLRN-NH2, so dass dies als neue Standard-Agonistenkonzentration gewählt wurde.

Ein weiterer Faktor, der analysiert wurde, waren die im Assay verwendeten Volumina. Im vorherigen Protokoll wurden 2 μl Agonist in jede Vertiefung gegeben, um ein endgültiges Assay-Volumen von 200 μl zu erhalten. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Zugabe größerer Volumina an Agonistenlösung – aber die Endkonzentration konstant halten – das Mischen unterstützen könnte, was zu einem schnelleren und zuverlässigeren Signal führt. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Zugabe von 2 μL, 6 μL und 10 μL TFLLRN-NH2 in entweder 100 μL oder 200 μL HEPES-HBSS in einer Testplatte verglichen, die unterschiedliche Konzentrationen von NRD-21 enthielt. Es wurden CRCs von NRD-21 aus jeder Bedingung generiert, um zu bestimmen, welche Kombination aus Agonistenvolumen und endgültigem Assay-Volumen die konsistentesten Daten lieferte. Während sowohl 2 μL als auch 6 μL Zugaben zu erzeugten CRCs mit geringer Variabilität führten, konnte dies nicht über Kurven gesagt werden, die aus der Zugabe von 10 μL TFLLRN-NH2 erzeugt wurden (Daten nicht gezeigt); Die Erhöhungen der Fluoreszenz waren in diesen Vertiefungen weder in der Größe noch im Timing konsistent, was zu Darmkrebs führt, die identisch sein sollten, sich aber stattdessen drastisch unterscheiden. Obwohl die Zugabe von 2 μl und 6 μl zu ähnlichen Ergebnissen führte, erfolgte die Änderung der Fluoreszenz viel schneller durch die Zugabe von 6 μl TFLLRN-NH2, wodurch die Gesamtzahl der Scans in jedem Well von 40 auf 20 Scans halbiert werden konnte. Es wurde auch festgestellt, dass die Verwendung eines Endvolumens von 100 μL im Vergleich zu solchen, die mit einem Endvolumen von 200 μL erzeugt werden, gleichmäßigere CRCs erzeugt (Abbildung 7).

Um festzustellen, ob das neue Protokoll für Assays mit höherem Durchsatz geeignet ist, wurden die Z'-Faktoren für den Assay berechnet (Abbildung 8). Ein Z'-Faktor ist eine statistische Methode, die die Qualität eines Screening-Assays misst und bestimmt, ob ein Assay aktive und inaktive Verbindungen zuverlässig unterscheidet82. Die Z'-Faktoren wurden für Assays berechnet, die zwischen 16 und 24 Stunden nach der Aussaat der Platten und an verschiedenen Zellpassagen durchgeführt wurden. In allen Fällen – sowohl für den reinen Agonisten als auch für den Agonisten plus Antagonisten – waren die berechneten Z'-Faktoren größer als 0,5, was auf einen hervorragenden Assayhinweist 82. Die berechneten Z'-Faktoren waren ebenfalls ähnlich wie bei den vorherigen Assays, was darauf hindeutet, dass die Änderungen am Protokoll zur Erstellung eines schnelleren Assays die Qualität nicht negativ beeinflusst haben.

Das Protokoll für die PAR-getriebene Calciummobilisierung wurde durch Experimente zur Generierung von IC50-Werten aus Darmkrebs aktualisiert, aber der Assay kann auch zur Messung der Wirksamkeit von PAR1-Antagonisten bei Einzelkonzentrationen verwendet werden. Der Assay kann auch zur Messung der Aktivität von PAR2-Liganden verwendet werden; zum Beispiel kann der PAR2-Agonist SLIGKV-NH2 TFLLRN-NH2 im aktualisierten Protokoll ersetzen (Abbildung 9); das vorherige Protokoll wurde auch mit PAR2-Agonisten und -Antagonisten verwendet83. Obwohl dieses Protokoll hier nicht explizit getestet wurde, sollte es auch auf humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC) anwendbar sein, die mit dem vorherigen Protokoll verwendet wurden, und möglicherweise auf andere adhärente Zelllinien. Eine Einschränkung bei der Verwendung eines Scanning-Plate-Readers mit Protokollen wie diesem besteht darin, dass sie nicht für die Untersuchung schneller Reaktionen (unter einer Sekunde) geeignet sind, zumindest nicht parallel, wie es mit einem Plate-Imager möglich ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass hier ein schnelleres und einfacheres Protokoll für den endothelialen PAR-gesteuerten Calciummobilisierungsassay unter Verwendung eines Plattenlesegeräts vorgestellt wird. Durch den Wegfall eines automatisierten Liquid Handlers, die Verkürzung der Inkubationszeit der Antagonisten und die Verringerung der Anzahl der Scans für jede Vertiefung wurde die Gesamt-Assay-Zeit um mindestens 90-120 Minuten verkürzt und die Assay-Kosten gesenkt (für einen Vergleich zwischen den zuvor berichteten und den aktuellen Protokollen siehe Tabelle 2). Dies ermöglicht nicht nur das Screening von mehr Verbindungen pro Tag, sondern eliminiert auch das Risiko eines verkleinerten Testfensters durch Farbstoffausfluss, was zu unzuverlässigen Ergebnissen führen könnte. Der neu optimierte Assay ermöglicht das schnellere Screening von PAR1- oder PAR2-Liganden oder potenziell anderen GPCR-Liganden, die die intrazelluläre Kalziummobilisierung aktivieren, in Laboren, die auf den Einsatz von Plattenlesegeräten beschränkt sind.

Offenlegungen

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C.D. ist Erfinder von Patenten mit Parmodulinen und Gründer und Anteilseigner von Function Therapeutics, Inc., das Parmoduline für den klinischen Einsatz entwickelt.

Danksagungen

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Wir danken Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) und Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) für die Bereitstellung von Raum und indirekter Unterstützung dieses Projekts sowie Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) für sachdienliche Beratung. Wir danken dem National Heart, Lung, and Blood Institute (R15HL127636), dem U.S. Department of Defense (W81XWH22101) und der National Science Foundation (2223225) für die Unterstützung durch die Zuschüsse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociationReagenz Corning25-056-CITrypsin kann optional verwendet werden, sollte aber bei PAR2-Assays unbedingt vermieden werden.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenolredCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatine aus SchweinehautMilliporeSigmaG2500Zur Herstellung einer wässrigen 0,4%igen (w/v) Lösung mit deionisiertem Wasser verwenden. Vor Gebrauch zum Sterilisieren autoklavieren.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Corning21-040-CV
Trypanblau (0,4 % w/v)Corning25-900-CI
stark>Calcium-Mobilisierungsreagenzien
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)Thermo172571000
Rinderserumalbumin (BSA)Avantor97061-420
Calciumchlorid-DihydratThermo42352-0250
DimethylsulfoxidThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's ausgewogene Salzlösung (Ca/Mg/phenolrotfrei)Corning21-022-CV
Magnesiumchlorid-HexahydratMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
NatriumhydroxidVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA-Salz)Hergestellt von Trudy Holyst im Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well kulturbehandelte, schwarzwandige, durchsichtige Testplatte mit klarem BodenCorning3603mit transparenten Deckeln
Zentrifugenröhrchen, 15 mLAvantor89039-664
Zentrifugenröhrchen, 50 mLAvantor89039-656
Kulturflasche, T-75Corning353136Gewebekultur behandelt
Einweg-Reagenzreservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Perkin ElmerAbgekündigtes
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mLAvantor20170-038
Pasteurpipette, 9"Fisher13-678-6Bmuss sterilisiert werden
PCR-Röhrchenstreifen mit separater Fläche KappenstreifenAvantor76318-802
Pipettenspitzen, 20 & Mikro; LBiotix63300042sterile, gefilterte Spitzen
Pipettenspitzen, 200 & Mikro; LBiotix63300044sterile, gefilterte Spitzen
Pipettenspitzen, 1250 & micro; LBiotix63300047sterilen, gefilterten Spitzen
PrismGraphPadVolume 6 gebrauchte
serologische Pipette, 5 mLTradewinds Direct  07-5005
Serologische Pipette, 10 mLTradewinds Direct  07-5010
Serologische Pipette, 25 mLTradewinds Direct  Tel.: 07-5025
< Enspire Plate Reader

Referenzen

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