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Methodenartikel

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

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DOI:

10.3791/66509

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6. September 2024

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von Organoiden von Melanompatienten vor, indem disassoziierte Zellsuspensionen aus frischem Melanomgewebe kultiviert werden. Diese Organoide rekapitulieren patientenspezifische Tumore in vitro originalgetreu und bieten einen innovativen Ansatz zur Erforschung immunsuppressiver Mechanismen von Tumoren, des Wirkstoffscreenings, der Arzneimittelresistenzmechanismen und der Krebsüberwachungsansätze.

Zusammenfassung

Mit der Entwicklung der Immuntherapie besteht ein anhaltender Bedarf, Modelle zu entwickeln, die die Tumormikroumgebung von nativen Tumoren rekapitulieren können. Traditionelle zwei- und dreidimensionale Modelle können zwar Einblicke in die Entstehung und den Verlauf von Krebs bieten, aber es fehlen entscheidende Aspekte, die eine originalgetreue Nachahmung nativer Tumoren behindern. Ein alternatives Modell, das viel Aufmerksamkeit erregt hat, ist das von Patienten abgeleitete Organoid. Die Entwicklung dieser Organoide rekapituliert die komplexe interzelluläre Kommunikation, die Tumormikroumgebung und die Histoarchitektur von Tumoren. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Etablierung von Melanom-Patienten-abgeleiteten Organoid-Modellen (MPDO) beschrieben. Um diese Modelle zu validieren, untersuchten wir die Zusammensetzung der Immunzellen, einschließlich der Expressionsniveaus von T-Zell-Aktivierungsmarkern, um die zelluläre Heterogenität der Organoide zu bestätigen. Um den potenziellen Nutzen von MPDOs in zellulären Therapien zu beschreiben, untersuchten wir außerdem die zytotoxischen Fähigkeiten der Behandlung der Organoide mit γδ T-Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MPDO-Modelle vielversprechende Wege bieten, um die Komplexität von Tumoren zu verstehen, therapeutische Strategien zu validieren und möglicherweise die personalisierte Behandlung voranzutreiben.

Einleitung

Konventionelle 2-D-Zellkulturmodelle sind in der Krebsforschung ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung des Krebsverlaufs und der Krebstherapie1. Diese Modelle ermöglichen nicht nur kontrollierte experimentelle Bedingungen, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Krebsentstehung und -progression zugrunde liegen, sondern liefern auch kostengünstige und relativ schnelle experimentelle Ergebnisse. Ihre Verwendung ist jedoch aufgrund der begrenzten zellulären Diversität in der Tumormikroumgebung (TME) eingeschränkt, die in einer koplanaren Natur von Monokulturmodellen nicht rekapituliert werden kann2. Darüber hinaus bieten Zellkulturmodelle im Vergleich zum menschlichen Körper eine stark vereinfachte Umgebung3. Um das Fortschreiten der Krebserkrankung besser zu verstehen und wirksame Behandlungen zu entwickeln, haben sich die Forscher daher innovativen Modellen zugewandt, die darauf abzielen, die TME in der Natur genau zu rekapitulieren. Folglich ist die Aufrechterhaltung der Treue zu nativen Tumoren in diesen Modellen von größter Bedeutung. Angesichts der komplizierten Natur von Krebs könnte jede signifikante Abweichung vom ursprünglichen Tumor unvorhergesehene Variablen einführen, die aussagekräftige Schlussfolgerungen über das Tumorverhalten verwirren könnten.

Während sich patienteneigene Xenotransplantate (PDX) als Modellsystem herausgestellt haben, das die Überwachung der Tumorprogression in vivo ermöglicht, stellen einige Einschränkungen in Frage, wie gut der entwickelte Tumor die menschliche Krebsbiologie rekapituliert4. Zum Beispiel enthält Melanom TME tumorinfiltrierende Immunzellen und Stromazellen. Bei der Passage als Xenotransplantat gehen die Nicht-Krebszellen des Patienten allmählich verloren, wodurch Anpassungen vorgenommen werden können, die sich von denen in Patiententumoren unterscheiden. Während diese Einschränkungen durch begrenzte Passagen des PDX in vivo gemildert werden können, können die Unterschiede zwischen den Spezies immer noch ein Risiko für genetische Veränderungen des PDX darstellen, die von denen des nativen Tumors abweichen5. Darüber hinaus werden PDX-Modelle in der Regel in immungeschwächten Mäusen etabliert, um die Abstoßung von menschlichem Gewebe zu verhindern. Dies schränkt die Möglichkeiten ein, die Rolle des Immunsystems des Wirts bei Krebs zu untersuchen, insbesondere in immuntherapeutischen Studien6. Wir und andere haben PDXs in "humanisierte" Mäuse transplantiert 7,8. Die Etablierung von PDX-Modellen in humanisierten Mäusen ist jedoch zeitaufwändig und teuer. Es kann mehrere Monate bis Jahre dauern, ein einzelnes PDX-Modell aus der Tumorprobe eines Patienten zu entwickeln, was die Geschwindigkeit und den Umfang der Forschung einschränkt. Trotz dieser Einschränkungen hat sich gezeigt, dass PDX-Modelle die Biologie der TME genau repräsentieren und daher unter anderem für die Entwicklung von Krebstherapeutika, personalisierter Medizin und Immuntherapie ausgiebig eingesetzt wurden9.

Eine alternative 3D-Kulturtechnik, die sich entwickelt hat, ist das patientenabgeleitete Organoid (PDO), bei dem ein frisch resezierter Patiententumor kultiviert wird, um Modelle zu erstellen, die die phänotypische Heterogenität, Histoarchitektur und interzelluläre Kommunikation beibehalten10. Seine Fähigkeit, nativen Tumoren sehr ähnlich zu sein, wurde bereits gezeigt, indem kultivierte Organoide aus nicht-muskelinvasivem (NMIBC) und muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) erfolgreich Schlüsselaspekte der elterlichen Tumoren rekapitulierten11. Aufgrund ihres Potenzials und ihrer Vorteile gegenüber anderen Modellen bieten PDOs eine Vielzahl von maßgeschneiderten Anwendungen, die anderen Modellen fehlen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Erforschung und Entwicklung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren sowie zellulären und zielgerichteten Therapien. Zum Beispiel haben wir zuvor Melanom-Patienten-abgeleitete Organoide (MPDOs) verwendet, um die Fähigkeit von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zu untersuchen, durch IL-2 und Anti-PD1-Antikörper (αPD-1) erweitert zu werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die durch IL-2 und αPD-1 verstärkten TILs nicht nur eine höhere Anzahl aufwiesen, sondern auch MPDOs erfolgreich infiltrieren und Melanomzellen mit höherer Effizienz abtöten konnten als TILs, die mit anderen Methoden expandiert wurden12. Andere Gruppen haben ähnliche Ergebnisse gezeigt, bei denen die Verwendung von Anti-PD-1 und/oder Anti-PD-L1 dazu führt, dass TILs in PDOs funktionsfähig bleiben, was in der Folge zur Tumorabtötung führt13. Darüber hinaus hat unsere Gruppe MPDOs auch verwendet, um die Infiltration und Abtötungsfähigkeit von γδ-T-Zellen zu beurteilen14. Die Anwendbarkeit von PDOs erstreckt sich über ein breites Spektrum von Bereichen, darunter TIL-Expansion, Zytotoxizitätsstudien und das Screening kleiner Moleküle. All diese Anwendungen unterstreichen das Potenzial und die Benutzerfreundlichkeit, die dieses Modell mit sich bringt. Daher beschreiben wir das detaillierte Protokoll für die Kultur von MPDOs.

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Protokoll

Humanes Melanomgewebe wurde von Patienten gewonnen, die an der University of Pennsylvania unter Verwendung des Gewebeentnahmeprotokolls (UPCC08607) behandelt wurden, das vom Institutional Review Board der University of Pennsylvania genehmigt wurde. Alle Patienten haben eine Einverständniserklärung unterschrieben. Nach der Resektion des humanen Melanomgewebes wird das Tumorgewebe in das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco gelegt und bis zur Verarbeitung (innerhalb von 6 h) bei 4 °C gehalten. Melanom-Patienten-derived Organoide (MPDOs) wurden aus einem frischen Tumor gewonnen, wie in Abbildung 1 dargestellt.

1. Isolierung von Zellen aus menschlichem Melanomgewebe

  1. Vorbereitungen vor Beginn des Eingriffs
    HINWEIS: Zwei Kulturmethoden (Matrigel und Kollagengel) können verwendet werden, um dissoziiertes Melanomgewebe zu kultivieren:
    1. Für die Matrigel-Methode: Bereiten Sie eine Beschichtungslösung aus Wachstumsfaktor-reduzierter (GFR) Basalmembranmatrix her, indem Sie die GFR-Basalmembranmatrix mit organoidem Kulturmedium (siehe Tabelle 1) im Verhältnis 1:2 verdünnen. Geben Sie etwa 115 μl der aufgetauten Lösung in jede der mehreren Vertiefungen einer 48-Well-Platte und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator erstarren.
    2. Für die Kollagen-Gel-Methode: Geben Sie 1 ml Kollagengel (siehe Tabelle 1) in eine 30 mm dicke innere Membraneinlage. Lassen Sie das Gel 30 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator erstarren.
  2. Bereiten Sie das L-WRN konditioniertes Medium15 vor. L-WRN-konditioniertes Medium wird aus einer L-WRN-Zelllinie hergestellt, die so entwickelt wurde, dass Wnt3a, R-Spondin 3 und Noggin in einem einzigen konditionierten Medium sezerniert wird, das häufig für Zellkulturen verwendet wird.
    1. Tauen Sie ein Kryoröhrchen mit L-WRN-Zellen im 37 °C warmen Wasserbad auf. 5 ml L-Zell-Medium (siehe Tabelle 1) und die L-WRN-Zellsuspension werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen gegeben und bei 120 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand an und stellen Sie sicher, dass ~500 μl am Boden verbleiben, um das Pellet der Zellen zu resuspendieren.
    2. Übertragen Sie das Zellpellet im Überstand in 30 mL L-Zellmedium auf Eis und fügen Sie 150 μl Hygromycin (500 μg/ml) und 300 μl G418 (500 μg/ml) hinzu. Die Zellen werden mit einer Dichte von 3 × 106 auf einen T-150-Kolben ausgesät und bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bis ~90 % konfluent inkubiert.
    3. Sobald die Zellen zu ~90 % konfluiert sind, teilen Sie die Zellen in fünf T-150-Kolben auf, indem Sie sie mit 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, aspirieren und mit 3 ml Trypsinersatz verdauen. Nach 5 min mit 9 mL L-Zell-Medium neutralisieren und anschließend 5 min bei 120 × g bei 4 °C zentrifugieren. Wenn ~100 % zusammenfließen, teilen Sie die fünf T-150-Kolben in 10 T-175 3-Lagen-Kolben auf.
    4. Sobald sie zusammenfließen, waschen Sie die Zellen mit 2 x 50 mL PBS und dann mit 25 mL Waschmedium (siehe Tabelle 1).
    5. 75 ml Primärkulturmedium in jeden T-175 3-Schicht-Kolben geben und 3 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 inkubieren (siehe Tabelle 1).
    6. Nach 3 Tagen ernten Sie das konditionierte Medium in einen konischen 50-ml-Behälter und schleudern Sie ihn 5 Minuten lang bei 4 °C bei 1.100 × g . Sammeln Sie den Überstand (konditioniertes Medium) und stellen Sie sicher, dass 5 ml zurückbleiben.
    7. Geben Sie frische 75 ml primäres Zellkulturmedium in jeden T-175 3-Schicht-Kolben und inkubieren Sie weitere 3 Tage, um zusätzliches konditioniertes Medium zu sammeln.
    8. Dem gesammelten konditionierten Medium wird das gleiche Volumen des primären Zellkulturmediums (50 % Volumen) zugesetzt und der Inhalt mit einem 0,22-μm-Filter vakuumfiltriert. Lagern Sie Aliquots in 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei -20 °C für den Langzeitgebrauch oder 4 °C für bis zu 2-3 Wochen. Verwenden Sie dieses Medium als Ergänzung zu den Organoid-Kulturmedien (siehe Tabelle 1).
      HINWEIS: Tauen Sie die Aliquoten vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C auf.
  3. Gewinnung des Zellgemischs aus frischem Melanomgewebe
    1. Waschen Sie das frisch resezierte Melanomgewebe in einer 10-ml-Petrischale mit Waschmedium. Nach der ersten Spülung überführen Sie den Tumor mit einer sterilen Pinzette in eine zweite Petrischale, um ihn weiter zu waschen, und wiederholen Sie diesen Vorgang 3x auf Eis, um die Integrität und Lebensfähigkeit des Tumors zu erhalten. Verwenden Sie während dieser Spülzyklen eine sterile Schere und eine Klinge, um überschüssiges Bindegewebe, Fett und Blutreste zu entfernen. Legen Sie den Tumor nach den drei Waschgängen in eine leere Petrischale und hacken Sie ihn mit sterilen Klingen fein auf.
      HINWEIS: Nach dem Zerkleinern sollte der Tumor eine gelartige Konsistenz aufweisen. Je feiner der Tumor zerkleinert wird, desto höher ist die Zellausbeute. Dies liegt daran, dass größere Klumpen des Tumors schwieriger zu verdauen sind und im nächsten Schritt möglicherweise nicht durch das 70 μm Nylon-Zellsieb gelangen.
    2. Nachdem das Tumorgewebe gründlich gewaschen und zerkleinert wurde, wird es in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 10 ml des vorbereiteten Verdauungsmediums überführt (siehe Tabelle 1). Stellen Sie den Konus in ein Wasserbad bei 37 °C und achten Sie darauf, dass der Inhalt alle 5 Minuten vortext wird.
    3. Nach 25 Minuten fügen Sie 30 ml des ADMEM/F12-Mediums mit 10 % FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
      HINWEIS: Diese angegebenen Mengen sind für Tumoren mit einem Gewicht von nicht mehr als 0,2 g bestimmt.
    4. Filtrieren Sie die verdaute Zellsuspension durch ein 70 μm Nylon-Zellsieb und spülen Sie das Sieb dann mit ADMEM/F12 (1x) reduziertem Serummedium (1:1) mit 10 % FBS. Verwenden Sie nach dem Waschschritt eine Pipette, um alle verbleibenden Medien am Boden des Filters zu entfernen, um sicherzustellen, dass die höchstmögliche Anzahl von Zellen entnommen wird. Anschließend bei 300 × g 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand ist zu verwerfen und das Pellet in einem Organoid-Kulturmedium zu resuspendieren (siehe Tabelle 1).
    5. Kultivieren Sie die Melanom-Einzelzellsuspension entweder in Matrigel- oder Kollagen-Kultursystemen:
      1. Matrigel: Zählen Sie die Einzelzellsuspension, um sicherzustellen, dass etwa 2 × 105 Zellen in die vorgewärmten Matrigel-beschichteten Vertiefungen ausgesät werden, die mit 200 μl Organoid-Kulturmedium ergänzt werden.
        HINWEIS: Matrigel-basierte Organoide werden verwendet, um die Pathophysiologie zu untersuchen, die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu überprüfen und die Toxizität von Arzneimittelnzu testen 16.
      2. Kollagengel: Zählen Sie die einzellige Suspension, um sicherzustellen, dass etwa 106 Zellen mit 1 ml Kollagengel gemischt werden. Geben Sie die Mischung zu den vorverfestigten Kollagen-Gel-Membraneinsätzen und geben Sie diese in eine 6-Well-Platte. Fügen Sie genügend Organoid-Kulturmedium hinzu, um die Einsätze mit den Zellen und dem Kollagengel einzutauchen.
        HINWEIS: Kollagengel-Organoide werden verwendet, um die T-Zell-Migration zu messen und die Gewebeentwicklungzu untersuchen 16.
    6. Lassen Sie die Organoide wachsen und stellen Sie sicher, dass alle 3 Tage frisches Medium hinzugefügt wird.
    7. Lassen Sie die Organoide passieren, sobald sie eine Größe von 150-200 μm erreicht haben, oder konservieren Sie sie bis zur weiteren Verwendung.
      1. Für die Passage der Organoide die Organoide in ein konisches 15 mL Format überführen und mit 1x DPSB waschen. Die Mischung bei 300 × g 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie den Trypsinersatz (50-100 μl pro Organoid) für 10 min in ein 37 °C heißes Wasserbad, wobei darauf zu achten ist, dass der Inhalt alle 3 Minuten vortexiert wird.
      2. Stoppen Sie die Verdauung mit ADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) Medium mit 10% FBS. Die Mischung wird 7 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und in organoidem Nährmedium resuspendiert.
      3. Die Einzelzellsuspension wird in eine neue Matrigel/Kollagen-beschichtete Vertiefung mit der gleichen anfänglichen Aussaatdichte ausgesät (2 × 105 Zellen in 200 μl Organoid-Kulturmedium für Matrigel-beschichtete Vertiefungen in einer 48-Well-Platte oder 106 Zellen in 1 ml Organoid-Kulturmedium für kollagenbeschichtete 30 mm innere Membraneinlage).
      4. Für die Kryokonservierung werden MPDOs unter Verwendung des Trypsin-Ersatzes in Einzelzellsuspensionen verdaut, gefolgt von der Resuspension von 106 Zellen in 1 ml Gefriermedium (siehe Tabelle 1).

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Ergebnisse

Die Form und Größe der MPDOs wurden im Laufe der Zeit überwacht, um ihre Wachstumsdynamik zu untersuchen. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, nahm die Größe der Organoide während der anfänglichen Wachstumsphase während der dargestellten 7 Tage erheblich zu. Nach der Beobachtung der MPDO-Wachstumsdynamik wandte sich die Aufmerksamkeit der Bewertung der Immunzellzusammensetzung zu, um die originalgetreue Rekapitulation der Organoide zu verifizieren. Diese Bewertung, die sich hauptsächlich auf die...

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Diskussion

Das Aufkommen von PDOs hat mehrere Einschränkungen behoben, die durch andere zuvor etablierte Krebsforschungsmethoden aufgeworfen wurden, und gleichzeitig transformative potenzielle Anwendungen in diesem Bereich eingeführt. Diese Organoid-Technologie wurde ursprünglich im Jahr 2009 von Hans Clevers und Kollegen vorgeschlagen, die erfolgreich ein Darm-Organoid-Kultursystem etablieren konnten, indem sie Lgr5+ -Stammzellen aus dem Darm von Mäusen in einem 3D-Matrixgel kultivierte...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem R01(CA258113), SPORE (CA261608) und P01 (CA114046) finanziert. Abbildung 1 wurde im BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mL Kryo-Fläschchen aus Polypropylen mit roter Kappe und InnengewindeCorning431420
50 mL konisches Polypropylen-RöhrchenCorning352070
100 mm TC-behandelte ZellkulturschaleCorning353003
105 mm Polystyrol-Pinzette SterileCaplugs Evergreen 222-1121-B1I
150 cm2 ZellkulturflascheCorningCLS430825
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduziertes Serummedium (1:1)Gibco12634-010
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
Brilliant Violet 510 Anti-Human-Perforin-AntikörperBioLegend308120
Brilliant Violet 605 Anti-Human-Antikörper Ki-67BioLegend350522
Brilliant Violet 650 Anti-Human-CD366 (Tim-3) AntikörperBioLegend345028
Brilliant Violet 711 Anti-Human-CD45-AntikörperBioLegend304050
Zellkultur-Einsätze 0,4 & Mikro; m, 30 mm DurchmesserMillipore SigmaPIHP03050
ZellfärbepufferBioLegend420201
Cell Strainer 40 µ m NylonCorning 352340
Zellsieb 70 & Mikro; m NylonCorning 352350
Kollagenase, Typ IV, PulverGibco17104019
Cultrex Rattenkollagen ITrevigen3440-100-01
Kulturplatte, PS, 48 Vertiefungen, TC behandelt mit Deckel, sterilMax Scientific07-6048
Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DMEM - hoher Glukosegehalt 4,5 mg/mLCorningMT10-0130CV
Dnase I - Grade IIMillipore Sigma10104159001
1% Corning21-031-CV
Fötales Rinderserum, FBSCorningMT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptose-Nachweiskit IBD Biosciences 
ForskolinTocris1099
Geneticin Selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)ThermoFisher10131035
GlutaMAX NahrungsergänzungsmittelThermoFisher35050061
Schinken F12 NährstoffmischungThermoFisher11765054
HEPES (1 M)Gibco15630-080
Hygromycin B (50 mg/ml)ThermoFisher10687010
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081
L-WRN ZelleATCCCRL-3276
Matrigel Phenolfrei & Tatsache des Wachstums. ReduzierterCorning356231
Millex PVDF-Spritzenvorsatzfilter, 0,22 μ MMillipore SigmaSLGVR33RB
N-AcetylcysteinSigma-AldrichA9165-5G
NicotinamidSigma-AldrichN0636-100G
Nunc TripleFlask Behandelte ZellkulturflascheThermoFisher132867
PE/Cyanin5 Anti-Human-CD8a-AntikörperBioLegend301010
PE-Cy 7 Maus Anti-Human CD279 (PD-1)BD Biowissenschaften 
Pen StrepGibco15140-122
Rekombinant Human EGFPeprotechAF-100-15-1MG
Rekombinant Human FGF-sauerPeprotech100-17A Natriumbicarbonat
Lösung (NaHCO3) (7,5%)Qualität Biologisch 118-085-721
Chirurgische Klingen aus Edelstahl Nr. 22Integra4-322
TrypLE ExpressGibco12604-021
DPBS, 556547561272

Referenzen

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