Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von Organoiden von Melanompatienten vor, indem disassoziierte Zellsuspensionen aus frischem Melanomgewebe kultiviert werden. Diese Organoide rekapitulieren patientenspezifische Tumore in vitro originalgetreu und bieten einen innovativen Ansatz zur Erforschung immunsuppressiver Mechanismen von Tumoren, des Wirkstoffscreenings, der Arzneimittelresistenzmechanismen und der Krebsüberwachungsansätze.

Zusammenfassung

Mit der Entwicklung der Immuntherapie besteht ein anhaltender Bedarf, Modelle zu entwickeln, die die Tumormikroumgebung von nativen Tumoren rekapitulieren können. Traditionelle zwei- und dreidimensionale Modelle können zwar Einblicke in die Entstehung und den Verlauf von Krebs bieten, aber es fehlen entscheidende Aspekte, die eine originalgetreue Nachahmung nativer Tumoren behindern. Ein alternatives Modell, das viel Aufmerksamkeit erregt hat, ist das von Patienten abgeleitete Organoid. Die Entwicklung dieser Organoide rekapituliert die komplexe interzelluläre Kommunikation, die Tumormikroumgebung und die Histoarchitektur von Tumoren. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Etablierung von Melanom-Patienten-abgeleiteten Organoid-Modellen (MPDO) beschrieben. Um diese Modelle zu validieren, untersuchten wir die Zusammensetzung der Immunzellen, einschließlich der Expressionsniveaus von T-Zell-Aktivierungsmarkern, um die zelluläre Heterogenität der Organoide zu bestätigen. Um den potenziellen Nutzen von MPDOs in zellulären Therapien zu beschreiben, untersuchten wir außerdem die zytotoxischen Fähigkeiten der Behandlung der Organoide mit γδ T-Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MPDO-Modelle vielversprechende Wege bieten, um die Komplexität von Tumoren zu verstehen, therapeutische Strategien zu validieren und möglicherweise die personalisierte Behandlung voranzutreiben.

Einleitung

Konventionelle 2-D-Zellkulturmodelle sind in der Krebsforschung ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung des Krebsverlaufs und der Krebstherapie¹. Diese Modelle ermöglichen nicht nur kontrollierte experimentelle Bedingungen, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Krebsentstehung und -progression zugrunde liegen, sondern liefern auch kostengünstige und relativ schnelle experimentelle Ergebnisse. Ihre Verwendung ist jedoch aufgrund der begrenzten zellulären Diversität in der Tumormikroumgebung (TME) eingeschränkt, die in einer koplanaren Natur von Monokulturmodellen nicht rekapitu....

Protokoll

Humanes Melanomgewebe wurde von Patienten gewonnen, die an der University of Pennsylvania unter Verwendung des Gewebeentnahmeprotokolls (UPCC08607) behandelt wurden, das vom Institutional Review Board der University of Pennsylvania genehmigt wurde. Alle Patienten haben eine Einverständniserklärung unterschrieben. Nach der Resektion des humanen Melanomgewebes wird das Tumorgewebe in das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco gelegt und bis zur Verarbeitung (innerhalb von 6 h) bei 4 °C gehalten. Melanom-Patienten-derived Organoide (MPDOs) wurden aus einem frischen Tumor gewonnen, wie in Abbildung 1 d....

Ergebnisse

Die Form und Größe der MPDOs wurden im Laufe der Zeit überwacht, um ihre Wachstumsdynamik zu untersuchen. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, nahm die Größe der Organoide während der anfänglichen Wachstumsphase während der dargestellten 7 Tage erheblich zu. Nach der Beobachtung der MPDO-Wachstumsdynamik wandte sich die Aufmerksamkeit der Bewertung der Immunzellzusammensetzung zu, um die originalgetreue Rekapitulation der Organoide zu verifizieren. Diese Bewertung, die sich hauptsächlich auf die.......

Diskussion

Das Aufkommen von PDOs hat mehrere Einschränkungen behoben, die durch andere zuvor etablierte Krebsforschungsmethoden aufgeworfen wurden, und gleichzeitig transformative potenzielle Anwendungen in diesem Bereich eingeführt. Diese Organoid-Technologie wurde ursprünglich im Jahr 2009 von Hans Clevers und Kollegen vorgeschlagen, die erfolgreich ein Darm-Organoid-Kultursystem etablieren konnten, indem sie Lgr5⁺ -Stammzellen aus dem Darm von Mäusen in einem 3D-Matrixgel kultivierte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 mL Kryo-Fläschchen aus Polypropylen mit roter Kappe und Innengewinde	Corning	431420
50 mL konisches Polypropylen-Röhrchen	Corning	352070
100 mm TC-behandelte Zellkulturschale	Corning	353003
105 mm Polystyrol-Pinzette Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Zellkulturflasche	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduziertes Serummedium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 Anti-Human-Perforin-Antikörper	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 Anti-Human-Antikörper Ki-67	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 Anti-Human-CD366 (Tim-3) Antikörper	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 Anti-Human-CD45-Antikörper	BioLegend	304050
Zellkultur-Einsätze 0,4 & Mikro; m, 30 mm Durchmesser	Millipore Sigma	PIHP03050
Zellfärbepuffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µ m Nylon	Corning	352340
Zellsieb 70 & Mikro; m Nylon	Corning	352350
Kollagenase, Typ IV, Pulver	Gibco	17104019
Cultrex Rattenkollagen I	Trevigen	3440-100-01
Kulturplatte, PS, 48 Vertiefungen, TC behandelt mit Deckel, steril	Max Scientific	07-6048
Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - hoher Glukosegehalt 4,5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
1%	Corning	21-031-CV
Fötales Rinderserum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptose-Nachweiskit I	BD Biosciences
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Nahrungsergänzungsmittel	ThermoFisher	35050061
Schinken F12 Nährstoffmischung	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/ml)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamin 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN Zelle	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenolfrei & Tatsache des Wachstums. Reduzierter	Corning	356231
Millex PVDF-Spritzenvorsatzfilter, 0,22 μ M	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcystein	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Behandelte Zellkulturflasche	ThermoFisher	132867
PE/Cyanin5 Anti-Human-CD8a-Antikörper	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Maus Anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biowissenschaften
Pen Strep	Gibco	15140-122
Rekombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Rekombinant Human FGF-sauer	Peprotech	100-17A Natriumbicarbonat
Lösung (NaHCO3) (7,5%)	Qualität Biologisch	118-085-721
Chirurgische Klingen aus Edelstahl Nr. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021

DPBS, 556547561272