Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Die Mikrobiota (d. h. Archaeen, Bakterien, Eukarya und Viren) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und tragen zur Entwicklung verschiedener Krankheiten bei, indem sie physiologische und pathologische Prozesse durch symbiotische Wechselwirkungen innerhalb der Darmbarriere, der Epitheloberfläche und der Muzinfunktionen bei Individuen beeinflussen ^1,2,3. Die Zusammensetzung der Mikrobiota in verschiedenen Lebensstadien, vom Säuglingsalter bis zur Jugend, dem Erwachsenenalter und dem Altern, sowie ihre Präsenz an verschiedenen Orten wie Nasenlöchern, Mund-, Haut- und Darmstellen wird dynamisch durch verschiedene Lebensräume und Umgebungen geprägt⁴. Die Darmmikrobiota in Organismen ist an der Nährstoffaufnahme, der Immunantwort, der Invasion von Krankheitserregern, der Stoffwechselregulation usw. beteiligt ^5,6. Studien an Patienten haben gezeigt, dass Störungen der Darmmikrobiota mit Fettleibigkeit beim Menschen, Schlafstörungen, Depressionen, entzündlichen Darmerkrankungen (CED), neurodegenerativen Erkrankungen (Parkinson, Alzheimer), Alterung und verschiedenen Krebsarten zusammenhängen ^7,8,9. Darüber hinaus umfassen interaktive Wege zwischen der Darmmikrobiota und den Wirten Entzündungsfaktoren, Neurotransmitter, Metaboliten, Darmbarriere und oxidativen Stress, wie in früheren Forschungen mit Mäuse- und Fischmodellen beobachtet^{wurde 10,11}.

In jüngster Zeit wurden mehrere bakterienbezogene Ansätze oder Therapien, einschließlich potenzieller Probiotika und fäkaler Mikrobiota-Transplantation (FMT), für diese Erkrankungen in klinischen und Tiermodellen untersucht. Diese Untersuchungen basieren auf Entdeckungen im Zusammenhang mit der Mikrobiota-Darm-Gehirn-/Leber-/Nierenachse, von der Mikrobiota abgeleiteten Produkten und einer veränderten Rezeptoraktivität^12,13. Die Entwicklung, die verschiedenen Funktionen und Mechanismen des Mikrobiota-Wirt-Systems sind jedoch aufgrund der Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und der Herausforderung, leistungsfähige menschenähnliche Krankheitsmodelle zu generieren, noch unvollständig verstanden und identifiziert.

Um diese Probleme anzugehen, wurden Mitte des 19^. Jahrhunderts dringend keimfreie (GF) Tiermodelle vorgeschlagen, die vor allem im 20^. Jahrhundert entwickelt wurden. Spätere Verfeinerungen, einschließlich antibiotikabehandelter und gnotobiotischer Modelle, sowie Fortschritte in der mikrobiellen Nachweis- und Beobachtungstechnologie perfektionierten diese Modelle weiter 14,15,16. GF-Tiere, die durch die Auslöschung ihres eigenen Hintergrunds und die Vermeidung von Umweltmikroben entstanden sind, bieten eine hervorragende Strategie, um die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und ihren Wirten zu erforschen¹⁷. Durch die Anwendung von Tiermodellen und verfeinerten Protokollen ist es den Forschern gelungen, ähnliche mikrobielle Zusammensetzungen zu replizieren, die bei Patienten in GF-Mäusen und -Fischen gefunden wurden. Darüber hinaus bieten andere Tiermodelle von GF, wie z. B. Hunde, Hühner und Schweine, vielfältige Optionen als Forschungsobjekte^an 18,19,20,21. Dieser Ansatz hat es ermöglicht, die potenziellen therapeutischen Wirkungen kommensaler Mikrobiome auf verschiedene Krankheiten, einschließlich der Krebsimmuntherapie beim Menschen, zu untersuchen^16,18. GF-Modelle bieten genauere Einblicke in die Eigenschaften und Mechanismen der spezifischen bakteriellen Besiedlung, Migration, Vermehrung und Interaktion innerhalb von Wirten. Dies liefert entscheidende neue Einblicke in das Auftreten und die Entwicklung von Mikrobiota-bedingten Krankheiten^22,23. Die Geschichte der Etablierung und Anwendung von GF-Zebrafischen in der mikrobiellen Forschung hat sich von den Berichten von Rawls et al. im Jahr 2004 und Bates et al. im Jahr 2006 bis zum Protokoll von Melancon et al. im Jahr 2017^entwickelt 16,24,25. Die Machbarkeit von adulten oder gezüchteten GF-Modellen ist jedoch immer noch ein langwieriger Prozess, der mit unterschiedlicher Langlebigkeit, Erfolgsraten und gesundheitlichen Herausforderungen einhergeht.

Unter den verschiedenen Tiermodellen sticht der Zebrafisch (Danio rerio) aufgrund seiner vorteilhaften Ähnlichkeit mit menschlichen Organen und Genomik, seines kurzen Entwicklungszyklus, seiner hohen Fruchtbarkeit und seiner transparenten Embryonen als wichtiges Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die biomedizinische Forschung hervor^19,26. Zebrafische, die als zuverlässige Krankheitsmodelle für den Menschen dienen, bieten eine visuelle Darstellung physiologischer und pathologischer Prozesse in vivo und geben Einblicke in die attraktiven Eigenschaften von Wirt-Mikroben-Interaktionen. Bemerkenswert ist, dass Zebrafische unterschiedliche Zelllinien aufweisen, die eine Abbildung der Darmphysiologie, der mikrobiellen Dynamik, der Gonaden und der Fortpflanzungsentwicklung, der Reifung des Immunsystems des Wirts, des Verhaltens und des Stoffwechsels ermöglichen²⁷. Zebrafischembryonen entwickeln sich bis zum Schlüpfen in schützenden Chorionen und werden 3 Tage nach der Befruchtung zu Larven (dpf). Sie jagen aktiv bei 5 dpf nach Nahrung und erreichen die Geschlechtsreife etwa 3 Monate nach der Befruchtung (mpf)²⁸. Der erste erfolgreiche keimfreie (GF) Zebrafisch, der von Rawls et ^al.24 berichtet wurde, zeigte, dass Larven, die nach der Dotterresorption mit autoklaviertem Futter gefüttert wurden, eine Gewebenekrose ab 8 dpf und einen vollständigen Tod bei 20 dpf aufwiesen. Dies deutete auf die Auswirkungen der Ernährung oder die Bedeutung der Berücksichtigung der exogenen Nährstoffversorgung in Experimenten mit Langzeit-GF-Fischen (>7 dpf) hin²⁹. Nachfolgende Studien verbesserten das Generationsprotokoll von GF-Fischen, indem steriles Futter und Methoden verwendet wurden, die in verschiedenen Fischmodellen perfektioniert wurden¹⁶.

Die meisten Forschungen an GF-Zebrafischmodellen konzentrierten sich jedoch auf frühe Lebensstadien, die eine bakterielle Infektion bei 5 dpf für 24 h bis 48 h beinhalteten, wobei Proben vor 7 dpf am Ende der Experimente entnommen wurden 25,30,31. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mikrobiota in Organismen, einschließlich Menschen und Zebrafischen, zu Beginn des Lebens besiedelt und während des Wachstums und der Entwicklung geformt wird. Die Zusammensetzung bleibt im Erwachsenenstadium stabil, wobei die Rolle der Mikrobiota im Wirt während des gesamten Lebens von entscheidender Bedeutung ist, insbesondere bei Aspekten des Alterns, der neurodegenerativen, stoffwechselbedingten Fettleibigkeit und der Darmerkrankung³. So können Perspektiven von GF-Tieren mit längerem Überleben Einblicke in die Mechanismen mikrobieller Rollen bei der Entwicklung und Funktion von Wirtsorganen geben, unter Berücksichtigung des unreifen Immun- und Fortpflanzungssystems von Fischlarven im frühen Leben. Während in früheren Studien Bakterienstämme im Zebrafischdarm isoliert und identifiziert werden konnten, die das Potenzial für die Infektion von GF-Tiermodellen bieten, um Probiotika auszuwählen oder bakterielle Funktionen im Wirt zu erforschen^19,25 war die Generierung und Anwendung von GF-Fischmodellen in erster Linie auf frühe Lebensstadien beschränkt. Diese Einschränkung, die auf den komplexen Produktionsprozess, die hohen Wartungskosten und die damit verbundenen Probleme mit der Nahrung und der Immunität zurückzuführen ist, behindert Forschungsbemühungen, die darauf abzielen, die entwicklungsbedingten und chronischen Auswirkungen der Mikrobiota auf den Wirt zu untersuchen.

Die Überlebensrate, das Verhalten, das Wachstum, die Reifung und die allgemeine Gesundheit von Fischen, insbesondere in keimfreien (GF) Modellen, werden signifikant von den Fütterungspraktiken beeinflusst, die die Nahrungsaufnahme und -absorption während der Zeit des offenen Mundes von den frühen Larven bis zu den Jungtieren umfassen^32,33. Eine der Herausforderungen in der Fischzucht von GF ist jedoch der Mangel an geeignetem sterilem Futter, der die Wirksamkeit der Ernährungsunterstützung zur Aufrechterhaltung des Wachstums und Überlebens der Larven einschränkt. Die Lösung dieses Problems ist entscheidend für die Wiederherstellung des Lebens von GF-Fischen, wenn man ihre entwicklungsfördernden Abwehrmechanismen und ihre schwachen Verdauungsfähigkeiten aufgrund des Fehlens eines Darmmikrobioms berücksichtigt. Was die Ernährung betrifft, so erweist sich die lebende Salinengarnele (Artemia sp.) als die am besten geeignete Nahrung für Larven mit offenem Mund bis hin zu Jungfischen. Es wurde beobachtet, dass Fische, die mit lebenden Salinengarnelen gefüttert werden, höhere Wachstums- und Überlebensraten aufweisen als Fische, die mit gekochtem Eigelb oder anderen natürlichen und synthetischen Ködern gefüttert werden³⁴. Während frühe Lebensmodelle von GF-Fischen mit Dotterunterstützung überleben können und GF-Larvenmodelle durch sterile Fütterung erhalten werden können, bleibt die Generierung von Langzeitmodellen von Larven zu Jungtieren und das Erreichen der Geschlechtsreife eine Herausforderung. Darüber hinaus wird Flocken- oder Pulverfutter durch eine ungleiche Nährstoffzusammensetzung eingeschränkt und kann die Wasserqualität beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu hat lebende Artemia Vorteile wie das Überleben sowohl in Salz- als auch in Süßwasser, die geringe Größe, die für Larven bis hin zu erwachsenen Larven geeignet ist, die einfache Zusammenstellung und eine höhere Schlupfqualität³⁵. Aufbauend auf den vorangegangenen Methoden ^16,24,30 haben wir den komplexen Behandlungsprozess vereinfacht und die Herausforderung der Ernährung angegangen, indem wir leicht inkubierbares GF-Lebend-Artemia sp. als steriles Futter für eine längere Dauer als GF-Fische im frühen Leben etabliert haben.

Diese Studie stellt ein optimiertes Protokoll vor, das (1) die Generation, (2) die Erhaltung, (3) die Identifizierung der Sterilrate und (4) die Erhaltung und Fütterung abdeckt, um das Wachstum von keimfreien (GF) Zebrafischen von den Embryonen bis zu den Larven und Jungtieren sicherzustellen. Die Ergebnisse liefern erste Hinweise auf das Schlüpfen, das Überleben, das Wachstum und die Sterilität von GF Zebrafischen sowie essentielle Indizes für GF Artemia sp. als steriles Futter. Die detaillierten Schritte zur Modellgenerierung und -aufbereitung von sterilem Lebendfutter bieten eine entscheidende technische Unterstützung für die Konstruktion und Anwendung von Langzeitmodellen von GF Fischen sowie von GF Artemia sp. in der Erforschung der Mikrobiota-Wirt-Interaktion. Das Protokoll befasst sich mit der Isolierung, Identifizierung und Infektion von Bakterien an GF-Fischmodellen, skizziert Methoden zur bakteriellen Fluoreszenzmarkierung und zur Beobachtung ihrer Besiedlung im Fischdarm unter einem Mikroskop. GF-Fische, gnotobiotische Fische mit bakterieller Infektion oder übertragene humane Mikrobiota-Modelle werden verschiedenen Detektionen unterzogen, um ihre Funktionen und Auswirkungen auf die Immunität, die Verdauung, das Verhalten, die transkriptomische Regulation und metabolische Aspekte des Wirts aufzuklären. Langfristig kann dieses Protokoll auf verschiedene Wildtyp-Fischarten, wie z. B. marine Medaka, und möglicherweise auf andere ausgewählte transgene Zebrafischlinien ausgeweitet werden, die mit bestimmten Geweben oder Krankheiten korrelieren.

Die Fischversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Use Committee von Chongqing und des Institutional Animal Care and Use Committee der Chongqing Medical University, China, sowie den vom State Bureau of Quality and Technical Supervision herausgegebenen Standards für Versuchstiere (Zulassungs-ID: GB14922-2001 bis GBT14927-2001) durchgeführt. Zebrafische (Danio rerio, Wildtyp, AB-Stamm) wurden vom Institut für Hydrobiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften bezogen und nach den zuvor beschriebenen Verfahren im Labor gehalten³⁶.

1. Pflege adulter Zebrafische und Entnahme von Embryonen

HINWEIS: Basierend auf Änderungen aus früheren Studien und Berichten 16,37,38,39 wurden die Pflege von adulten Zebrafischen, die Aufzucht von Larven und die Praxis für keimfreie (GF) Modelle in unserem Labor nach den unten beschriebenen Schritten durchgeführt. Das hochreine Strömungssystem für die Fischzucht wurde kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle). Das Wasser, das mit einem ausgewogenen pH-Wert, Salz und Alkali gehalten wird, wird während des Zyklus gefiltert, um saubere Bedingungen zu gewährleisten.

1. Adulte Fische werden nach dem folgenden Standardverfahren im Auto-Cycle-System (siehe Materialtabelle) mit einer Photoperiode der Dunkelheit gehalten: hell = 10 h: 14 h bei 28 °C ± 0,5 °C und gefüttert mit frisch inkubiertem Artemia sp. zweimal täglich.
2. Setzen Sie den geschlechtsreifen erwachsenen Zebrafisch (Männchen: Weibchen = 2:1) am Vorabend in Becken mit frischem und sauberem Wasser.
3. Lassen Sie die Fische am nächsten Morgen (ca. 8:30 Uhr) unter regelmäßiger Lichtstimulation im Labor laichen. Nach 1-2 h setzen Sie den Fisch in ein anderes Aquarium um.
4. Sammeln Sie die Embryonen in Wasser aus dem Auto-Cycling-System als Aufzuchtmedium in einer Kulturschale mit einer Einweg-Pasteurpipette.

2. Entstehung des GF-Zebrafisches vom Embryo bis zur Larve

HINWEIS: Das Verfahren zur Erzeugung keimfreier (GF) Fische ist in Abbildung 1 dargestellt, während die grundlegenden Entwicklungsindizes konventioneller (CR) und GF-Modelle in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt sind. Bitte befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube mit einer sterilen aseptischen Technik in einem Reinraum.

1. Waschen Sie die Embryonen mit dem Fischkulturwasser und entfernen Sie den Kot, Verunreinigungen und tote oder unbefruchtete Eier.
2. Die Embryonen werden bei 2 hpf auf sterilisierte Platten (bis zu 480 Embryonen pro steriler Schale mit einem Durchmesser von 10 cm) übertragen, die mit antibiotischem keimfreiem Zebrafischmedium (AB-GZM, siehe Materialtabelle) gefüllt sind und bei 28,5 °C für 6-8 h kultiviert werden.
   HINWEIS: AB-GZM wird verwendet, um die Embryonen über mehrere Stunden zu behandeln, um die Oberflächenmikroorganismen zu eliminieren, und GZM ohne Antibiotika wird verwendet, um GF-Fische in Untersequenz zu kultivieren. In der Regel beträgt die perfektionierte Kulturzeit 6 h).
3. Eier mit weißen Flecken oder weißlichem Aussehen werden ausgeschlossen und diejenigen ausgewählt, die normal entwickelt sind und transparente und intakte Hüllen für die weitere Verarbeitung aufweisen.
4. Spülen Sie die Embryonen dreimal innerhalb von 10 Minuten mit AB-GZM.
5. Weichen Sie die Embryonen 1 min lang in 0,2 g/l Povidon-Jod-Lösung (PVP-I) ein (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Eine höhere Konzentration und eine Dauer von mehr als 2 Minuten beeinflussen die Sterbe- und Schlupfrate der Embryonen.
6. Waschen Sie die Embryonen dreimal innerhalb von 10 min mit keimfreiem Zebrafischmedium (GZM).
7. Geben Sie die Embryonen in die Arbeitslösung Natriumhypochlorit (NaClO), bedecken Sie die 50-ml-Mikrozentrifugenröhrchen fest und bleichen Sie sie 15 Minuten lang. Während dieser Zeit suspendieren Sie die Embryonen in Bleichlösung, indem Sie sie vorsichtig schütteln.
8. Waschen Sie die Embryonen dreimal innerhalb von 10 Minuten mit GZM.
9. Übertragen Sie die Embryonen auf sterile 6-Well-Platten mit 5 Embryonen und 10 ml GZM pro Well. Kultivieren Sie sie in einer ultrareinen Plattform oder einem Inkubator mit einer Photoperiode von dunkel: hell = 10 h: 14 h bei 28 °C ± 0,5 °C. Die Kulturdichte beeinflusst die Sterilitätsrate.
10. Erneuern Sie das Kulturmedium täglich, indem Sie das verbrauchte GZM entfernen, es als Proben für die Erkennung des sterilen Status sammeln und jede Vertiefung mit dem gleichen Volumen an sterilem GZM auffüllen.
11. Notieren Sie die grundlegenden Entwicklungsindizes von GF-Embryonen/-Larven, einschließlich der Überlebensrate, der Schlupfrate, des Herzschlags, der Körperlänge und des Körpergewichts usw.¹⁹.
12. Füllen Sie die GF Fische in geeignete Behälter (Schalen, Zellkulturflaschen oder Glasflaschen mit Deckel) mit erweitertem Volumen um, um während des gesamten Wachstumsprozesses steriles Futter zu erhalten.

3. Erhaltung des GF-Zebrafisches von der Larve bis zum Jungtier

1. Erneuern Sie das GZM ohne Fütterung vor 7 dpf und erkennen Sie täglich den sterilen Zustand (siehe Schritt 5).
2. Füttern Sie Zebrafischlarven ab 8 dpf bis zu juvenilen Stadien einmal täglich mit sterilem Eigelb (10 μl zubereitete Stammlösung pro Vertiefung), bevor Sie die GZM wechseln.
3. Füttern Sie GF Jungtiere ab 14 dpf einmal täglich mit sterilisiertem Eigelb, gemischt mit GF Artemia sp. (1-3 Artemia/Larven, siehe Schritt 4), und erhöhen Sie allmählich die Futtermasse mit dem Wachstum und der Entwicklung von GF Fischen.
4. Geben Sie Eigelb, bis alle Fische Artemia-Nauplien verzehren können.
   HINWEIS: GF Artemia sollte vor der Anwendung einer Sterilitätsprüfung unterzogen werden. Beurteilen Sie die Anzahl der verbleibenden Artemia-Nauplien , beobachten Sie den Fortschritt bei der Verfolgung und beim Fangen und untersuchen Sie den Fischkörper mit verzehrtem Futter, um den Fütterungserfolg anzuzeigen.
5. Von 28 dpf bis zu den frühen adulten Stadien ist GF Artemia einmal täglich (3-5 Artemia/Larven) zu füttern und ungenutzte oder tote Artemia und tote Fische als tägliche Proben in das GZM des Abfalls zu geben.
6. Während des Wachstums von GF-Fischen sind die 6-Well-Platten nach 7 dpf auf sterile Platten oder Zellkulturflaschen von 8 auf 21 dpf und dann auf sterile Flaschen nach 21 dpf umzustellen. Erhöhen Sie das Kulturmedium und die Futtermasse entsprechend der Anzahl und dem Gewicht der GF Fische in jedem Behälter.
7. Erneuern Sie das GZM täglich und kontrollieren Sie die Proben, um den Erfolg der GF Modelle sicherzustellen.
   HINWEIS: Die Aufrechterhaltung keimfreier (GF) Fischmodelle bis zum frühen Erwachsenenalter und zur Geschlechtsreife ist eine Herausforderung, da die durchschnittliche Überlebensrate bei 30 dpf in der Regel unter 10 % liegt. Dies wird in erster Linie auf eine schwache Immunität, eine verzögerte Entwicklung und eine beeinträchtigte Darmfunktion zurückgeführt.

4. Zubereitung von GF Artemia-Nauplien als steriles Futter für chronische GF-Fischmodelle

HINWEIS: Die Kultivierungs- und Zubereitungsmethode von keimfreier (GF) Artemia ist in Abbildung 2 dargestellt. Beachten Sie, dass alle folgenden Schritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit einer sterilen aseptischen Technik durchgeführt werden.

1. 0,25 g Artemia-Zysten 5 Minuten lang mit 2,4 g/l Natriumhypochlorit (NaClO, siehe Materialtabelle) spülen.
2. Filtrieren Sie die gespülten Artemia-Zysten mit einem sterilisierten ultradichten Filter (ca. 170 Maschen in der Öffnung) und waschen Sie sie dreimal mit sterilisiertem Reinstwasser, jeweils 1-2 Minuten lang.
3. Übertragen Sie die gewaschenen Artemia-Zysten in 100 ml 2,5 % sterilisiertes Kochsalzwasser, mischen Sie sie und verpacken Sie sie für das aseptische Schlüpfen gemäß den unten genannten Schritten.
4. Die mit 50 mL behandelte Artemia-Zysten-Mischungslösung in eine sterile Flasche mit einem Volumen von 100 mL füllen, mit Folie verschließen und in einem Schüttelinkubator bei 150 U/min, 30 °C für 18 h bis 24 h mit Licht inkubieren.
5. Extrahieren Sie ca. 30 ml geschlüpfte Artemia-Nauplien aus der mittleren und unteren Schicht mit einer Einweg-Pasteurpipette.
   HINWEIS: Verhindern Sie, dass schwimmende Eier und leere Schalen die obere Schicht erreichen. Die Indizes von keimfreien (GF) Artemia-Zysten und Nauplien , die 24 h lang inkubiert wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt.
6. Filtrieren Sie die Artemia mit einem Sterilisationsfilter und waschen Sie sie in einem Sterilisationsbecher mit sterilisierendem Reinstwasser dreimal, jeweils ca. 30 s bis 1 min. Fügen Sie abschließend 4 ml sterilisiertes Reinstwasser hinzu, um die Artemia-Mischlösung herzustellen.
7. Mit einer Einweg-Pasteurpipette wird aktiv schwimmende Artemia aus der oberen Schicht entnommen, gewaschen und die Nauplienlösung für die Fütterung und aseptische Identifizierung vorbereitet.

5. Identifizierung von GF-Fischmodellen in den gesamten Lebensphasen

HINWEIS: Während der gesamten Lebensphase von keimfreien (GF) Fischen sind Schlüsselindizes und tägliche Probennachweise entscheidend, um den Erfolg der Modelle sicherzustellen. In diesem Schritt werden die übliche Klassifizierung von Proben und die üblichen Methoden zur Identifizierung zusammengefasst (Abbildung 4).

1. Beobachten und zählen Sie täglich den Überlebensstatus und die Überlebensrate der GF-Zebrafischlarven. In Experimenten, in denen verwandte Raten berechnet werden, werden GF-Fische in 24- oder 48-Well-Platten mit einem Fisch pro Well kultiviert.
   1. Überlebensrate = (Anzahl der lebenden Fische zum Zeitpunkt der Beobachtung / Gesamtzahl der Eier) × 100 %.
   2. Sterilitätsrate = (Anzahl der sterilen Fische/Anzahl der überlebenden Fische) × 100%.
      HINWEIS: Dieses Protokoll konzentriert sich auf den Sterilanteil lebender Fische. Die Anzahl der sterilen Fische wird bestimmt, indem die erfolgreichen GF-Fische nach mehreren Kontrollen unter den lebenden Fischen gezählt werden. Alle toten Fische oder lebenden Fische GF Modelle, die aufgrund des Vorhandenseins von Bakterien versagt haben, werden bei nachfolgenden GF Verfahren eliminiert.
2. Entnehmen Sie die folgenden Proben von GF Zebrafischlarven.
   1. Nährmedium von GF Zebrafisch aus jeder Vertiefung oder jedem Flaschenbehälter.
   2. Fischfutter, wie steriles Eigelb und GF Artemia.
   3. Abfallmedium, einschließlich Fragmente der Eimembran nach dem Schlüpfen und Futterreste oder Kot während der Fütterungszeiten von Larven bis hin zu Jungfischen.
   4. Proben von toten Fischen, um das Vorhandensein von Bakterien zu identifizieren.
   5. Fischmedium und Mittel, die bei der Embryonenbehandlung als sterile Kontrolle verwendet werden.
   6. Proben von Materialien, Operationsplattform und Inkubator, etc.
3. Erkennen Sie Proben, die täglich mit mehreren Methoden entnommen werden.
   1. Verwenden Sie zunächst die Spreizplattenmethode und kultivieren Sie Platten in einem Inkubator bei 30 °C.
      1. Die Trypticase-Soja-Agar (TSA)-Platte (siehe Materialtabelle) unter aeroben Bedingungen mit einer Probe von 20-50 μl Abfallmedium beschichten.
      2. Die TSA-Platte unter anaeroben Bedingungen mit 20-50 μl Abfallmediumprobe beschichten.
      3. Die TSA-Blutplatten (siehe Materialtabelle) unter aeroben Bedingungen mit 20-50 μl Abfallmediumprobe beschichten.
      4. Die TSA-Blutplatten unter anaeroben Bedingungen mit 20-50 μl Abfallmediumprobe bestreichen.
   2. Zweitens, verwenden Sie die Flüssigkulturmethode.
      1. 200 μl Probe in Aerobic-Röhrchen mit Hirn-Herz-Infusionsbouillon (BHI) Medium (siehe Materialtabelle) geben und im Schüttelinkubator bei 30 °C und 150-180 U/min kultivieren.
      2. 200 μl Probe in anaerobe Röhrchen mit BHI-Medium geben und im Inkubator bei 30 °C kultivieren.
      3. Geben Sie 200 μl Probe in Aerobicröhrchen mit Trypticase-Sojabrühe (TSB)-Medium und kultivieren Sie sie dann im Schüttelinkubator bei 30 °C und 150-180 U/min.
      4. 200 μl Probe in anaerobe Röhrchen mit TSB-Medium geben und im Inkubator bei 30 °C kultivieren.
   3. Drittens, verwenden Sie molekulare Techniken-16s Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assay.
      1. Die Abwasserprobe wird mit zwei Primerpaaren 27F und 1492R sowie 63F und 1387R analysiert (Tabelle 1).
         HINWEIS: Der PCR-Mastermix wurde gemäß Tabelle 2 unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA-Polymerase-Kits (siehe Materialtabelle) hergestellt, und die PCR-Maschine wurde mit dem in Tabelle 3 angegebenen Programm eingerichtet.
      2. Nach Abschluss des PCR-Programms sind die Produkte mittels 1%iger Agarose-Gelelektrophorese⁴⁰ an Zielbanden von 1465 bp (unter Verwendung der Primer 27F und 1492R) oder 1324 bp (unter Verwendung der Primer 63F und 1387R) zu untersuchen, um auf die Sterilität der Proben zu schließen.
4. Aufzeichnung und Beobachtung von Sterilitätstests, einschließlich Platten- und Medienkultur von 24 h bis 3 Tagen und 7 Tagen, bei denen keine Kolonie auf den Platten und keine Trübungen in der Flüssigkeit auf den erfolgreichen Bau von GF Modellen hinweisen. Beobachten und dokumentieren Sie die Platte und das Medium bei 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h und 168 h.

6. Identifizierung von GF Artemia-Proben vor der Fütterung von GF-Fischen

HINWEIS: Um die GF Artemia-Proben nachzuweisen, die als Lebendfutter vor der Fütterung von GF Fischen unverzichtbar sind (Abbildung 4), gehen Sie wie folgt vor.

1. Sammeln Sie Proben von GF Artemia Modellen.
   1. Unbehandelte Artemia-Zysten .
   2. Behandelte GF Artemia-Zysten .
   3. Geschlüpfte GF Artemia-Nauplien.
   4. Sterilisiertes Reinstwasser als Kontrolle.
2. Erkennen Sie GF Artemia mit den folgenden Methoden.
   1. Verwenden Sie die Spreizplattenmethode, um die Proben zu detektieren, indem Sie sie unter aeroben und anaeroben Bedingungen auf TSA-Platten und TSA-Blutplatten aufschichten. Inkubieren Sie sie bei 30 °C.
   2. Verwenden Sie ein flüssiges Medium, um die Proben in aeroben und anaeroben TSB- und BHI-Röhrchen zu detektieren. Kultur im Shaker bei 150-180 U/min, 30 °C.
   3. Verwenden Sie einen PCR-Assay, um das Vorhandensein von Bakterien in den Proben nachzuweisen, die unter Verwendung der 16s-ribosomalen RNA-Zielgene-Primer 27F und 1492R, 63F und 1387R entnommen wurden (Tabelle 1). Die Lautstärke und das Programm sind in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführt.
3. Notieren Sie die Ergebnisse: Weisen Sie das PCR-Produkt mit 1 % Agarose-Gelelektrophorese⁴⁰ für Zielbanden mit 1465 bp (unter Verwendung der Primer 27F und 1492R) oder 1324 bp (unter Verwendung der Primer 63F und 1387R) nach. Die Ergebnisse der Platten und des flüssigen Mediums können den sterilen Status von GF Artemia sicherstellen, bevor es als GF Fischfutter verwendet wird.

7. Isolierung und Identifizierung von Darmbakterienstämmen aus dem Zebrafisch

HINWEIS: Um die Darmfunktionen in vitro und in vivo zu untersuchen, ist es notwendig, Bakterienstämme aus Zebrafischen zu isolieren, die auch die Speziesquelle für potenzielle Probiotika darstellen, die durch Infektion mit GF-Tieren untersucht werden (Abbildung 5). In diesem Protokoll beschreiben wir die traditionelle Seziermethode zur Gewinnung von Darminhalt, während die Proben auch direkt von lebenden anästhesierten Fischen entnommen werden können (Daten nicht gezeigt).

1. Wählen Sie gesunde erwachsene Zebrafische und waschen Sie sie mit sterilem Wasser. Führen Sie die folgenden Schritte in der Reinbank durch.
2. Betäuben Sie den Fisch mit 100 mg/L MS-222 für 5-10 min.
3. Verwenden Sie 75% Alkohol, um die Körperoberfläche des Fisches zu behandeln.
4. Präparieren Sie die Fischdärme und extrudieren Sie den Darminhalt mit TSB- oder BHI-Medium.
5. Inkubieren Sie den Darmüberstand durch Auftragen von TSA, Blutplatte, TSB und BHI-Medium unter aeroben und anaeroben Bedingungen.
6. Übersetzen Sie die Bakterien, um den Signalstamm zu gewinnen und die Eigenschaften verschiedener Kolonien aufzuzeichnen.
7. Lagern Sie die Bakterien innerhalb von 30% Glycerin bei -80 °C.
8. Identifizieren Sie dann die Darmbakterien durch genomische DNA-Extraktion und PCR-Sequenzierung.
   HINWEIS: Zu den Hauptschritten der bakteriellen genomischen DNA-Extraktion gehören die Flüssigzentrifugation, die Dissoziation von RNase A und Protease K, die Extraktion von Ethylalkohol, das Spülen und die Auflösung mit im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
9. Analysieren Sie die 16S-Sequenzen mit dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) und dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) mit der Bacteria and Archaea Datenbank^40,41 (siehe Materialtabelle).
10. Wählen Sie die am besten passenden Bakterien und Merkmale aus, um die isolierten Darmstämme auf Gattungsebene zu identifizieren.
11. Ermitteln Sie die metabolischen Funktionen von Bakterienstämmen mit kommerziell erhältlichen Kits (siehe Materialtabelle).

8. Grippemarkierung, Infektion und Besiedlung von Bakterien im Darm von GF-Zebrafischen

HINWEIS: Vor der Infektion des GF-Zebrafisches wurden die isolierten Bakterien mit Farbstoffen modifiziert und gezählt, wodurch die mikrobielle Besiedlung und Migration kontinuierlich und in vivo sichtbar wurde (Abbildung 6).

1. Wählen Sie potenziell nützliche Bakterien oder dominante Stämme mit hoher Abundanz im Wirt aus, um die GF-Fischmodelle zu infizieren.
   HINWEIS: Bei den in dieser Studie verwendeten Bakterien handelte es sich um Aeromonas sp. und Vibrio sp. (siehe Materialtabelle), die aus den 8 Gattungen ausgewählt wurden, die aus adulten Wildtyp-Zebrafischen isoliert und im Labor identifiziert wurden⁴².
2. Markieren Sie die frischen Bakterien mit CM-Dil-Farbstoffen (siehe Materialtabelle) und setzen Sie sie GF Zebrafischen bei 5 dpf mit einer Konzentration von 10^{6-10 8} koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml aus.
3. Beobachten Sie die Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop mit 3× Vergrößerung, um die Besiedlung und Verteilung von Bakterien im Darm von GF-Zebrafischlarven ab 6 dpf und 14 dpf anzuzeigen.
4. Zählen Sie die Anzahl der Bakterien in GF-Fischen manuell per Plattenkultur zu jedem Zeitpunkt.
5. Erkennen Sie die Kolonien und Sequenzen, um sicherzustellen, dass die Infektion mit den Zielbakterienstämmen erfolgreich war.
6. Sammeln Sie Proben von GF-Fischen mit bakterieller Infektion für nachfolgende Assays, einschließlich Neuroverhalten, Entwicklungsindizes, histopathologische Analysen und Hormonmessungen usw. 43,44,45.
   HINWEIS: Die im Infektionsexperiment verwendeten Bakterien sollten neu gewonnen und durch das flüssige Medium frisch kultiviert werden.

Die GF-Zebrafischmodelle können effizient hergestellt werden, indem die reichlich vorhandenen Eier von Zebrafischpaaren verwendet werden, wobei das Protokoll auf der Grundlage früherer GF-Fischmodelle optimiert wurde35. Eine einzige 6-Well-Platte kann etwa 30-48 Embryonen/Larven kultivieren, was eine umfangreiche Datenerfassung und statistische Analyse ermöglicht. Nach der sterilen Behandlung werden die GF-Embryonen in einem sauberen Inkubator kultiviert, bis sie nach 48-72 Stunden zu den Larven schlüpfen, und die GZM wird täglich mit dem Nachweis der entnommenen Proben gewechselt, was für die Aufrechterhaltung des keimfreien Zustands entscheidend ist (Abbildung 1). Nach 7 dpf sollte die Nahrung aus Eigelb und lebender Artemia für die Larven bis zum Jugendstadium zubereitet werden. Während des Wachstums und der Entwicklung von Fischen sollten das Volumen, der Behälter und die Dichte von GZM rechtzeitig reguliert oder geändert werden, um Tod und Versagen des sterilen Status zu vermeiden. Wenn der Nachweis keine bakterielle Belastung zeigt, können die erfolgreichen GF-Modelle als chronische Modelle vom Jugend- bis zum frühen Erwachsenenalter aufrechterhalten werden, aber die Überlebensrate ist in der Praxis viel niedriger. Schließlich können die Sterilitätsrate, die Überlebensrate, der Entwicklungsindex, das Verhalten, die histopathologische Analyse und das Transkriptionsprofil von GF- und CR-Fischmodellen gemessen werden, um den Einfluss der Mikrobiota und der Wirkstoffscreening-Felder zu untersuchen. In dieser Studie wurden die wichtigsten Entwicklungsindizes verglichen (Ergänzende Abbildung 1), und die Schlupfrate von GF-Fischen war 45,7 % niedriger als von CR-Fischen, mit 60 % bei 72 hpf. Die Herzfrequenzen von GF-Larven bei 7 dpf waren mit 18,2 Schlägen/10 s signifikant niedriger als bei CR-Fischen mit 22,6 Schlägen/10 s, aber es gab keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen bei 14 dpf mit Raten von 23,5-23,8 Schlägen/10 s. Die Überlebensrate von GF-Fischen bei 7 dpf war mit 86,7 % die gleiche wie bei CR-Fischen, sank jedoch auf 60 % bei 14 dpf im Vergleich zu 80 % bei CR-Fischen. Die Überlebensraten sowohl von GF- als auch von CR-Fischen sanken jedoch auf 25%-10% nach der Periode mit offenem Maul, in der sie Fressfähigkeiten oder -gewohnheiten erwarben. Das Versagen, den sterilen Status der Fische aufrechtzuerhalten, war einer der Gründe für die niedrigere Überlebensrate. Daher sind die Fütterung und die Nährstofferhaltung vom Jugend- bis zum frühen Erwachsenenalter kritische Herausforderungen in der Fischzucht.

Ein weiterer Schlüsselfaktor, der das Wachstum und die Entwicklung von Fischen beeinflusst, ist die Fütterung. In dieser Studie untersuchen wir mehrere Methoden, um GF Artemia als Lebendfutter für langfristige GF-Zebrafischlarven an Jungtiere und Erwachsene zu gewinnen (Prozess in Abbildung 2 gezeigt). Aufgrund der täglichen Verwendung von Futter für GF Fische sollte das optimierte Protokoll für GF Artemia in der Praxis einfach, zeitsparend und wirtschaftlich sein. Nach dem Vergleich der aktiven Bewegung und des Todes/der Unbeweglichkeit von Nauplien , die mit dem Mikroskop beobachtet wurden, der Eigenschaften von Nauplien, nicht geschlüpften Eiern und der Schale, wird die Methode perfektioniert. Nach täglicher Inkubation wurden die aus Flaschen gewonnenen Indizes von frischem GF Artemia , einschließlich der Schlupf-, Überlebens- und Deformitätsrate sowie der Länge und des Gewichts der Nauplien, unter dem Mikroskop beobachtet und gemessen (Abbildung 3). Nach der Behandlung war die Schlupfrate der Artemia-Zysten mit durchschnittlich 88,15 % hoch, die Überlebensrate der schwimmenden Nauplien betrug 77,83 % und die Missbildungsrate 1,87 %. Die Körperlänge der Nauplien betrug 546,70 μm und der Körpergewichtsindex 3,80 mg/100, die für den Fang und die Fütterung von Fischen ab der einmonatigen Periode der Larven bis hin zu den juvenilen und adulten Stadien geeignet sind.

Der Nachweis von GF Fischen und GF Artemia ist auch für die Modellpflege wichtig. Entsprechend der Probenentnahme und mehrerer Testmethoden können die Ergebnisse den Erfolg von behandelten Zebrafischembryonen und Artemia-Zysten in der Kulturplatte und im flüssigen Medium liefern (Abbildung 4). Die verschiedenen Proben, die täglich entnommen werden, sollten in allen Testmethoden als steril nachgewiesen werden, die dann zum Zeitpunkt der Entnahme auf die GF Modelle hinweisen können. Die GF Artemia sollte vor der Fütterung von GF Fischen nachgewiesen werden, oder die Ergebnisse der Platte und des mittleren Inkubators sollten sich auf den sterilen Zustand frischer lebender Nauplien beziehen. Das heißt, GF Artemia wird aus Zysten auf TSA-Platten oder TSB- oder BHI-Flüssigmediumglas in Schüttelinkubation kultiviert, das zur gleichzeitigen Erzeugung von GF Artemia und zur sterilen Verifizierung verwendet werden könnte. Das GF Artemia-Protokoll kann eine begrenzte Anzahl von Larven für die Fütterung aufnehmen. Während des Fressprozesses zeigte sich, dass die GF Artemia im GZM schwamm und dann von den GF Fischlarven gefangen und verzehrt wurde.

Die Anwendungen von GF Fischmodellen umfassen verschiedene Bereiche der Biologie und Medizin und ermöglichen unter anderem die Untersuchung von mikrobiellen Funktionen, Wachstum und Entwicklung, Krankheitsmechanismen sowie das Screening von Probiotika oder Medikamenten46. In dieser Studie wurden beispielsweise zwei wichtige Darmbakterien, Aeromonas sp. und Vibrio sp., aus Zebrafischen isoliert. Die Koloniemerkmale und die Identifizierung wurden durchgeführt, und mehrere Stoffwechselfunktionen wurden in vitro mit kommerziell erhältlichen Kits gemessen (Abbildung 5). Diese Bakterien wurden isoliert und mit 16S-Sequenzierung identifiziert, und die Blastenergebnisse wurden in einem früheren Bericht vorgestellt42. Die identifizierten Bakterienstämme ermöglichen die wissenschaftliche Erforschung des Einflusses einzelner oder kombinierter Mikrobiota auf die Gesundheit des Wirts durch die Infektion der GF Fischmodelle. Die Transparenz von Fischlarven ermöglicht die Beobachtung von fluoreszenzmarkierten Bakterienzellen mit CM-Dil-Farbstoffen, was die Besiedlung und Verteilung im Darm von GF-Fischen aufzeigt (siehe Abbildung 6). Nach einer bakteriellen Infektion bei 5 dpf können GF-Zebrafischlarven mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet und kontinuierlich von 6 bis 14 dpf beobachtet werden, was Einblicke in mikrobielle Funktionen in Kombination mit Entwicklungsindizes, histopathologischen Veränderungen und molekularen Veränderungen gibt47.

Abbildung 1: Protokoll des GF-Zebrafisches von den Embryonen bis zu den Larven und Jungtieren. Zu den wichtigsten Schritten bei der Erzeugung von GF-Zebrafischen gehören: (1) Entnahme von Embryonen aus Wildtyp-Zebrafischen und Platzierung in AB-GZM. (2) Spülen Sie die Behandlung mit PVP-I- und NaClO-Mitteln, um vollständige Sterilität zu gewährleisten. (3) Kultivierung von GF Embryonen/Larven in 6-Well-Platten mit GZM, wobei das Medium täglich erneuert wird. (4) Regulierung der Kulturbedingungen für optimales Wachstum und Entwicklung. (5) Probenahme in verschiedenen Entwicklungsstadien, gefolgt von Sterilitätstests mit Platten- und Flüssigmediummethoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Protokoll der Zubereitung von GF Artemia als Lebendfutter für GF Fische. Zu den wichtigsten Schritten gehören: (1) Spülbehandlung von Artemia-Zysten für vollständige Sterilität. (2) Vorbereitung von GF-Zysten im Medium. (3) Inkubation in einer Salzlösung für 24 Stunden, um das Schlüpfen zu fördern. (4) Filtration von fehlgeschlagenen und leeren Eiern zum Auffangen aktiver Nauplien. (5) Waschen von gesammelten Nauplien , um Rückstände zu entfernen und so ein hochwertiges und schadstofffreies Lebendfutter zu gewährleisten. (6) Sterilitätstest der GF Artemia vor der Verfütterung an GF Fischlarven. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Indizes von GF Artemia-Zysten und - Nauplien , die 24 Stunden lang inkubiert wurden. (A) Unbehandelte Artemia-Zysten mit Verunreinigungsfilm (Maßstab: 500 μm). (B) Behandelte Artemia-Zysten mit einer leicht konvexen Oberfläche nach Wasseraufnahme und einem saubereren Aussehen (Maßstab: 500 μm). (C) Mikroskopische Untersuchung von frisch inkubierten lebenden GF Artemia-Nauplien (Maßstab: 2000 μm) und (D) Vergrößerung mit einem Maßstabsbalken von 1000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Steriler Nachweis von GF-Fischen in jedem Lebensstadium und GF Artemia. (A) Sterile Tests von CR- und GF-Fischproben mit TSB- und BHI-Flüssigmedium, TSA und Blutplatten unter aeroben und anaeroben Bedingungen. (B) Sterile Tests von unbehandelten Artemia-Zysten , GF-Artemia-Zysten und Nauplien unter Verwendung von TSB- und BHI-Flüssigmedium, TSA und Blutplatten unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Isolierung und Identifizierung von Darmbakterien im Zebrafisch. (A) Bakterienstämme, Eigenschaften von Kolonien, 16S-Sequenzierungskarten (Beispiele: Aeromonas sp. und Vibrio sp.). (B) Gattungs- und NCBI-Akzessionen. (C) Stoffwechselfunktionen von Bakterien, die aus dem Darm von Zebrafischen isoliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Infektion und Besiedlung von Darmbakterienstämmen im GF Zebrafisch. (A) Gewinnung isolierter und identifizierter Bakterienstämme für Infektionsexperimente. (B) Markierung von Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen und Infektion von GF-Zebrafischlarven bei 5 dpf. Vergrößerung: 1x. (C) Beobachtung der Verteilung und Besiedlung von Bakterien (Vibrio sp.) im Darmgewebe in vivo. Vergrößerung: 3x. (D) Zählung der KBE von Bakterien (Aeromonas sp. und Vibrio sp.) in jeder Fischlarve durch tägliche Probenahme. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Primer für den Bakteriennachweis.

Tabelle 2: Endkonzentration und Volumen der Komponenten pro Reaktion.

Tabelle 3: PCR-Programm zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens.

Ergänzende Abbildung 1: Die kritischen Entwicklungsindizes von GF- und CR-Zebrafischmodellen. (A) Die Schlupfrate von CR- und GF-Zebrafischen bei 72 hpf und (B) Herzschläge/10 s von CR- und GF-Fischen bei 7 dpf und 14 dpf. Die Überlebensraten (%) von CR- und GF-Fischen sanken von 7 Tagen auf 14 Tage mit 86 %, 60 %-80 % auf 10 %-25 % bei 30 dpf. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Das Protokoll von GF Artemia wurde von der China National Intellectual Property Administration als Patent erteilt, wodurch die eingeschränkte Verwendung der Methode nach Einholung der Erlaubnis der Autoren aufgehoben wird. Die Verfasser erklären, dass sie keine weiteren konkurrierenden oder finanziellen Interessen haben.