Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Gewinnung keimfreier (GF) Fischembryonen und deren Erhaltung von Larven bis zum Jugendstadium, einschließlich der Probenahme und des Nachweises ihres sterilen Status. Die Verwendung von GF-Modellen mit Infektionen ist wichtig, um die Rolle von Mikroben für die Gesundheit des Wirts zu verstehen.
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Methodenartikel
Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zebrafische dienen als wertvolle Modelle für die Erforschung von Wachstum, Immunität und Darmmikrobiota aufgrund ihrer genomischen Ähnlichkeiten mit Säugetieren, transparenten Embryonen, die sich in einer relativ sauberen Chorionumgebung entwickelt haben, und der extrem schnellen Entwicklung von Larven im Vergleich zu Nagetiermodellen. Keimfreie (GF) Zebrafische (Danio rerio) sind entscheidend für die Bewertung der Schadstofftoxizität und die Etablierung menschenähnlicher Krankheitsmodelle in Bezug auf mikrobielle Funktionen. Im Vergleich zu konventionell gezüchteten (CR) Modellen (Fische in gemeinsamer Haltung) ermöglichen GF-Zebrafische eine genauere Manipulation der Wirtsmikrobiota und helfen bei der Bestimmung des kausalen Zusammenhangs zwischen Mikroorganismen und Wirten. Folglich spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses dieser Beziehungen. GF-Zebrafischmodelle werden jedoch in der Regel in den frühen Lebensstadien (vom Embryo bis zur Larve) erstellt und erforscht, da die Immunfunktion und die Nährstoffaufnahme eingeschränkt sind. Diese Studie optimiert die Generierung, Erhaltung und Identifizierung von frühen GF-Zebrafischmodellen ohne Fütterung und mit langfristiger Fütterung mit GF-Futter (wie Artemia sp., Salinengarnelen). Während des gesamten Prozesses wurden täglich Probenahmen und Kulturen durchgeführt und durch mehrere Detektionen, einschließlich Platten und 16S rRNA-Sequenzierung, identifiziert. Die aseptische Rate, das Überleben und die Entwicklungsindizes von GF Zebrafischen wurden erfasst, um die Qualität und Quantität der generierten Modelle sicherzustellen. Wichtig ist, dass diese Studie Details zur bakteriellen Isolierung und zu Infektionstechniken für GF Fische liefert, die die effiziente Erstellung von GF Fischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium mit GF Futterunterstützung ermöglichen. Durch die Anwendung dieser Verfahren in der biomedizinischen Forschung können Wissenschaftler die Zusammenhänge zwischen den bakteriellen Funktionen des Darms und der Gesundheit des Wirts besser verstehen.
Einleitung
Die Mikrobiota (d. h. Archaeen, Bakterien, Eukarya und Viren) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und tragen zur Entwicklung verschiedener Krankheiten bei, indem sie physiologische und pathologische Prozesse durch symbiotische Wechselwirkungen innerhalb der Darmbarriere, der Epitheloberfläche und der Muzinfunktionen bei Individuen beeinflussen 1,2,3. Die Zusammensetzung der Mikrobiota in verschiedenen Lebensstadien, vom Säuglingsalter bis zur Jugend, dem Erwachsenenalter und dem Altern, sowie ihre Präs....
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Protokoll
Die Fischversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Use Committee von Chongqing und des Institutional Animal Care and Use Committee der Chongqing Medical University, China, sowie den vom State Bureau of Quality and Technical Supervision herausgegebenen Standards für Versuchstiere (Zulassungs-ID: GB14922-2001 bis GBT14927-2001) durchgeführt. Zebrafische (Danio rerio, Wildtyp, AB-Stamm) wurden vom Institut für Hydrobiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften bezogen und nach den zuvor beschriebenen Verfahren im Labor gehalten36.
1. Pflege adulter Zebrafische und ....
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Ergebnisse
Die GF-Zebrafischmodelle können effizient hergestellt werden, indem die reichlich vorhandenen Eier von Zebrafischpaaren verwendet werden, wobei das Protokoll auf der Grundlage früherer GF-Fischmodelle optimiert wurde35. Eine einzige 6-Well-Platte kann etwa 30-48 Embryonen/Larven kultivieren, was eine umfangreiche Datenerfassung und statistische Analyse ermöglicht. Nach der sterilen Behandlung werden die GF-Embryonen in einem sauberen Inkubator kultiviert, bis sie nach 48-72 Stunden zu den Larven s.......
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Diskussion
Kritische Schritte innerhalb der Protokolle von GF Fisch und GF Speisenzubereitung
Bei der Generierung von GF Fischmodellen waren mehrere kritische Schritte erforderlich, darunter die Aufbereitung des sterilen Materials, die Sterilisation der Embryonen, die tägliche Erneuerung des GZM, die Entnahme verschiedener Proben und die sterile Untersuchung jeder Probe mit mehreren Methoden. Unter diesen Schritten ist die Erstbehandlung von Embryonen grundlegend und entscheidend für den Erfolg der GF Modelle. D.......
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Offenlegungen
Das Protokoll von GF Artemia wurde von der China National Intellectual Property Administration als Patent erteilt, wodurch die eingeschränkte Verwendung der Methode nach Einholung der Erlaubnis der Autoren aufgehoben wird. Die Verfasser erklären, dass sie keine weiteren konkurrierenden oder finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken herzlich für die Unterstützung durch das Chongqing Medical University Talent Project (Nr. R4014 für DSP und R4020 für PPJ), die National Natural Science Foundation of China (NSFC, Nr. 32200386 für PPJ), das Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) und das Programm des China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research durch CAS.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin: Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin: CAS: 69-52-313. | 49,6 mL GZM, 50 & Mikro; L Amphotericin Stammlösung (250 & Mikro; g/mL), 25 &Mikro; L Kanamycin-Stammlösung (10 mg/ml) und 250 &; micro; L Ampicillin-Stammlösung (20 mg/ml). |
| 1,5 mL, 15 mL, 50 mL EP-Röhrchen | Biosharp | BS-15-M | Zum Sammeln von Proben und Halten von Mitteln |
| 2,4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Verdünnt mit 8%iger wässriger Natriumhypochloritlösung. |
| 6-Well-Platten, 24-, 48-Well-Platten | LABSELECT | 11112 | Zur Kultivierung von Fischen |
| Aeronomas | NCBI-Datenbank | Nr. MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobe TSA-Platten | trypton:Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp; Agar-Pulver: BioFroxx. | Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112; Agar-Pulver: 9002-18-0. | Die TSA-Platten wurden mit 400 ml Medium hergestellt, das 6 g Trypton, 2 g Sojapepton, 2 g NaCl und 6 g Agarpulver unter dem anaeroben System enthielt. |
| Anaerober Arbeitsplatz | GENE SCIENCE | E200G | Isolierung von Bakterien, sterile Tests |
| Analyse GraphPad | Prism 5 | v6.07 | Zur Analyse der Daten |
| API 20 E Kits | BioMerieux SA, Frankreich | Nr.1005915090 | Ref 20100 Kits zum Nachweis des bakteriellen |
| StoffwechselsArtemia (Salzgarnelen) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Artemia-Zysten der Marke Aquamaster und Artemieer aus Salinengarnelen | |
| Auto-Cycle-System für die Fischkultur | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Pflegen Sie den Fisch |
| Autoklav | Eifer Weg | G154DWS | Bereiten Sie die Materialien |
| vor BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI-Medium wurde hergestellt, wobei 100 mL Medium 3,7 g BHI-Pulver enthielt. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI Medium wurde unter dem anaeroben System hergestellt und in anaerobe Röhrchen unterteilt. |
| Biochemischer Inkubator | LongYue Co., Ltd | SPX | Für Fische und Platten |
| Biosicherheitswerkbank | Haier | HR40-IIA2 | Sterile Behandlung und Prüfung |
| Bleichmittel von 0,02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Arbeitslösung mit Natriumhypochlorit (NaClO)-Konzentration: Verdünnt mit 8%iger wässriger Natriumhypochloritlösung oder 166,6 μl 6%igem Natriumhypochlorit mit 500 mL destilliertem Wasser. |
| Blutplättchen | Schafsblut:Solarbio | Kat.-Nr. TX0030 | Steril defibriertes Schafsblut wurde TSA zugesetzt, um 5% der Blutplatten herzustellen. |
| Zellkulturflasche | Corning | 430639 | Zur Kultivierung von Fischen |
| CM-Dil Farbstoffe | Molekulare Sonden | Cat#C7000 | Um die Bakterien zu markieren |
| Schüttelinkubator mit konstanter Temperatur | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | |
| Bakterienkultur-Datenbank | NCBI | Bakterien- und Archaeen-Datenbank | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bakterien FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Einweg-Pasteur-Pipette | biosharp | bs-xh-03l | Wird verwendet, um Wasser zu wechseln und Eier zu übertragen |
| Einweg-Petrischale | biosharp | BS-90-D | Zur Kultivierung |
| von Fisch-DNA-Kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bakterielle genomische DNA-Extraktionskits |
| Elektrische Pipette | SCILOGEX | Levo me | Wasser wechseln |
| Exiguobacterium | NCBI Datenbank | Nr.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Meersalz:LANDEBAO Co., Ltd. | Bestehend | aus 1 l Wasser und 1,5 mL Meersalzlösung (40 g/l), autoklaviert. Der Gehalt an Meersalz in der GZM-Lösung betrug 60 mg/L. |
| Labor-Reinwassersystem | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Bereiten Sie die Wirkstoffe |
| vor Mikroskop | Nikon | SMZ18 | Mit Fluoreszenzlicht zur Beobachtung von Fischlarven |
| PCR-Kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA-Polymerase-Kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Wasserwechsel |
| Povidon-Jod (PVP-I) | Aladdin | Los#H1217005 | Wässrige Lösung Povidon-Jod 0,4 g/L reines Wasser. |
| Timing-Wandler | PinYi Co., Ltd | AL-06 | Zur Regulierung des Lichts |
| TSA-Platten | Trypton: Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp; Agar-Pulver: BioFroxx. | Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112; Agar-Pulver: 9002-18-0. | Die TSA-Platten wurden mit 400 mL Medium hergestellt, das 6 g Trypton, 2 g Sojapepton, 2 g NaCl und 6 g Agarpulver enthielt. |
| TSB Aerobic | Trypton:Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp; | Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112; | TSB-Medium wurde hergestellt, wobei 400 ml Medium 6 g Trypton, 2 g Sojapepton und 2 g NaCl enthielten. |
| TSB Anaerobes | Trypton:Oxoid ; Soja-Pepton: Solarbio ; NaCl:Biosharp; | Trypton:LP0042B; Soja-Pepton:Katze#S9500; NaCl:BS112; | Das TSB-Medium wurde aufbereitet und unter dem anaeroben System in die anaeroben Röhren aufgeteilt. |
| Ultra-saubere Werkbank | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile Behandlung und Prüfung |
| Ultrareines Durchflusssystem für Fischzucht | Unternehmen für marine biologische Ausrüstung | No Cat | Wasser für Fische produzieren |
| VibrioNCBI-Datenbank | Nr. MK178501 | 2019-JPP-ESN |
Referenzen
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118(2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbio....
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Nachdrucke und Genehmigungen
